單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗hiv免疫粘附素的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗HIV免疫粘附素，其由單個(gè)基因編碼區(qū)域產(chǎn)生，不包含常規(guī)抗體的CL和CH1結(jié)構(gòu)域，包含由靈活肽段連結(jié)而成的兩個(gè)或多個(gè)抗體功能結(jié)構(gòu)域scFv以及人免疫球蛋白Fc區(qū)域，且能夠同時(shí)與兩個(gè)或多個(gè)不同HIV相關(guān)抗原表位進(jìn)行高親和力的結(jié)合。本發(fā)明構(gòu)建了的單一基因編碼的具有雙或多價(jià)特異抗HIV位點(diǎn)的分泌型免疫粘附素具有高效的抗病毒能力及中和廣譜性，并使出現(xiàn)中和抗體的耐藥病毒株的機(jī)率降到最低。
【專(zhuān)利說(shuō)明】單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗HIV免疫粘附素
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗Hiv-1感染的新型生物劑預(yù)防和免疫治療產(chǎn)品的研發(fā)，特別涉及用于有效阻斷HIV-1感染的廣譜高效中和免疫粘附素的基因優(yōu)化、蛋白表達(dá)純化以及中和效能的改進(jìn)。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病(HIV/AIDS)是嚴(yán)重威脅人類(lèi)公共健康的最主要因素之一，至今已經(jīng)導(dǎo)致了全世界累計(jì)3000萬(wàn)人死亡和高達(dá)3300萬(wàn)的病毒攜帶者，迄今還沒(méi)有有效的治愈艾滋病的方法和疫苗。雖然目前已經(jīng)有幾十種廣譜高效的抗HIV-1中和抗體從少數(shù)艾滋病感染者中分離出來(lái)，但是可以誘導(dǎo)出這種中和抗體的疫苗還一直沒(méi)有被研發(fā)出來(lái)，見(jiàn)文獻(xiàn)[Kwong PD, Mascola JR:Human antibodies that neutralize HIV-1:1dentification, structures, and B cell ontogenies.1mmunity, 2012, 37:412-425]以及[Corti D, LanzavecchiaA:Broadly neutralizing antiviral antibodies.Annu Rev Immuno12013, 31:705-742]。
[0003]面對(duì)艾滋病疫苗研制長(zhǎng)期以來(lái)的失敗結(jié)果，我們?cè)谥匦滤伎己蛯徱曈嘘P(guān)艾滋病疫苗的設(shè)計(jì)、疫苗免疫策略等重大科學(xué)問(wèn)題的同時(shí)，對(duì)其他新型生物劑預(yù)防產(chǎn)品進(jìn)行研發(fā)。免疫粘附素(Immunoadhesin, IA)就是其中一種,它是基于中和抗體、已經(jīng)獲FDA批準(zhǔn)的用于預(yù)防和治療的新型生物產(chǎn)品。
[0004]近幾年來(lái)，人 免疫粘附素被證明在臨床上有應(yīng)用潛能，是以人源單克隆中和抗體為藥劑來(lái)中和外來(lái)病原體(如HIV)提供了另一種可能的方式。構(gòu)建免疫粘附素的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)在于較容易在體外優(yōu)化中和抗體的中和效力，包括優(yōu)化提高抗體的表達(dá)、釋放、半衰期和結(jié)合區(qū)域親和力等特性。最近的研究已經(jīng)證明，即使在很低的濃度條件下，有中和抗體活性的免疫粘附素能夠有效保護(hù)對(duì)于猴子免于SIV的感染，見(jiàn)文獻(xiàn)[Hessell AJ, PoignardP, Hunter M, Hangartner L, Tehrani DM, Bleeker WK, Parren PW, Marx PA,BurtonDR:Effective, low-titer antibody protection against low-dose repeated mucosalSHIV challenge in macaques.Nat Med2009, 15:951-954]以及[Johnson PR, SchneppBC, Zhang J, Connell MJ, Greene SM, Yuste E, Desrosiers RC, Clark KR:Vector-mediatedgene transfer engenders long-lived neutralizing activity and protection againstSIV infection in monkeys.Nat Med2009, 15:901-906]。目前，能使人免于 HIV 的感染的具有中和抗體活性的免疫粘附素類(lèi)似產(chǎn)品還沒(méi)有報(bào)道；針對(duì)scFv-1balizumab (Hu5A8)，scFv-VRCOl, scFv-PG09, scFv_PG16 和 scFv_PGT128 分泌型 slgG-免疫粘附素或者分泌型SlgA-免疫粘附素的研究，也沒(méi)有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是構(gòu)建能夠由單一基因編碼的具有雙或多價(jià)特異抗HIV位點(diǎn)的分泌型免疫粘附素，其具有高效的抗病毒能力及中和廣譜性，并使出現(xiàn)中和抗體的耐藥病毒株的機(jī)率降到最低。[0006]本發(fā)明提供了一種單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗HIV免疫粘附素，其由單個(gè)基因編碼區(qū)域產(chǎn)生，不包含常規(guī)抗體的CL和CHl結(jié)構(gòu)域，包含由靈活肽段連結(jié)而成的兩個(gè)或多個(gè)抗體功能結(jié)構(gòu)域scFv以及人免疫球蛋白Fe區(qū)域，且能夠同時(shí)與兩個(gè)或多個(gè)不同HIV相關(guān)抗原表位進(jìn)行高親和力的結(jié)合。
[0007]本發(fā)明還提供了上述單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，包括以下步驟:
[0008]步驟一:篩選目標(biāo)基因，并根據(jù)目標(biāo)基因構(gòu)建中和抗體單鏈scFv基因，即VL- (Gly4Ser) 3_VH 或 VH- (Gly4Ser) 3_VL ；
[0009]步驟二:將構(gòu)建的一種中和抗體單鏈scFv基因與人IiIgG1-Fc基因進(jìn)行無(wú)縫連接，構(gòu)成IgG免疫粘附素融合基因；
[0010]步驟三:通過(guò)重疊PCR的方法將另一種中和抗體單鏈scFv基因與上述IgG免疫粘附素融合基因通過(guò)一個(gè)(Gly4Ser)4肽段相連接，構(gòu)建融合基因；
[0011]步驟四:將步驟三最后構(gòu)建得到的融合基因整合進(jìn)優(yōu)化后的pVAX-Opt.載體中，構(gòu)建出單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-SG-Bispecific-1A ；
[0012]步驟五:將構(gòu)建的單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-SG-Bispecific-1A通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和蛋白純化來(lái)得到所需的免疫粘附素。
[0013]步驟一中所述目標(biāo)基因?yàn)閟cFv_Hu5A8基因和scFv_PGT128基因，所述構(gòu)建的中和抗體單鏈scFv基因序列如圖1的scFv_Hu5A8和scFv-PGT 128所不。 [0014]步驟二中構(gòu)建的一種中和抗體單鏈scFv基因?yàn)閟cFv-Hu5A8基因，與人IiIgG1-Fc基因進(jìn)行無(wú)縫連接，構(gòu)建SCFv-Hu5A8-1gG基因，構(gòu)建方法如下:先用設(shè)計(jì)好的兩對(duì)引物分別PCR擴(kuò)增scFv-Hu5A8基因和IiIgG1-Fc基因，引物的構(gòu)建原則為:scFv-Hu5A8基因的反向引物和IiIgG1-Fc基因的正向引物有10個(gè)堿基的基因重疊，scFv-Hu5A8基因的正向引物和hIgG1-Fc基因的反向引物的末端分別設(shè)計(jì)有BamHI和MssI酶切位點(diǎn)；然后以?xún)煞N擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以scFv-Hu5A8基因的正向引物和higG^Fc基因的反向引物為引物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Hu5A8的IgG免疫粘附素融合基因，即scFv-Hu5A8-1gG。
[0015]步驟三中另一種中和抗體單鏈scFv基因?yàn)閟cFv-PGT 128基因，構(gòu)建方法如下:先用設(shè)計(jì)好的兩對(duì)引物分別PCR擴(kuò)增scFv-PGT 128基因和ScFv-Hu5A8-1gG基因；引物的構(gòu)建原則為:scFv-PGT 128基因的反向引物和scFv-Hu5A8-1gG基因的正向引物有45個(gè)堿基的基因重疊，且scFv-PGT128基因的正向引物和ScFv-Hu5A8-1gG基因的反向引物的末端分別設(shè)計(jì)有BamHI和MssI酶切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)還要引入一個(gè)(Gly4Ser)4肽段，將scFv-PGT128連接到ScFv-Hu5A8-1gG的5’端；然后以?xún)煞N擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以scFv-PGT128基因的正向引物和scFv-Hu5A8-1gG基因的反向引物為引物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到scFv-PGT128_linker-scFv-Hu5A8-1gG 融合基因。
[0016]步驟四中是通過(guò)BamHI和MssI雙酶切連接法，把上述scFv-PGT128-linker_scFv-Hu5A8-1gG融合基因整合進(jìn)圖3A所示的優(yōu)化后的pVAX載體中，其中融合基因的5’端以BamHI連接，3’端以MssI連接到載體，從而構(gòu)建出如圖3G所示的單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達(dá)質(zhì)粒，即pVAX-SG-Bispecific-1A。
[0017]步驟五中細(xì)胞轉(zhuǎn)染和蛋白純化的步驟如下:提前一天將293T細(xì)胞以1.5X105個(gè)細(xì)胞/毫升的密度鋪在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染當(dāng)天用PEI轉(zhuǎn)染試劑與單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-SG-Bispecific-1A充分混合，DNA與PEI轉(zhuǎn)染試劑的質(zhì)量比1:3，靜置15分鐘后將PE1-DNA混合物均勻加入293T細(xì)胞中，三天后將細(xì)胞上清用rProtein G試劑收集純化分泌的免疫粘附素。
[0018]本發(fā)明選擇設(shè)計(jì)了多種針對(duì)不同靶位的中和抗體的單鏈決定域基因，進(jìn)行基因編排的優(yōu)化，先構(gòu)建成單價(jià)分泌型IgG免疫粘附素，比較這些免疫粘附素的抗病毒活性及協(xié)同作用，選擇其中具有較強(qiáng)協(xié)同中和作用的兩個(gè)中和抗體scFv作為構(gòu)建雙或多價(jià)特異性免疫粘附素的母版，構(gòu)建了單一基因編碼的具有雙或多價(jià)特異抗HIV位點(diǎn)的分泌型免疫粘附素，實(shí)驗(yàn)證明，這種免疫粘附素具有高效的抗病毒能力及中和廣譜性，并使出現(xiàn)中和抗體的耐藥病毒株的機(jī)率降到最低。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0019]下面結(jié)合圖表和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0020]圖1為優(yōu)化后的目標(biāo)抗體單鏈基因及人IiIgG1-Fc序列。
[0021]圖2為本發(fā)明單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的構(gòu)建示意圖。
[0022]圖3為本發(fā)明單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
[0023]圖4為構(gòu)建成功的各特異性免疫粘附素的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。
[0024]圖5用ELISA和FACS檢測(cè)特異性免疫粘附素對(duì)⑶4和gpl20的結(jié)合能力的檢測(cè)結(jié)果。
[0025]圖6為各特異性免疫粘附素對(duì)假病毒的中和強(qiáng)度及廣譜性的檢測(cè)結(jié)果。
[0026]圖7為各特異性免疫粘附素對(duì)40株HIV-1假病毒的中和結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】:
[0027]下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0028]實(shí)施例1
[0029]本實(shí)施例提供了 SlgG及SlgA目標(biāo)基因的選擇、合成、優(yōu)化及免疫粘附素(IA)的構(gòu)建和表達(dá)，具體過(guò)程如下:
[0030]步驟一:目標(biāo)基因的篩選和單鏈抗體的構(gòu)建
[0031]選擇設(shè)計(jì)了多種針對(duì)H IV不同靶位的中和抗體的單鏈基因(scFv)，具體參考文獻(xiàn)(I)Skerra A, Pluckthun A:Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragmentin Escherichia col1.Sciencel988,240:1038-1041.和(2)Glockshuber R,MaliaM, Pfitzinger I, Pluckthun A:A comparison of strategies to stabilize immunoglobulinFv-fragments.Biochemistry 1990, 29:1362-1367。即 VL-(Gly4Ser)3_VH(見(jiàn)構(gòu)建不意圖2A)，包括scFv-Hu5A8 (針對(duì)靶細(xì)胞CD4)，scFv-VRCOl (針對(duì)HIV包膜蛋白CD4結(jié)合位點(diǎn))，scFv-PG9 (針對(duì)HIV包膜蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)V2環(huán))，scFv-PG16 (針對(duì)HIV包膜蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)V2環(huán))和scFv-PGT128(針對(duì)HIV包膜蛋白V3環(huán)和糖基)，并成功構(gòu)建出高表達(dá)，密碼子優(yōu)化的中和抗體單鏈基因(Genscript公司合成，針對(duì)在人體內(nèi)蛋白表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化)，具體氨基酸和DNA序列見(jiàn)圖1。
[0032]步驟二:構(gòu)建IgG免疫粘附素的融合基因[0033]通過(guò)重疊PCR方法，將上述五種優(yōu)化后的scFv基因(圖1)與人IiIgG1-Fc基因(參考GenBank序列AC_000146)進(jìn)行無(wú)縫連接，即將scFv中VH的3’端與IiIgG1-Fc中hinge區(qū)域的5’端連接，構(gòu)成IgG免疫粘附素融合基因(見(jiàn)構(gòu)建示意圖2B)。
[0034]以構(gòu)建融合基因ScFv-Hu5A8-1gG為例，具體構(gòu)建方法為:
[0035]先用設(shè)計(jì)好的兩對(duì)引物(引物均由Tech Dragon Ltd.公司合成)分別PCR擴(kuò)增兩個(gè)需要融合的基因，如用引物Hu5A8-lF/Hu5A8-lR(見(jiàn)表1)擴(kuò)增scFv-Hu5A8 (步驟一中構(gòu)建，由Genscript公司合成)，用引物Hu5A8-2F/2R(見(jiàn)表1)擴(kuò)增IiIgG1-Fc基因(模板序列見(jiàn)圖1，由Genscript公司合成)，引物的構(gòu)建原則為:反向引物IR和正向引物2F有10個(gè)堿基的基因重疊，且正向引物IF和反向引物2R的末端分別設(shè)計(jì)有BamHI和MssI酶切位點(diǎn)。具體PCR反應(yīng)條件按照高保真DNA聚合酶KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase (Kapa Biosystems公司，貨號(hào)KK2601)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，其中退火65°C 15秒，延伸72°C，I分鐘/Kb，共20個(gè)循環(huán)；然后以?xún)煞N擴(kuò)增產(chǎn)物(重疊基因部分可自動(dòng)進(jìn)行配對(duì))為模板，以HU5A8-1F和2R為引物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件同上)，得到Hu5A8的IgG免疫粘附素融合基因，即scFv-Hu5A8-1gG，且融合基因的5’端和3’端即分別連有BamHI和MssI酶切位點(diǎn)以利于后續(xù)的質(zhì)粒構(gòu)建。
[0036]融合基因scFv-VRCOl-1gG、scFv-PG09_IgG、scFv-PG16_IgG、scFv-PGT 128-1 gG 的構(gòu)建方法同融合基因scFv-Hu5A8-1gG。所有構(gòu)建融合基因的PCR引物序列見(jiàn)表1 (引物2R同時(shí)代表 Hu5A8-2R、VRC01-2R、PG09-2R、PG16-2R 和 PGT128-2R，序列均相同)。
[0037]表1
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗HIV免疫粘附素，其特征在于，其由單個(gè)基因編碼區(qū)域產(chǎn)生，不包含常規(guī)抗體的CL和CHl結(jié)構(gòu)域，包含由靈活肽段連結(jié)而成的兩個(gè)或多個(gè)抗體功能結(jié)構(gòu)域scFv以及人免疫球蛋白Fe區(qū)域，且能夠同時(shí)與兩個(gè)或多個(gè)不同HIV相關(guān)抗原表位進(jìn)行高親和力的結(jié)合。
2.一種單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:篩選目標(biāo)基因，并根據(jù)目標(biāo)基因構(gòu)建中和抗體單鏈scFv基因； 步驟二:將構(gòu)建的一種中和抗體單鏈scFv基因與人IiIgG1-Fc基因進(jìn)行無(wú)縫連接，構(gòu)成IgG免疫粘附素融合基因； 步驟三:通過(guò)重疊PCR的方法將另一種中和抗體單鏈scFv基因與上述IgG免疫粘附素融合基因通過(guò)一個(gè)(Gly4Ser)4肽段相連接，構(gòu)建融合基因； 步驟四:將步驟三最后構(gòu)建得到的融合基因整合進(jìn)優(yōu)化后的PVAX-Opt.載體中，構(gòu)建出單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-SG-Bispecific-1A ； 步驟五:將構(gòu)建的單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-SG-Bispecific-1A通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和蛋白純化來(lái)得到所需的免疫粘附素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，步驟一中所述目標(biāo)基因?yàn)閟cFv-Hu5A8基因和scFv_PGT128基因，所述構(gòu)建的中和抗體單鏈scFv基因序列如圖1的scFv_Hu5A8和scFv_PGT128所不。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，步驟二中構(gòu)建的一種中和抗體單鏈scFv基因?yàn)镾cFv-Hu5A8基因，與人hIgG1-Fc基因進(jìn)行無(wú)縫連接，構(gòu)建scFv-Hu5A8-1gG基因，構(gòu)建方法如下: 先用設(shè)計(jì)好的兩對(duì)引物分別PCR擴(kuò)增ScFv-Hu5A8基因和IiIgG1-Fc基因，引物的構(gòu)建原則為:scFv-Hu5A8基因的反向引物和IiIgG1-Fc基因的正向引物有10個(gè)堿基的基因重疊，scFv-Hu5A8基因的正向引物和IiIgG1-Fc基因的反向引物的末端分別設(shè)計(jì)有BamHI和MssI酶切位點(diǎn)；然后以?xún)煞N擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以scFv-Hu5A8基因的正向引物和IiIgG1-Fc基因的反向引物為引物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Hu5A8的IgG免疫粘附素融合基因，即scFv-Hu5A8-1gG。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，步驟三中另一種中和抗體單鏈scFv基因?yàn)閟cFv-PGT128基因，構(gòu)建方法如下:先用設(shè)計(jì)好的兩對(duì)引物分別PCR擴(kuò)增scFv-PGT128基因和scFV-Hu5A8_IgG基因；引物的構(gòu)建原則為:scFv-PGT128基因的反向引物和ScFv-Hu5A8-1gG基因的正向引物有45個(gè)堿基的基因重疊，且scFv-PGT 128基因的正向引物和scFV-Hu5A8_I gG基因的反向引物的末端分別設(shè)計(jì)有BamHI和MssI酶切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)還要引入一個(gè)(Gly4Ser)4肽段，將scFv-PGT128連接到ScFv-Hu5A8-1gG的5’端；然后以?xún)煞N擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以scFv-PGT 128基因的正向引物和SCFV-Hu5A8_I gG基因的反向引物為引物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 scFv-PGT 128-1 inker-scFv-Hu5A8-1gG 融合基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，步驟四中是通過(guò)BamHI和MssI雙酶切連接法，把上述scFv-PGT128_linker-SCFv-Hu5A8-1gG融合基因整合進(jìn)圖3A所示的優(yōu)化后的pVAX載體中，其中融合基因的5’端以BamHI連接，3’端以MssI連接到載體，從而構(gòu)建出如圖3G所示的單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達(dá)質(zhì)粒，即pVAX-SG-Bispecific-1A。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的單基因編碼的雙或多價(jià)特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，步驟五中細(xì)胞轉(zhuǎn)染和蛋白純化的步驟如下:提前一天將293T細(xì)胞以.1.5 X 1O5個(gè)細(xì)胞/毫升的密度鋪在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染當(dāng)天用PEI轉(zhuǎn)染試劑與單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-SG-Bispecific-1A充分混合，DNA與PEI轉(zhuǎn)染試劑的質(zhì)量比1:3，靜置15分鐘后將PE1-DNA混合物均勻加入293T細(xì)胞中，三天后將細(xì)胞上清用rPr otein G試劑收集純化分泌的免疫粘附素。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK104004092SQ201410245945
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】陳志偉, 郭佳, 安明暉, 王輝 申請(qǐng)人:深圳市第三人民醫(yī)院, 港大科橋有限公司