一種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子gis2及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子GIS2及其應(yīng)用，煙草腺毛特異性啟動(dòng)子或其互補(bǔ)鏈具有如SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子在煙草腺毛中調(diào)控目的基因表達(dá)的應(yīng)用。本發(fā)明的GIS2基因啟動(dòng)子在煙草葉片的腺毛中特異性表達(dá)，克服組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的外源基因在受體植物中非特異、持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)，增加轉(zhuǎn)基因的效果，可利用本發(fā)明的啟動(dòng)子在煙草腺毛中表達(dá)目的基因，有助于研究腺毛形成和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制和腺毛密度的遺傳規(guī)律，基于腺毛與煙草香氣的密切關(guān)系，本發(fā)明還有助于研究控制煙草腺毛及香氣形成的機(jī)制，提高煙草葉片香氣品質(zhì)，具有重要的理論意義及潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子GIS2及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子GIS2及其 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 煙草已成為21世紀(jì)全球市場(chǎng)上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，它不僅是100多個(gè)國(guó)家煙 農(nóng)的收入來(lái)源，而且整個(gè)煙草行業(yè)涉及到不同生產(chǎn)部門(mén)和批發(fā)零售環(huán)節(jié)，已成為許多國(guó)家 的重要經(jīng)濟(jì)力量；隨著煙草業(yè)的發(fā)展，許多國(guó)家的地方及當(dāng)?shù)卣亩愂沼辛舜蠓忍岣摺?br> [0003] 煙草是高效益作物，我國(guó)煙草的種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位。在所有煙葉類 型中，烤煙種植最為廣泛。我國(guó)是全球生產(chǎn)烤煙最多的國(guó)家，我國(guó)烤煙種植面積和總產(chǎn)量都 居世界首位，其烤煙產(chǎn)量約占全球烤煙產(chǎn)量的50 %左右，發(fā)展優(yōu)質(zhì)煙葉不管是對(duì)煙農(nóng)還是 卷煙工業(yè)都是十分重要的。煙草又是高稅利商品，農(nóng)業(yè)稅利30 %左右，工業(yè)稅利60 %以上， 1987-2001年，煙草行業(yè)實(shí)現(xiàn)的稅利合計(jì)連續(xù)14年高居國(guó)民經(jīng)濟(jì)各行業(yè)之首，為國(guó)家建設(shè) 做出了巨大的貢獻(xiàn)。因此，研究和開(kāi)發(fā)綜合性狀良好的煙草品種，提高煙草的生產(chǎn)水平對(duì)于 增加國(guó)家和地方財(cái)政收入，解決"三農(nóng)"問(wèn)題和新農(nóng)村建設(shè)具有十分重要的意義。
[0004] 煙草育種重點(diǎn)考慮的問(wèn)題是煙葉香味和煙葉安全性等，提高香氣品質(zhì)是國(guó)內(nèi)外煙 草育種的核心之一。煙葉香氣不足是影響煙葉質(zhì)量的一個(gè)主要因素，尤其目前低煙堿、低焦 油的煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向，使得煙葉香味不足的問(wèn)題更為突出。煙草腺毛是煙葉表皮系統(tǒng)的 重要組成部分，煙葉腺毛膠狀分泌物與煙葉香氣物質(zhì)產(chǎn)生密切相關(guān)，而腺毛密度和類型直 接影響著腺毛分泌物的質(zhì)和量，而分泌物的量又直接影響葉片的香氣品質(zhì)，腺毛密度越大， 多細(xì)胞頭部的腺毛所占比例越大，葉片香氣品質(zhì)越好（煙草葉片腺毛及其分泌物研究進(jìn) 展.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009, 37(8) :61?64)。因此，煙葉腺毛的研究對(duì)煙草新品種的選育和 優(yōu)質(zhì)煙草栽培技術(shù)的實(shí)施，以及提高煙草香氣質(zhì)和香氣量的研究都具有重要的指導(dǎo)意義。 目前國(guó)內(nèi)外雖然已在煙草腺毛方面進(jìn)行了大量研究，但對(duì)腺毛形成和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制和腺 毛密度的遺傳規(guī)律，特別是在腺毛與煙草香氣形成之間關(guān)系的研究方面還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，因此， 從分子水平上研究控制煙草腺毛及香氣形成的機(jī)制，不僅具有重要的理論意義，同時(shí)也具 有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 通過(guò)基因工程的方法在煙草中研究控制腺毛形成、發(fā)育及香氣相關(guān)等的基因，是 有效且最常用的手段，通常涉及到外源基因的表達(dá)，而外源基因表達(dá)的則由啟動(dòng)子調(diào)控，啟 動(dòng)子通常分為組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子能夠在大 部分或所有植物組織中高效非特異的啟動(dòng)外源基因表達(dá)，但大量的異源蛋白會(huì)使植物體內(nèi) 原有的代謝平衡紊亂，使植物的正常生長(zhǎng)受到阻礙。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種新型的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠在煙草葉片的腺 毛中特異性表達(dá)。
[0007] -種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子，所述煙草腺毛特異性啟動(dòng)子或其互補(bǔ)鏈具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種包含所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒。
[0009] 所述重組質(zhì)粒的原始質(zhì)粒載體可以為PHGWFS7。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種包含所述重組質(zhì)粒的重組轉(zhuǎn)化子。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子在煙草腺毛中調(diào)控目的基因表達(dá) 的應(yīng)用。
[0012] 所述的應(yīng)用具體包括：利用所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子構(gòu)建植物表達(dá)載體，然 后將目的基因連入所述植物表達(dá)載體中煙草腺毛特異性啟動(dòng)子的下游，得到重組植物表達(dá) 載體，再將所述的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草。
[0013] 植物表達(dá)載體、重組植物表達(dá)載體的構(gòu)建可采用常規(guī)方法，如可采用gateway系 統(tǒng)（Invitrogen公司）將啟動(dòng)子、目的基因連入相應(yīng)的載體中。其中，所述的植物表達(dá)載體 的原始載體可以為PHGWFS7,所述的目的基因并不僅限于GUS基因，所述的目的基因可以根 據(jù)具體需要進(jìn)行選擇，轉(zhuǎn)化煙草時(shí)，可采用常規(guī)手段，如可采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法將重 組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草中，農(nóng)桿菌可以為農(nóng)桿菌GV3101，EHA105等。在轉(zhuǎn)基因煙草中，本 發(fā)明的啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)目的基因在煙草葉片的腺毛中進(jìn)行表達(dá)。當(dāng)然，所述的煙草可以為珊 西煙，但并不僅限于珊西煙。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0015] 本發(fā)明的啟動(dòng)子在煙草葉片的腺毛中特異性表達(dá)，克服組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的外源 基因在受體植物中非特異、持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)，增加轉(zhuǎn)基因的效果，可利用本發(fā) 明的啟動(dòng)子在煙草腺毛中表達(dá)目的基因，有助于研究腺毛形成和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制和腺毛密 度的遺傳規(guī)律，基于腺毛與煙草香氣的密切關(guān)系，本發(fā)明還有助于研究控制煙草腺毛及香 氣形成的機(jī)制，提高煙草葉片香氣品質(zhì)，具有重要的理論意義及潛在的應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片⑶S染色結(jié)果；
[0017] 其中，A、B為轉(zhuǎn)基因煙草，C、D為野生型煙草。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。
[0019] 實(shí)施例1GIS2基因啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因載體構(gòu)建和煙草遺傳轉(zhuǎn)化
[0020] (1)取擬南芥葉片，利用CTAB法提取基因組DNA.
[0021] (2)根據(jù)Genbank上的擬南芥GIS2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列設(shè)計(jì)特異引物，分 另IJ在引物5'端加上Sal I和Not I限制性酶切位點(diǎn)，序列如下：
[0022] 引物 1 :5 ' -CGGTCGACTCTCAAGTTGGCTTCGTGTG-3 ' ;
[0023] 引物 2 :5 ' -AAGCGGCCGCAGTGGTGGTTATGACTCTGG-3 '。
[0024] (3)以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.
[0025] 采用高保真酶 PrimeSTAR? HS DNA Polymerase (TaKaRa Code :DR010A)體系：
[0026] 5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 10 μ 1,
[0027] dNTP Mixture (各 2. 5mM) 4 μ 1，
[0028] 引物 1(10 μ Μ) 1 μ 1，
[0029] 引物 2 (10 μ Μ) 1 μ 1，
[0030] 模板 DNAlyl，
[0031] PrimeSTAR? HS DNA PolymeraseO. 5 μ 1，
[0032] 滅菌蒸餾水加至總體積50 μ 1。
[0033] PCR循環(huán)條件為：98°C預(yù)變性5分鐘，98°C變性10秒，55°C退火15秒，72°C延伸2 分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸10分鐘，結(jié)束反應(yīng)。
[0034] (4)將PCR產(chǎn)物回收后通過(guò)酶切連接到Gateway克隆系統(tǒng)（本申請(qǐng)采用 Invitrogen公司的Gateway系統(tǒng)）入門(mén)載體pENTRlA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，測(cè)序并分析， GIS2基因啟動(dòng)子序列如SEQ ID Ν0. 3所示。
[0035] (5)將測(cè)序正確的含GIS2基因啟動(dòng)子的pENTRlA質(zhì)粒與啟動(dòng)子分析載體pHGWFS7 進(jìn)行LR交換反應(yīng)。
[0036] 使用 Gateway LR Clonase TM Enzyme Mix (Invitrogen 公司，Cat. No. 11791-019)， 體系如下：Entry clone (入門(mén)載體）50_150ng，Destination vector (目的載體）150ng， 5 XLR Clonase Reaction Buff er2 μ 1，補(bǔ)充 ddH20 至 8μ1，加入 2μ1 LR Clonase enzyme mix,短暫潤(rùn)旋兩次混勻，輕微離心，于25 °C水浴8h，然后加入1 μ 1 Proteinase K solution (蛋白酶K溶液）混勻，37°C放置10分鐘結(jié)束反應(yīng)。
[0037] 取5 μ 1反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn) 行雙酶切驗(yàn)證。
[0038] (6)從-80°C冰箱中取出ΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞，利用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌ΕΗΑ105。
[0039] 感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍，取2 μ 1左右的目的質(zhì)粒加到感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后置 于冰上30min，再將離心管內(nèi)的所有混合物加到預(yù)冷的電擊杯內(nèi)，冰上放置。打開(kāi)伯樂(lè)電轉(zhuǎn) 儀，程序調(diào)至Agr，吸取lml的LB液體營(yíng)養(yǎng)基，將電擊杯凸點(diǎn)朝內(nèi)推入電轉(zhuǎn)儀，按一下plus 鍵，聽(tīng)到蜂鳴聲，迅速拿出電擊杯，并向電擊杯杯加入lml的LB液體營(yíng)養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移 至1. 5ml的離心管內(nèi)，放在eppendorf混合儀內(nèi)28°C，700rpm搖2. 5h以上，涂布于抗性YEP 平板上（Rif (利福平）50mg/L，Spec(鹽酸大觀霉素）100mg/L)，28°C倒置培養(yǎng)2個(gè)晚上以 至長(zhǎng)出單菌落。
[0040] (7)挑取長(zhǎng)出的農(nóng)桿菌單克隆，到含有相應(yīng)抗生素的5mL YEP液體培養(yǎng)基中（相 應(yīng)抗生素為Rif50mg/L，specl00mg/L)，28°C 150rpm振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。將搖的菌按體積比 1:10加入YEP液體培養(yǎng)基（含相應(yīng)抗生素）28°C，培養(yǎng)至0D600>1。
[0041] (8)將搖好的菌做煙草葉片浸染：
[0042] 1) MS液體培養(yǎng)基（PH7. 0)將菌液稀釋10倍（2mL菌液+18mL MS溶液）；
[0043] 2)利用無(wú)菌的煙草（品種為珊西煙）組培苗。無(wú)菌的煙草葉片切去邊緣和主要葉 脈，切成〇. 5 X 0. 5cm2大小；
[0044] 3)切好的外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡5min ;
[0045] 4)用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面菌液，轉(zhuǎn)入上鋪一層濾紙的MS培養(yǎng)基，25°C暗培養(yǎng) 3天；
[0046] 5)三天后，將材料轉(zhuǎn)到適當(dāng)選擇后的分化培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基+2mg/ L6-BA+0. 5mg/LNAA)中進(jìn)行光照培養(yǎng)，溫度25°C ±2°C，光周期14hr光照/8hr光照；
[0047] 6)待生長(zhǎng)至2-3cm高時(shí)，切下小芽轉(zhuǎn)入適當(dāng)篩選的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根（基本 MS hpt (潮霉素）35mg/L+cef (頭孢霉素）250mg/L);
[0048] 7)根長(zhǎng)至10cm以上（約四周），且具有一定數(shù)量即可去掉封口膜，在組培室中鍛 煉2-3天，然后移栽到花盆中，在室溫生長(zhǎng)2-3周，最后移栽至田間種植。當(dāng)移到土里的煙 草苗生長(zhǎng)約20d后，取煙草葉片提取DNA，通過(guò)PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。
[0049] 實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因煙草的性狀觀察
[0050] 煙草的表皮毛按有無(wú)分泌腺分成兩大類，一是能產(chǎn)生分泌物的腺毛，二是不具有 分泌能力的保護(hù)毛，其中腺毛又根據(jù)形態(tài)分為長(zhǎng)柄腺毛和短柄腺毛。
[0051] 將實(shí)施例1獲得的轉(zhuǎn)基因煙草，進(jìn)行組織化學(xué)染色（GUS染色）分析，結(jié)果如圖1 所示，將60天齡期的煙草葉片進(jìn)行GUS染色后，本發(fā)明的啟動(dòng)子（A，B)在煙草葉片的腺毛 中特異表達(dá)（腺毛表現(xiàn)為藍(lán)色），而對(duì)照（C，D)無(wú)顯色反應(yīng)，表明本發(fā)明的啟動(dòng)子在煙草腺 毛中有活性，是煙草腺毛特異表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0001] _序列 表_ SHQUHNCH LISHNG <110>浙江大學(xué) <120> -種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子GIS2及其應(yīng)用 <130> <160> 3 < 170> Paicniln version 3.3 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213>人工序列 <400〉 1 cgglcgactc icaagltggc llcglgig <210> 2 <211> 30 <212> DMA <213>人工序列 <400> 2 aagcggccgc agtggiggil algaclclgg 30 <210> 3 <211> 1499 <212> DNA <213> 擬南齊（Arabidopsis thaliana ) <400> 3 tctcaagttg gctlcgtgtg iggcacllcc aatlacalta gaggacgtgc aalgltgtlt 60 glUgaaata aagLcLgcaal Lcgalcgtgg MgciaULLgaa iLLLUaUag alccLcaall 120 [0002] tttgaaatat ttgttcgttt tcttttgttt gaaclttgtc aactcaaata attagaagaa 180 caaaagacta ttaatgatta ttttagctat tgagaaaatl tttgtttcat aaaltttatg 240 tgacaaggga aaaaatattt tatUctcit atgatgaatl aaaaggcigl gtattaacta 300 ctgcttttgt ttctaaagga tlattgaaga altUagggl atattagagt tgcttaagct 360 gltcltcttc tgllaaagca actgcalgcg aatcgalcgl gtgagcaacg Ulggltcac 420 gaccalgttc Utcctcalg ggcgaccact ttcatgatcc altataalaa aacaaalatg 480 acgaagacaa attaacataa tatatcgtca ctgttgeagt ttgttatgga gagtaacatt 540 aalgaalctg llUlaacaa galcglacll cgagacgaaa agcaaaalcc aaacacaaaa 600 aaaagtaalc gcgcagaiga ggaaacaaag atgtgacacc acgcagttta ccatctaacl 660 acattaattt gagggatcca cctgaaaact tgtactalat gtlaaltcal atgcatggtt 720 gUtlattlt acttlUggt cttgtggtta glattaccta cicaaaaatg aggatttgat 780 tagatgaggc aacatacaat Ugaltaacl actcaaaaac atggttgttc taaaactgac 840 cataaggaag aaaaaaatgt atalatalca cgacagagat Itgaagtttt ggaclaaagc 900 ctcacacata gccatcaglg Uatataclg talataagcl gtcactalla aacatagaaa 960 caggaaccll aaagalacaa clalalacla tcltgacalc aaatacgigt aclaaaaccl 1020 Utcalaaaa gatgcallga calgacatat caalgalggt agllcgacgg gtagaaalca. 1080 tcaaggcaaa Iccgcatttg aattgaatgc tcactagatt atciacaagg agacaaacca 1140 attagctcac tagUtagtt caatlcttgt ctggctaatc ctatctacat atacaagact 1200 ataataiagc aaaaitagaa agaaiatagc lagaaacggg laaataiata ciacliacca 12()0 aaaactaaal gtgcctgaat aggtclalta tagltaalag ttattcagtg taaaltatct 1320 aigtacatac cccatcggga atlaaalgca agaaacalag aggagaccgt acltcgaagt 1380 tgcaaallta acaclaaglt gaagaalcla gaaalagaaa gccaaaatcl tccttlactl 1440 caaclclaca atUcaalcl tttclctgla cllagccalc cagagtcata accaccacl 1499
【權(quán)利要求】
1. 一種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子，其特征在于，所述煙草腺毛特異性啟動(dòng)子或其互補(bǔ)鏈 具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
2. -種包含如權(quán)利要求1所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒。
3. 如權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，原始質(zhì)粒載體為pHGWFS7。
4. 一種包含如權(quán)利要求2或3所述的重組質(zhì)粒的重組轉(zhuǎn)化子。
5. -種如權(quán)利要求1所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子在煙草腺毛中調(diào)控目的基因表達(dá) 的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用包括：利用所述的煙草腺毛特異 性啟動(dòng)子構(gòu)建植物表達(dá)載體，然后將目的基因連入所述植物表達(dá)載體中煙草腺毛特異性啟 動(dòng)子的下游，得到重組植物表達(dá)載體，再將所述的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物表達(dá)載體的原始載體為 PHGWFS7。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104059915SQ201410255385
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】甘銀波, 顏安, 劉一華, 孟小芳, 安麗君, 周忠靜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)