一種小球藻抗氧化肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小球藻抗氧化肽的制備方法，以小球藻為原料，利用稀堿溶脹結(jié)合超聲波工藝，對小球藻進(jìn)行破壁處理獲得可溶性蛋白質(zhì)，小球藻蛋白用生物酶法進(jìn)行水解，獲得了抗氧化效果明顯的小球藻抗氧化肽。本發(fā)明還公開了超低溫處理、高壓處理結(jié)合稀堿溶脹與超聲波的處理工藝能提高水溶性蛋白質(zhì)的得率，并且能進(jìn)一步提高水解產(chǎn)物的抗氧化能力。本發(fā)明所得產(chǎn)品純度高，抗氧化活性強(qiáng)。
【專利說明】一種小球藻抗氧化肽的制備方法 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種小球藻抗氧化肽的制備方法。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 自由基（Free radicals)是人體生命活動(dòng)中各種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，由于 其單電子的結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出極其活潑的不穩(wěn)定性，在生物體內(nèi)主要包括超氧陰離子自由基 (CV ·)、過氧化氫（H202)、輕基自由基（· 0H)、氧有機(jī)自由基（R0 ·)、有機(jī)過氧基（R00 ·)、 活性氧（R0S)、脂自由基（L·)和脂過氧基（L00·)等。具有活性的自由基對一般的組織和 生物膜都可產(chǎn)生不同程度的危害，因此自由基在生理、病理上的作用機(jī)理受到了廣泛的關(guān) 注，越來越多的學(xué)者投入相關(guān)的研究中。
[0003] 存在在人體內(nèi)的氧自由基主要有兩個(gè)方面的來源：外源性和內(nèi)源性。"外源性自由 基"是由紫外線或環(huán)境污染等外來因素引發(fā)；"內(nèi)源性自基"一般是在生物新陳代謝的過程 中，由人體內(nèi)生化反應(yīng)所產(chǎn)生。在機(jī)體正常代謝活動(dòng)中，機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)能將自由基的產(chǎn) 生和清除維持在平衡狀態(tài)。但外界的逆境環(huán)境或機(jī)體的衰老導(dǎo)致的抗氧化系統(tǒng)功能的下降 會引發(fā)自由基的過量積累，過量的自由基會給機(jī)體造成不可逆轉(zhuǎn)的氧化損傷，造成機(jī)體在 分子水平、細(xì)胞水平及組織器官水平的各種損傷，加速機(jī)體的衰老，形成惡性循環(huán)，引發(fā)包 括心臟病、老年癡呆癥、癌癥、糖尿病、帕金森病、阿爾茨海默病和動(dòng)脈粥樣硬化在內(nèi)的多種 疾病。
[0004] 近年來，隨著海洋資源的不斷開發(fā)，海洋生物資源也大量地被列入研究行列中， 海洋資源成為了新能源開發(fā)不可或缺的一部分。人們在對海洋生物的研究中，不斷地從海 洋生物中發(fā)現(xiàn)一些具有抗氧化活性的化合物，多糖、蛋白質(zhì)、多肽乃至氨基酸都出現(xiàn)不同程 度的抗氧化活性。海洋生物抗氧化物質(zhì)可通過各種途徑清除內(nèi)源性和外源性自由基，具有 抗氧化作用強(qiáng)、種類多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、副作用低等特點(diǎn)。從海洋生物中尋找新的天然抗氧化活 性物質(zhì)、新的抗衰老藥物已成為海洋藥物研究的重要目標(biāo)之一。
[0005] 地球上有3萬多種不同的微藻，分布在淡水和海洋里，在各種土壤（包括酷暑和寒 冷的荒蕪環(huán)境）里也都有微藻存在。人類最初對微藻的利用是簡單的動(dòng)物飼料，后來開始 出現(xiàn)部分微藻食品或者保健品，但是這些產(chǎn)品對微藻這種天然高效能源的利用率還有待提 高。近幾十年來，人們逐漸注重微藻生物活性物質(zhì)的研究和開發(fā)。微藻所含有的活性成分 具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在醫(yī)藥、保健品、飼料、化工和環(huán)保等方面有廣泛的應(yīng)用，微藻中含有大 量蛋白質(zhì)，優(yōu)質(zhì)的人工微藻蛋白質(zhì)含量普遍可以達(dá)到50%以上。微藻蛋白質(zhì)提取物具有一 定的抗氧化性，這些提取物在一定條件下水解后的產(chǎn)物具有更高效的抗氧化特性。從海洋 藻類中提取天然抗氧化藥物的研究有待進(jìn)行。
[0006] 來源于天然蛋白質(zhì)的水解抗氧化肽近年來逐漸成為研究熱點(diǎn)。Suetsuna等從酪 蛋白的胃蛋白酶酶解物中發(fā)現(xiàn)了具有自由基清除活性的肽。Pefia-Ramos等在文章中指 出，WIP酶解物在分子量小于6kD的時(shí)候具有較明顯的抗氧化活性。Herndindez-Ledesma 等在做β_乳球蛋白和α-乳清蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化性的過程中，對商業(yè)蛋白酶（胃 蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和Corlose PP)進(jìn)行了詳細(xì)的對比，在 結(jié)論中表示，Corlose PP蛋白酶的水解產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性，其抗氧化組分分 子量小于3kD。Zeng WeiCai等使用凝膠過濾層系、高效液相色譜等分離手段在牛毛中 提取了一種大小為18. 7kDa的多肽，具有顯著的抗氧化能力，能有效防止油脂的氧化。 Seung-Jae Lee等利用反相高效液相色譜在鴨子皮膚中提取了一種大小為941Da的抗氧 化肽，具有保護(hù)肝臟免受酒精損害的活性，該多肽在細(xì)胞環(huán)境中能夠參與細(xì)胞凋亡的相關(guān) 途徑的調(diào)節(jié)。Zhang Yufeng[28]等在羅非魚魚皮中提取出兩種抗氧化肽，氨基酸序列分別 為 Glu_Gly_Leu(317Da)和 Tyr-Gly-Asp-Glu-Tyr(645Da)，并指出 multifect neutral 和 properaseE兩種酶可以作為高抗氧化性肽制備用酶。
[0007] 自然界中微藻有3萬多種，但目前被人類利用開發(fā)的只有十余種。小球藻 (Chlorella pyrenoidosa FACHB5)是一類普生性單細(xì)胞藻類。小球藻具有生態(tài)分布廣、可 快速生長和繁殖、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是地球上動(dòng)植物中唯一能在20h增長4倍的生物，具有 很高的應(yīng)用價(jià)值。以小球藻酶水解抑菌肽作為天然防腐劑用于食品中來達(dá)到抑菌的目的， 不但在食品加工業(yè)將有廣闊的應(yīng)用前景，并且在環(huán)境保護(hù)等方面做出了一定貢獻(xiàn)。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的是提供一種以小球藻為原料制備抗氧化肽的方法。
[0009] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0010] 一種小球藻抗氧化肽的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0011] (1)小球藻干粉加入蒸餾水混勻，所述蒸餾水的體積用量以小球藻干粉質(zhì)量計(jì)為 20mL/g，4°C下攪拌1?3h，得到小球藻混合液，在不斷攪拌下向小球藻混合液中加入NaOH， 使NaOH的質(zhì)量終濃度為1?4% (優(yōu)選1% )，得到堿性混合液，然后將堿性混合液在4°C 下超聲破壁處理1?2h，調(diào)pH值為7. 0 (通常加稀鹽酸調(diào)pH值），離心分離，取上清液，力口 入體積為上清液體積4倍的體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，攪拌1?10分鐘后，靜置5?6小時(shí)，再 次離心，棄去上清液，取沉淀用蒸餾水清洗，然后用少量蒸餾水溶解，濃縮、冷凍干燥制得小 球藻蛋白；
[0012] ⑵小球藻蛋白加〇· 5mol/L的PBS緩沖液配成6mg/mL濃度的底物溶液，按酶與底 物的質(zhì)量比（[E]/[S]) = 1:25分別加入復(fù)合蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶或堿性 蛋白酶，在各種酶的最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH條件下，進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)0. 5?5h，然后將 酶解液升溫至90?95°C反應(yīng)15?30min，結(jié)束酶解反應(yīng)，所得反應(yīng)液濃縮至原體積的1/4， 冷凍干燥，制得棕黃色的小球藻抗氧化肽。
[0013] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述步驟（1)中，所述離心分離優(yōu)選在2000?4000rpm下離心 10?20分鐘。
[0014] 所述步驟（1)中，所述超聲破壁處理一般在20?30KHz的超聲條件下進(jìn)行。
[0015] 所述步驟（2)中，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的反應(yīng)條件為pH值6.0,反應(yīng)溫度50°C;堿性蛋 白酶的反應(yīng)條件為pH值8. 0,反應(yīng)溫度55°C ;復(fù)合蛋白酶的反應(yīng)條件為pH值6. 0,反應(yīng)溫 度50°C ;中性蛋白酶的反應(yīng)條件為pH值6.0,反應(yīng)溫度45°C。所述反應(yīng)條件中pH值可通 過配制相應(yīng)pH值的PBS緩沖液來進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0016] 所述步驟（2)中，優(yōu)選加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)條件為pH值6.0， 反應(yīng)溫度50°C，酶解反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選5小時(shí)。
[0017] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述步驟（1)中，優(yōu)選在堿性提取前經(jīng)超低溫或高壓均質(zhì)處理，具 體的，所述步驟（1)優(yōu)選按以下之一的步驟操作：
[0018] (Ι-a)小球藻干粉加入蒸餾水混勻，所述蒸餾水的體積用量以小球藻干粉質(zhì)量計(jì) 為20mL/g，4°C下攪拌1?3h，得到小球藻混合液，小球藻混合液在-70°C下冷凍12h，再于 30°C下解凍至4°C，在不斷攪拌下向解凍后的小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的質(zhì)量終 濃度為1?4% (優(yōu)選1 % )，得到堿性混合液，然后將堿性混合液在4°C下超聲破壁處理 1?2h，調(diào)pH值為7. 0 (通常加稀鹽酸調(diào)pH值），離心分離，取上清液，加入體積為上清液體 積4倍的體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，攪拌1?10分鐘后，靜置5?6小時(shí)，再次離心，棄去上清 液，取沉淀用蒸餾水清洗，然后用少量蒸餾水溶解，濃縮、冷凍干燥制得小球藻蛋白；
[0019] α-b)小球藻干粉加入蒸餾水混勻，所述蒸餾水的體積用量以小球藻干粉質(zhì)量計(jì) 為20mL/g，4°C下攪拌1?3h，得到小球藻混合液，小球藻混合液加入高壓均質(zhì)機(jī)中，調(diào)節(jié)壓 力至lOOMPa，處理15?20次（每次處理時(shí)間0· 1?3秒），然后在4°C、不斷攪拌下向高壓 均質(zhì)后的小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的質(zhì)量終濃度為1?4% (優(yōu)選1 % )，得到堿 性混合液，然后將堿性混合液在4°C下超聲破壁處理1?2h，調(diào)pH值為7. 0 (通常加稀鹽酸 調(diào)pH值），離心分離，取上清液，加入體積為上清液體積4倍的體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，攪拌 1?10分鐘后，靜置5?6小時(shí)，再次離心，棄去上清液，取沉淀用蒸餾水清洗，然后用少量 蒸餾水溶解，濃縮、冷凍干燥制得小球藻蛋白。
[0020] 本發(fā)明所用的復(fù)合風(fēng)味蛋白酶為商品化酶，可直接從市場上獲得。本發(fā)明復(fù) 合風(fēng)味蛋白酶購自無錫聯(lián)合恒洲化工有限公司，最佳反應(yīng)條件為pH6.0,50°C，標(biāo)稱活力 500LAPU/g。
[0021] 本發(fā)明以小球藻為原料，利用稀堿溶脹結(jié)合超聲波的處理工藝，對小球藻進(jìn)行破 壁處理獲得可溶性蛋白質(zhì)，進(jìn)而用生物酶法對蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，獲得了抗氧化效果明顯的 活性肽。同時(shí)對比了超低溫處理、高壓處理結(jié)合稀堿溶脹與超聲波的處理工藝，考察后期的 水解產(chǎn)物的抗氧化效果，發(fā)現(xiàn)超低溫處理以及高壓處理能提高水溶性蛋白質(zhì)的得率，并且 能進(jìn)一步提高水解產(chǎn)物的抗氧化能力。由于小球藻具有細(xì)胞壁異常堅(jiān)固，壁內(nèi)蛋白含量高 的特點(diǎn)，發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)在于同時(shí)控制前處理工藝和酶解工藝條件，可顯著改善小球藻蛋 白酶解后的活性肽的抗氧化能力，獲得抗氧化效果好的活性肽。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0023] (1)針對小球藻細(xì)胞壁異常堅(jiān)固的特點(diǎn)，首先通過一種比較溫和的破壁方式，可以 避免高溫對原料所造成的營養(yǎng)損失等不良影響，也是使細(xì)胞破裂較為徹底的方法，即在稀 堿條件下利用超聲波產(chǎn)生的空化作用、機(jī)械作用加速細(xì)胞壁的破碎，促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出。 如果結(jié)合在-70°C冷凍處理、再在室溫緩慢融化的超低溫冷凍的方法，可進(jìn)一步使小球藻異 常堅(jiān)固的細(xì)胞壁變得松脆，提高蛋白質(zhì)的溶出效率，其蛋白質(zhì)含量可達(dá)10%以上，比傳統(tǒng)的 熱水浸提得到的蛋白質(zhì)提高了 6. 03倍，比稀堿結(jié)合超聲浸提得到的蛋白質(zhì)提高了 1. 37倍， 比單獨(dú)稀堿浸提得到的蛋白質(zhì)提高了 1.79倍。另外，將高壓均質(zhì)處理與稀堿結(jié)合超聲浸提 的方法結(jié)合，也可以有效提高蛋白質(zhì)的溶出效率，蛋白質(zhì)含量比稀堿結(jié)合超聲浸提提高了 1.54倍。整個(gè)工藝過程簡單方便，可使小球藻有效破壁，具有能耗低、效率高、不破壞有效成 分等優(yōu)點(diǎn)。
[0024] (2)本發(fā)明所得產(chǎn)品純度高，抗氧化活性強(qiáng)。采用稀堿結(jié)合超聲浸提工藝獲得的小 球藻蛋白質(zhì)，在復(fù)合風(fēng)味蛋白酶作用下，在小球藻蛋白質(zhì)底物濃度為6mg/ml時(shí)，按[E]/[S] =1:25加入蛋白酶，在pH6. 0, 50°C條件下酶解5h再沸水浴15min后，獲得的活性肽對超氧 自由基的清除率達(dá)43. 36%。如果在前期小球藻破壁處理時(shí)結(jié)合在-70°C的超低溫冷凍處 理，最終在相同條件下酶解獲得的水解產(chǎn)物，其對超氧自由基的清除率可達(dá)72. 47%，比傳 統(tǒng)的熱水浸提得到的水解產(chǎn)物的清除率提高了 2. 04倍，比單獨(dú)堿液浸提得到的水解產(chǎn)物 的清除率提高了 2. 48倍。如果在前期小球藻破壁處理時(shí)結(jié)合在超高壓處理，最終在相同條 件下酶解獲得的水解產(chǎn)物，其對超氧自由基的清除率可達(dá)64. 73%。且工藝條件溫和，綠色 環(huán)保，符合保健食品的生產(chǎn)要求。
[0025] 本發(fā)明所獲得的抑菌肽來自天然小球藻材料，原料易得成本低，安全無毒。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖lFolin-Phonel法測蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0027] 圖2鄰苯三酚還原性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0028] 圖3四種酶水解小球藻蛋白不同時(shí)間的水解度曲線圖。
[0029] 圖4四種酶水解小球藻蛋白不同時(shí)間所得多肽溶液對DPPH自由基的清除率曲線 圖。
[0030] 圖5四種酶水解小球藻蛋白不同時(shí)間所得多肽溶液對超氧陰離子自由基的清除 率曲線圖。
[0031] 圖6四種酶水解小球藻蛋白不同時(shí)間所得多肽溶液對羥基自由基的清除率曲線 圖。
[0032] 圖7復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解小球藻蛋白不同時(shí)間的水解度曲線圖。
[0033] 圖8復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解小球藻蛋白不同時(shí)間所得多肽溶液對DPPH自由基的清 除率曲線圖。
[0034] 圖9復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解小球藻蛋白不同時(shí)間所得多肽溶液對超氧陰離子自由 基的清除率曲線圖。
[0035] 圖10復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解小球藻蛋白不同時(shí)間所得多肽溶液對羥基自由基的清 除率曲線圖。
[0036] 圖11復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解小球藻蛋白不同時(shí)間的多肽溶液的還原性曲線圖。
[0037] 圖12復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解小球藻蛋白后不同濃度水解肽溶液的抗氧化活性柱狀 圖。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 1小球藻蛋白的提取工藝
[0041] 1. 1材料與試劑
[0042] 小球藻干粉，來自浙江省杭州華丹農(nóng)產(chǎn)品有限公司；Bio-Rad Protein Assay試劑 盒，購自Bio-Rad Laboratories Inc ;硫酸銅，硫酸鉀，硫酸，硼酸，氫氧化鈉，95%乙醇，混 合指示液（2份甲基紅乙醇溶液與1份亞甲基藍(lán)乙醇溶液臨用時(shí)混合）。
[0043] 1.2實(shí)驗(yàn)儀器
[0044] 酶聯(lián)免疫檢測儀（Model-550)，美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī)（5415R)，德國 Eppendorf公司；電子天平（BS224S);凱氏定氮儀（KDY-9820)AL04型電子天平、HH-2型水 浴鍋、DHG-9240A型鼓風(fēng)干燥箱、DL-5M離心機(jī)（配更換轉(zhuǎn)頭）、SANYO超低溫冰箱。
[0045] 1.3實(shí)驗(yàn)方法
[0046] 1. 3. 1提取液中蛋白含量測定
[0047] 采用Bio-Rad Protein Assay法，按試劑盒說明操作，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行孔。 同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白的質(zhì)量濃度（分別為0· 05mg/mL，0. lmg/mL，0. 2mg/mL，0. 3mg/mL, 0. 4mg/mL，0. 5mg/mL)為橫坐標(biāo)，0D595值為縱坐標(biāo)繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為定量的依據(jù)。
[0048] 1.3.2小球藻蛋白質(zhì)的提取
[0049] 取小球藻粉200g，以料液比l:20(m/v)加入4000ml蒸饋水，4°C環(huán)境下攪拌lh, 得小球藻混合液，向小球藻混合液中緩慢加入NaOH至其終濃度為lwt%，并不斷攪拌，得到 堿性混合液；在4°C環(huán)境下，堿性混合液用超聲破壁處理60min，超聲條件為20?30KHz，然 后用0. 5M鹽酸調(diào)pH至7. 0 ;在4000rpm下離心20min，取上清液；加入4倍上清液體積的 體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，持續(xù)攪拌lmin，靜置5h ;在2000rpm下離心10min，棄去上清，取 沉淀用150mL蒸饋水溶解后濃縮至70mL，再冷凍干燥得到小球藻蛋白16. 44g。按照步驟 1.3. 1，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，測定提取得到的小球藻蛋白中蛋白質(zhì)含量。小球藻蛋白的 蛋白質(zhì)得率如下計(jì)算：（小球藻蛋白中蛋白質(zhì)含量X小球藻蛋白質(zhì)量/原料小球藻粉的質(zhì) 量）X100%
[0050] 2制備小球藻抗氧化活性肽的工藝研究
[0051] 2. 1實(shí)驗(yàn)材料和儀器
[0052] 2. 1. 1實(shí)驗(yàn)材料
[0053] 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（無錫聯(lián)合恒洲化工有限公司，ρΗ6· 0, 50°C，標(biāo)稱活力500LAPU/ g)，堿性蛋白酶（無錫聯(lián)合恒洲化工有限公司，PH8. 0, 55°C，標(biāo)稱活力2. 4AU-A/g)，復(fù)合蛋 白酶（無錫聯(lián)合恒洲化工有限公司，pH6.0,50°C，標(biāo)稱活力1.5AU-N/g)，中性蛋白酶（無錫 聯(lián)合恒洲化工有限公司，pH6. 0,45°C，標(biāo)稱活力0· 8AU-N/g)。
[0054] DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、鄰苯三酚（即焦性沒食子酸）、Tris (三羥 甲基氨基甲烷）、水楊酸、FeS04、鐵氰化鐵、三氯乙酸（TCA)、無水Na2C0 3、乙醇、HC1、NaOH、 Folin-Phenol試劑等均為分析純試劑；配制0. 5mg/ml BSA(牛血清蛋白）溶液；配制10% (w/v)的三氯乙酸（TCA)溶液；
[0055] 福林試劑A液：20. 000g無水Na2C03和4. OOOgNaOH溶于去離子水并定容至 1000ml ;福林試劑B液：1. 000g酒石酸鉀鈉溶于去離子水并定容至100ml ;福林試劑C液： 0. 500gCuS04 ·5Η20溶于100ml去離子水；福林試劑D液：48ml福林試劑A溶液與lml福林試 劑B液和lml福林試劑C液的混合液（當(dāng)天配制，當(dāng)天使用）；福林試劑E液：Folin-Phenol 試劑；
[0056] 2. 1. 2主要儀器
[0057] CT14RD高速冷凍離心機(jī)、UV1000紫外分光光度計(jì)、Tank 60Liter PE超純水機(jī)、 GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、電子天平等。
[0058] 2.2實(shí)驗(yàn)方法
[0059] 2. 2. 1小球藻溶液的水溶性蛋白質(zhì)總量的測定
[0060] 取四支1. 5ml離心管，并標(biāo)號0、1、2、3。其中，0號管中加入蒸餾水1. 0ml，l、2和 3三支管中準(zhǔn)確加入0. 6%未酶解的小球藻蛋白的溶液1. 0ml，在12000rpm的速度下離心 lOmin，分別對上清液作一定的稀釋，取稀釋液0. 50ml加入到四支15ml試管中，分別加入 4ml福林試劑D液，于室溫下靜置lOmin，然后加福林試劑E液0. 5ml并混勻，于40°C下保溫 20min，室溫冷卻，在680nm下測定各管溶液的吸光度，0號為空白組。根據(jù)Folin-Phonel法 測蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（圖1)和稀釋倍數(shù)算出水溶性蛋白質(zhì)總量。
[0061] Folin-Phonel法測蛋白的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按以下方法得到：利用濃度梯度為0、 0· 05mg/ml、0. lmg/ml、0. 2mg/ml、0. 3mg/ml、0. 4mg/ml BSA(牛清白蛋白）溶液來制作測定 蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，做三個(gè)平行。按2. 2. 1中自"分別取上清液0. 50ml加入到四支15ml 試管中……測定吸光度"類似步驟進(jìn)行操作。根據(jù)光度值可以看出，在〇?〇.4mg/ml BSA 范圍內(nèi)，吸光值與BSA溶液濃度具有較好的線性關(guān)系（標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1)，回歸方程為y = 1. 7030χ+0· 0225,相關(guān)系數(shù) R~2 = 0· 9999。
[0062] 2. 2. 2小球藻溶液中TCA可溶性短肽的含量測定
[0063] 取四支1. 5ml離心管，并標(biāo)號0、1、2、3。其中，0號管中加入蒸饋水0. 5ml，1、2、3 三支離心管中分別準(zhǔn)確加入0. 6%濃度酶解前或酶解后的小球藻溶液0. 5ml，所有四支管 均加入0· 5mll0wt% TCA溶液，搖勻后離心（12000rpm，10min)，以下按2. 2. 1自"分別對上 清液作一定的稀釋，取稀釋液〇. 50ml加入到四支15ml試管中……測定吸光度"進(jìn)行操作。 根據(jù)Folin-Phonel法測蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)，算出TCA可溶性短肽含量。
[0064] 2. 2. 3水解度測定
[0065] 水解度（degree of hydrolysis,DH)是理解和衡量蛋白水解程度和效果的重要參 數(shù)，且對于建立生物大分子的功能、生物活性以及感官特性與水解作用之間的關(guān)系具有重 要作用。目前有很多測定蛋白質(zhì)水解度的方法，主要是根據(jù)四個(gè)原則：①測定自由α-氨 基、②測定可溶性蛋白、③滴定釋放的質(zhì)子以及④通過滲透壓測定法測定蛋白溶液的冰點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)測定可溶性蛋白質(zhì)的原理來測定小球藻蛋白質(zhì)的水解度。蛋白質(zhì)經(jīng)過不同蛋白 酶的水解，形成不同長度的短肽，溶解性增加，然后通過可溶性蛋白（含短肽）的含量變化 來衡量蛋白質(zhì)水解的程度。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Folin-Phonel法對可溶性蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，小 球藻的水解度可用下式來計(jì)算：
[0066] DH =(水解后的多肽濃度-水解前的多肽濃度）/水解前總水溶性蛋白濃 度 X100%
[0067] 水解前或水解后的多肽濃度根據(jù)2. 2. 2測得，水解前總的水溶蛋白質(zhì)含量根據(jù) 2. 2. 1測得。
[0068] 2. 2. 4不同蛋白酶對小球藻蛋白的酶解反應(yīng)
[0069] 取按步驟1. 3. 2的實(shí)驗(yàn)方法獲得的小球藻蛋白各3g，加0. 5mol/L的PBS緩沖液 配成6mg/mL的底物溶液，按酶與底物的質(zhì)量比[E]/[S] = 1:25分別加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、 堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶，在各種酶的最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH條件下（復(fù)合 風(fēng)味蛋白酶：pH6.0,50°C ;堿性蛋白酶：pH8.0,55°C ;復(fù)合蛋白酶：pH6.0,50°C ;中性蛋白 酶：pH6. 0,45°C )，酶解反應(yīng)分別為0. 25、0. 5、l、2、3、4、5h時(shí)，分別取酶解液在95°C鈍酶 15min結(jié)束酶解反應(yīng)，得到酶解產(chǎn)物多肽溶液，分別測定各多肽溶液的抗氧化活性及小球藻 蛋白質(zhì)的水解度，水解度的測定方法按照上述步驟2. 2. 3,抗氧化活性的測定方法見以下 2. 2. 5〇
[0070] 2. 2. 5小球藻抗氧化肽的抗氧化測定方法
[0071] 2· 2· 5· 1 DPPH自由基清除率測定
[0072] 取按照步驟2. 2. 4制得的多肽溶液0· 2mL于試管中，分別加入2mLDPPH溶液（無 水乙醇配制，0. lmmol/L)，再加入1.9mL水?；靹蚍磻?yīng)體系，避光反應(yīng)30min，后于分光光度 計(jì)517nm處測定吸光值。以水代替樣品溶液、無水乙醇代替DPPH溶液，作空白實(shí)驗(yàn)調(diào)零用。 每個(gè)試樣作三個(gè)平行樣，取其平均值。DPPH自由基清除率依下面公式計(jì)算：
[0073] DPPH 清除率（％) = [MAfAj/Aj X 100
[0074] 其中：&為對照實(shí)驗(yàn)（水代替樣品溶液）的吸光值，&為樣品實(shí)驗(yàn)的吸光值，A2為 樣品干擾實(shí)驗(yàn)（無水乙醇代替DPPH溶液）的吸光值。
[0075] 2. 2. 5. 2超氧自由基清除率測定
[0076] 取 0· 05mol/L Tris-HCl 緩沖液（PH8. 2) 5ml，置于 25°C水浴中預(yù)熱 20min，分別加 入4ml按照步驟2. 2. 4制得的多肽溶液，25°C水浴中預(yù)熱20min，再加入3mmol/L25°C水浴 中預(yù)熱20min的鄰苯三酚（焦性沒食子酸）溶液lml，混勻后于25°C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min， 加入10mol/L HC1 lml終止反應(yīng)，于320nm處測定吸光值，空白對照組以相同體積的蒸餾水 代替樣品。每個(gè)試樣作三個(gè)平行樣，取其平均值。超氧自由基清除率依下面公式計(jì)算：
[0077] 超氧自由基清除率（％) = [1_(樣品實(shí)驗(yàn)組吸光值-樣品本色對照組吸光值）]/ 無樣品對照組吸光值X 100
[0078] 2. 2. 5. 3羥基自由基清除率測定
[0079] 于試管中分別加入按照步驟2. 2. 4制得的多肽溶液2ml，9mmol/L水楊酸-乙醇 2ml，9mmol/L FeS042ml，最后加入 2ml8. 8mmol/L H202 啟動(dòng)反應(yīng)，37°C反應(yīng) 15min，以蒸餾水 為空白對照，在510nm下測量各待測液的吸光值。每個(gè)試樣作三個(gè)平行樣，取其平均值。
[0080] 羥基自由基清除率依下面公式計(jì)算
[0081] 0H ·清除率（％ ) = [1-(AX-AX0)/AJ X 100
[0082] 式中：A。一對照（蒸餾水）實(shí)驗(yàn)吸光值，Ax-樣品液的吸光值，AXQ-背景實(shí)驗(yàn)吸收 值（反應(yīng)體系中無 H202)。
[0083] 2. 2. 5. 4還原性測定
[0084] 分別加入按照步驟2. 2. 4制得的多肽溶液0· 2mL，加入0· 2m〇l/LpH6. 6的PBS緩 沖溶液〇. 5mL，混合均勻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的鐵氰化鐵溶液0. 5mL，在50°C恒溫水浴中保 持2〇11^11，迅速冷卻并加入體積分?jǐn)?shù)為10(%的三氯乙酸溶液0.51^。離心取上清液1.〇1^， 依次加入1. 7mL蒸餾水和0. 5mL的0. 1 %的三氯化鐵溶液，充分混合均勻后lOmin于700nm 波長下測定溶液吸光度。每個(gè)試樣作三個(gè)平行樣，取其平均值。
[0085] 以鄰苯三酚（焦性沒食子酸）為標(biāo)準(zhǔn)品制還原性標(biāo)準(zhǔn)曲線。配置濃度分別為1. 6、 3. 2、4. 8、6. 4、8. 0、9. 6、11. 2、14. 4mg/ml的鄰苯三酚溶液，方法同上述步驟，于700nm波長 下測定溶液吸光度，以吸光度為縱軸，鄰苯三酚溶液濃度為橫軸，繪制鄰苯三酚還原性標(biāo)準(zhǔn) 曲線，如圖2所示。以多肽溶液的吸光度與鄰苯三酚還原性標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計(jì)算得到多肽溶 液的還原性相當(dāng)于鄰苯三酚溶液的濃度。
[0086] 2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0087] 2. 3. 1四種酶對小球藻蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性篩選
[0088] 2. 3. 1. 1四種酶對小球藻蛋白在不同水解時(shí)間的水解度見圖3。
[0089] 由圖3可知，小球藻蛋白濃度為6mg/mL時(shí)，四種酶對小球藻蛋白的水解程度，隨時(shí) 水解時(shí)間的延長不斷呈上升趨勢，其中復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋白的水解程度最大，堿 性蛋白酶的水解程度最小。在5h時(shí)，復(fù)合蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白 酶對小球藻蛋白的水解度分別為26. 25%、28. 05%、27. 15%、22. 84%。
[0090] 2. 3. 1. 2四種酶對小球藻蛋白不同水解時(shí)間的多肽溶液對DPPH自由基清除率見 圖4。
[0091] 由圖4可知，復(fù)合蛋白酶對小球藻蛋白水解30min時(shí)的酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的 清除率最高，在水解其它時(shí)刻，復(fù)合蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶對小球藻蛋白的 水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率相近，均優(yōu)于堿性蛋白酶。
[0092] 2.3. 1.3四種酶對小球藻蛋白不同水解時(shí)間的多肽溶液對超氧陰離子自由基清 除率見圖5。
[0093] 由圖5可知，在水解2h之前，復(fù)合蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解 產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除率相近，均優(yōu)于堿性蛋白酶；水解2h以后，中性蛋白酶和 復(fù)合蛋白酶隨著水解時(shí)間的延長，其水解產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除率不斷呈現(xiàn)下 降趨勢，其中中性蛋白酶水解產(chǎn)物的清除率下降的更明顯；而復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋 白的水解產(chǎn)物在2h以后對超氧陰離子自由基的清除率呈上升趨勢，至3h時(shí)達(dá)到最大為 91. 61%，之后曲線略有回落且趨于平緩。堿性蛋白酶在整個(gè)水解過程，其水解產(chǎn)物對超氧 陰離子自由基的清除率變化不大。
[0094] 2. 3. 1. 4四種酶對小球藻蛋白不同水解時(shí)間的多肽溶液對羥基自由基清除率見 圖6。
[0095] 由圖6可知，復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶在0. 5h之前的酶解產(chǎn)物對羥基自由基的清 除率隨時(shí)間延長不斷增加至最高，分別為85. 36%和72. 45%，隨后隨著時(shí)間的延長出現(xiàn)不 斷下降趨勢，至4h時(shí)下降到最小值后又出現(xiàn)上升趨勢。復(fù)合風(fēng)味蛋白酶在0. 5h之前的酶 解產(chǎn)物對羥基自由基的清除率隨時(shí)間延長不斷增加至最高達(dá)92. 08%，隨后隨著時(shí)間的延 長出現(xiàn)緩慢下降趨勢，至3h時(shí)下降到最小值66. 79%，而后又不斷呈上升趨勢。堿性蛋白酶 在整個(gè)水解過程，其水解產(chǎn)物對羥基自由基的清除率呈先降再升再降再升的趨勢，但整個(gè) 水解產(chǎn)物對羥基自由基的清除率均不高。
[0096] 綜合對比上述3個(gè)抗氧化指標(biāo)，其中復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對3個(gè)抗氧化指標(biāo)的作用效 果最優(yōu)，接下來選取復(fù)合風(fēng)味蛋白酶進(jìn)一步增大水解時(shí)間，增加四個(gè)指標(biāo)評價(jià)其水解產(chǎn)物 的抗氧化能力。
[0097] 2. 3. 2復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性
[0098] 2. 3. 2. 1復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋白在不同水解時(shí)間的水解度見圖7。
[0099] 由圖7可知，隨著時(shí)間的延長，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋白的水解度不斷增加， 但水解到4h時(shí)增加幅度變少，到24h時(shí)水解度增加幅度不大。
[0100] 2. 3. 2. 2復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋白不同水解時(shí)間的多肽溶液對DPPH自由基 清除率見圖8。
[0101] 由圖8可知，復(fù)合蛋白酶對小球藻蛋白水解30min時(shí)的酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的 清除率達(dá)到較高水平，隨后其清除效果趨于平緩，到5h時(shí)清除率略有升高，隨后出現(xiàn)下降 趨勢。
[0102] 2. 3. 2. 3復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋白不同水解時(shí)間的多肽溶液對超氧陰離子 自由基清除率見圖9。
[0103] 如圖9所示，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋白的水解產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清 除率隨時(shí)間延長不斷呈上升趨勢至3h時(shí)達(dá)到較高值為84. 51 %，之后曲線略有回落，到5h 時(shí)清除率又上升至86. 45%，然后又出現(xiàn)下降趨勢。
[0104] 2. 3. 2. 4復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋白不同水解時(shí)間的多肽溶液對羥基自由基 清除率見圖10。
[0105] 如圖10所示，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶在0.5h時(shí)的酶解產(chǎn)物對羥基自由基的清除率已 達(dá)較高水平88. 41%，隨后隨著時(shí)間的延長出現(xiàn)非常緩慢下降趨勢，至3h時(shí)下降到最小值 81. 04%，而后又不斷呈上升趨勢但曲線平緩。
[0106] 2. 3. 2. 5復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋白不同水解時(shí)間的還原性見圖11。
[0107] 如圖11所示，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶在lh之前的酶解產(chǎn)物的還原性隨時(shí)間延長不斷增 加至19. 83mg/mL，隨后隨著時(shí)間的延長增長平穩(wěn)，至3h以后緩慢上升到20. 51mg/mL，而后 呈緩慢下降趨勢。
[0108] 綜合上述結(jié)果，底物濃度為6mg/mL時(shí)，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋白水解5h時(shí)，4 個(gè)抗氧化指標(biāo)的效果最優(yōu)，接下來選取復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的水解時(shí)間為5h時(shí)，對不同濃度底 物的抗氧化效果進(jìn)行檢測。
[0109] 2. 3. 3復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對不同濃度底物水解產(chǎn)物的抗氧化活性
[0110] 按照步驟2.2.4進(jìn)行操作，取1.3.2的實(shí)驗(yàn)方法獲得的小球藻蛋白各3g，力口 0· 5mol/L、pH = 6. 0的PBS緩沖液配成6mg/mL的底物溶液，按酶與底物的質(zhì)量比[E]/[S] =1:25加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，在pH6. 0,50°C下酶解反應(yīng)5h，取酶解液在95°C鈍酶15min 結(jié)束酶解反應(yīng)，所得反應(yīng)液，濃縮至原體積的1/4,冷凍干燥，制得酶解產(chǎn)物為棕黃色的小球 藻抗氧化肽0. 43g。取小球藻抗氧化肽分別配成0. 20、0. 22、0. 25、0. 30、0. 35、0. 44、0. 59、 0. 89、1. 77mg/mL的水解肽溶液，分別測定各水解肽溶液的抗氧化活性，抗氧化活性的測定 方法按照步驟2. 2. 5進(jìn)行。不同濃度水解肽溶液的抗氧化活性結(jié)果如圖12所示。
[0111] 由圖12可知，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對小球藻蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化性呈濃度依賴性， 當(dāng)水解肽溶液濃度達(dá)1. 77mg/mL時(shí)，水解產(chǎn)物對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由 基的清除率接近％(0. 5mg/mL)的作用效果，隨著水解肽溶液濃度的下降，對各自由基的清 除效果不斷下降，當(dāng)水解肽溶液濃度為〇. 2mg/mL時(shí)，水解產(chǎn)物對各自由基的清除率仍在較 商水平。
[0112] 自由基是人體生命活動(dòng)中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，其中超氧陰離子自由基 是具有代表性的自由基，它在各種致病過程中都是重要的介導(dǎo)因素，與癌癥、機(jī)體炎癥、組 織過氧化、蛋白質(zhì)交聯(lián)變性、DNA損傷和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等都有著直接的關(guān)系。超氧陰離子自 由基不僅自身具有毒性，而且可以經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其它活性氧自由基，進(jìn)一步對生物 體產(chǎn)生損傷作用，且停留時(shí)間較長。超氧陰離子自由基是生物活性最高的氧中心自由基之 一，它在生命過程和化學(xué)反應(yīng)中作為電子受體，形成不同的活性氧自由基鏈中的第一個(gè)自 由基，經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其它的氧自由基。和其它的活性氧相比，超氧陰離子自由基不是 很活潑，但其壽命長，危害大，捕獲超氧陰離子自由基進(jìn)行研究具有重要的意義。因此，以下 各實(shí)施例和比較例中選擇水解產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除率考察其抗氧化活性。
[0113] 實(shí)施例2
[0114] 取小球藻粉20g，以料液比l:20(m/v)加入400ml蒸餾水，4°C環(huán)境下攪拌lh ;將 小球藻懸濁液緩放入超低溫冰箱中，_70°C環(huán)境下冷凍12h ;然后于30°C下解凍至4°C，向解 凍后的小球藻混合液中緩慢加入NaOH至其終濃度為1 %，并不斷攪拌，得到堿性混合液；在 4°C環(huán)境下，堿性混合液用超聲破壁處理60min，超聲條件為30KHz，然后用0. 5M鹽酸調(diào)pH 至7. 0 ;在4000rpm下離心20min，取上清液；加入4倍上清液體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶 液，持續(xù)攪拌lmin，靜置5h ;在2000rpm下離心lOmin，棄去上清，取沉淀用50mL蒸饋水溶解 后濃縮至30mL左右，冷凍干燥后得到小球藻蛋白2. 26g。然后取小球藻蛋白，按照實(shí)施例1 的步驟2. 3. 3進(jìn)行操作，計(jì)算小球藻蛋白的得率及不同濃度水解肽溶液對超氧陰離子自由 基的清除率，見下表1、表2所示。
[0115] 表1不同處理工藝小球藻蛋白質(zhì)得率
[0116]

【權(quán)利要求】
1. 一種小球藻抗氧化肽的制備方法，其特征再于所述方法包括以下步驟： (1) 小球藻干粉加入蒸餾水混勻，所述蒸餾水的體積用量以小球藻干粉質(zhì)量計(jì)為 20mL/g，4°C下攪拌1?3h，得到小球藻混合液，在不斷攪拌下向小球藻混合液中加入NaOH， 使NaOH的質(zhì)量終濃度為1?4%，得到堿性混合液，然后將堿性混合液在4°C下超聲破壁 處理1?2h，調(diào)pH值為7. 0,離心分離，取上清液，加入體積為上清液體積4倍的體積分?jǐn)?shù) 95%的乙醇，攪拌1?10分鐘后，靜置5?6小時(shí)，再次離心，棄去上清液，取沉淀用蒸餾水 清洗，然后用少量蒸餾水溶解，濃縮、冷凍干燥制得小球藻蛋白； (2) 小球藻蛋白加0. 5mol/L的PBS緩沖液配成6mg/mL濃度的底物水溶液，按酶與底物 的質(zhì)量比1:25加入復(fù)合蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶或堿性蛋白酶，在各種酶的 最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH條件下，進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)0. 5?5h，然后將酶解液升溫至90? 95°C反應(yīng)15?30min，結(jié)束酶解反應(yīng)，所得反應(yīng)液濃縮至原體積的1/4,冷凍干燥，制得小球 藻抗氧化肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（2)中，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的反應(yīng)條件 為pH值6. 0,反應(yīng)溫度50°C;堿性蛋白酶的反應(yīng)條件為pH值8. 0,反應(yīng)溫度55°C ;復(fù)合蛋白 酶的反應(yīng)條件為pH值6. 0,反應(yīng)溫度50°C ;中性蛋白酶的反應(yīng)條件為pH值6. 0,反應(yīng)溫度 45。。。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（2)中，向底物水溶液中加入復(fù)合風(fēng) 味蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)條件為pH值6. 0,反應(yīng)溫度50°C。
4. 如權(quán)利要求1?3之一所述的方法，其特征在于所述步驟（2)中，酶解反應(yīng)的時(shí)間為 5小時(shí)。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（1)按以下步驟操作： 小球藻干粉加入蒸餾水混勻，所述蒸餾水的體積用量以小球藻干粉質(zhì)量計(jì)為20mL/g， 4°C下攪拌1?3h，得到小球藻混合液，小球藻混合液在-70°C下冷凍12h，再于30°C下解凍 至4°C，在不斷攪拌下向解凍后的小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的質(zhì)量終濃度為1? 4%，得到堿性混合液，然后將堿性混合液在4°C下超聲破壁處理1?2h，調(diào)pH值為7. 0,離 心分離，取上清液，加入體積為上清液體積4倍的體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，攪拌1?10分鐘 后，靜置5?6小時(shí)，再次離心，棄去上清液，取沉淀用蒸餾水清洗，然后用少量蒸餾水溶解， 濃縮、冷凍干燥制得小球藻蛋白。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（1)按以下步驟操作： 小球藻干粉加入蒸餾水混勻，所述蒸餾水的體積用量以小球藻干粉質(zhì)量計(jì)為20mL/ g，4°C下攪拌1?3h，得到小球藻混合液，小球藻混合液加入高壓均質(zhì)機(jī)中，調(diào)節(jié)壓力至 lOOMPa，處理15?20次，然后在4°C、不斷攪拌下向高壓均質(zhì)后的小球藻混合液中加入 NaOH，使NaOH的質(zhì)量終濃度為1?4%，得到堿性混合液，然后將堿性混合液在4°C下超聲 破壁處理1?2h，調(diào)pH值為7. 0,離心分離，取上清液，加入體積為上清液體積4倍的體積 分?jǐn)?shù)95%的乙醇，攪拌1?10分鐘后，靜置5?6小時(shí)，再次離心，棄去上清液，取沉淀用蒸 餾水清洗，然后用少量蒸餾水溶解，濃縮、冷凍干燥制得小球藻蛋白。
【文檔編號】C12P21/06GK104120160SQ201410255322
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】張擁軍, 王爽, 張高帆, 蘇東洋, 朱麗云 申請人:中國計(jì)量學(xué)院