一株能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌。所述內(nèi)生真菌為刺盤孢（Colletotrichumsp.）AJ4，已于2014年5月20日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCC?No.9227。通過應(yīng)用該菌株的菌液，可以進(jìn)行杉木苗木栽植前期蘸根和用于杉木林地澆根。本發(fā)明涉及的菌株通過接種后植株的測(cè)定試驗(yàn)，得出植株的葉綠素含量以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)表現(xiàn)均優(yōu)于對(duì)照，且澆根的接種方式優(yōu)于淋冠，表明其對(duì)于杉木光合作用具有很大提高作用。
【專利說明】一株能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌。
【背景技術(shù)】
[0002]植物內(nèi)生菌的研究始于19世紀(jì)末，Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分離出第一株內(nèi)生菌[1]。但真正開始大量研究植株中的內(nèi)生菌起始于上世紀(jì)八十年代，主要是在溫帶地區(qū)、亞熱帶地區(qū)和熱帶地區(qū)的植被中開展研究。
[0003]前人從大部分植物中都能分離出內(nèi)生菌，因此可以推測(cè)內(nèi)生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范圍內(nèi)至少在80多個(gè)屬290多種的禾本科農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌[2]。目前從植物中分離的內(nèi)生菌根據(jù)其具有的獨(dú)特功能可以分為:固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌[3_4]、具有抗病蟲害的生防菌[5_7]和具有促進(jìn)植物對(duì)不良環(huán)境的修復(fù)能力的抗性菌。
[0004]謝卿媚和黃建河(1985) [8]對(duì)杉木內(nèi)生菌根的形態(tài)特征及菌根真菌的鑒定，主要以杉根皮層組織與內(nèi)生菌根真菌的共生結(jié)構(gòu)作解剖學(xué)分析及以濕篩一傾析法從根際土中獲得的菌絲與厚垣孢子進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，根據(jù)杉木內(nèi)生菌根的解剖學(xué)分析與根際土壤中厚垣孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，確定杉木內(nèi)生菌根是屬于泡囊一叢枝型內(nèi)生菌根(簡(jiǎn)稱VA菌根)。進(jìn)一步研究杉木內(nèi)生菌根 對(duì)杉木的生長(zhǎng)發(fā)育及抗性方面的效應(yīng)，充分合理的利用內(nèi)生菌根制劑促進(jìn)杉木生長(zhǎng)的問題，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。特別是在我國(guó)南方養(yǎng)分瘠薄的紅壤地區(qū)，研究?jī)?nèi)生菌根增強(qiáng)土壤中磷素的吸收，是當(dāng)前南方紅壤地區(qū)杉木速生豐產(chǎn)中亟待解決的重要問題。綜上可知，關(guān)于杉木的內(nèi)生真菌方面的研究?jī)H從根部位進(jìn)行鑒定研究，而對(duì)杉木葉部位和莖部位均未涉及內(nèi)生真菌的研究。此外，有關(guān)內(nèi)生真菌對(duì)杉木自身生長(zhǎng)的影響研究還存在空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一株能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌。
[0006]本發(fā)明提供的一株能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌，為刺盤孢(JJolletotrichumsp.) AJ4,已于2014年5月20日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCCN0.9227。
[0007]該菌的分離、純化包括:
A、材料:將采集得到不同年份的杉木根、莖段、葉分成三個(gè)部分，用自來(lái)水清洗干凈，分裝到自封袋內(nèi)，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——無(wú)菌水浸洗一次——10%次氯酸鈉浸泡7min——無(wú)菌水浸洗一次。當(dāng)樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對(duì)照，以檢驗(yàn)樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續(xù)調(diào)整消毒方法[9_11]；
C、接種部位的選擇:葉尖部、葉中部和葉基部3個(gè)處理；枝條:上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處；根部:分為根尖和根基2個(gè)部分；D、接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養(yǎng)基表面，于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5— 7天后觀察菌落生長(zhǎng)狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產(chǎn)生的菌株進(jìn)行分離純化；生長(zhǎng)緩慢且數(shù)量較少的菌株可延長(zhǎng)觀察時(shí)間，直到其生長(zhǎng)穩(wěn)定后純化。
[0008]固體培養(yǎng):使用改良馬丁固體培養(yǎng)基，配方為蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無(wú)菌水，pH值
6.4±0.2，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48h ；
E、將分離繁殖出的不同種類的內(nèi)生真菌接入平板培養(yǎng)基進(jìn)行純化，經(jīng)過2-3次點(diǎn)接純化、轉(zhuǎn)接后得到單一菌種的上述的Colletotrichum sp.功能菌株；
其分生孢子盤呈盤形或墊狀，黑褐色，盤上有剛毛，有隔膜，平滑，較堅(jiān)硬，分生孢子梗單枝，淡褐色，平滑，疏松排列成柵欄狀。參照真菌鑒定手冊(cè)將其鑒定為刺盤孢屬{ColIetotrichum sp.)。
[0009]上述的一種能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的制備方法，是將上述的菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間48~72h，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml即為成品備用；液體培養(yǎng)基:為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀
1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無(wú)菌水、pH值6.4±0.2。
[0010]上述的一種能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌的應(yīng)用方法，是應(yīng)用該菌株的菌液，杉木苗木栽植前期蘸根和用于杉木林地澆根。
[0011]上述的一種能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌的應(yīng)用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株100mL在林地澆于每株杉木的根際。
[0012]上述的一種能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌的應(yīng)用方法，是應(yīng)用該菌株的菌液
5.0X105cfu/ml在杉木水培苗栽植前將苗蘸根IOmin。
[0013]本發(fā)明涉及的菌株是從杉木植株中分離純化得到的，經(jīng)接種于杉木組培苗，
根據(jù)光合作用的各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)判，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)植株生長(zhǎng)具有促進(jìn)光合效能的作
用，尋找到對(duì)促進(jìn)植株生長(zhǎng)的有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生產(chǎn)。通過接種后植株的測(cè)定試驗(yàn)，得出植株的葉綠素含量以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)表現(xiàn)均優(yōu)于對(duì)照，且澆根的接種方式優(yōu)于淋冠，表明其對(duì)于杉木光合作用具有很大提高作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為內(nèi)生真菌AJ4對(duì)杉木幼苗葉綠素含量的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0015]一株能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌，菌種命名為AJ4，分類命名:刺盤孢(.ColIetotrichumsp.)，其保藏編號(hào):CGMCC N0.9227，保藏日期:2014年5月20日，保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0016]I水培繁殖中的應(yīng)用
取配制好的上述內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液，制成5.0X105cfu/ml菌液，在組培苗栽植前蘸根IOmin0可提高植苗成活率10%以上。[0017]2根際土壤澆施應(yīng)用
本試驗(yàn)采用土培盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)所用杉木幼苗為福建省林科院提供的杉木組培苗。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的苗木于2013年5月定植于直徑15cm，高IOcm的塑料盆中。所用土壤是嚴(yán)格經(jīng)過熏蒸消毒的黃心土。經(jīng)過稱量，每盆放入等量的3kg 土壤。經(jīng)過兩個(gè)月的恢復(fù)性生長(zhǎng)，連續(xù)三天(7月5日、7月6日和7月7日)分別于杉木根際(R)和樹冠(G)施入相同濃度的IOOmL菌液。利用上述試驗(yàn)獲得的共5個(gè)優(yōu)勢(shì)菌種，每種菌液4個(gè)重復(fù)，用蒸餾水作為空白對(duì)照。接種60天后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。
[0018]菌液制備:將供試菌株接入50mL的液體培養(yǎng)基，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72h的培養(yǎng)。用無(wú)菌生理鹽水按十倍稀釋法將菌液稀釋，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度配制成
5.5X106cfu/mL。
[0019]2.1葉綠素含量測(cè)定
葉綠素含量測(cè)定參考張憲政(1986) [12]的方法，采用丙酮乙醇提取法。取相近位置葉片，洗凈并吸干水分后，準(zhǔn)確稱取0.1g鮮葉放入小試管中，加混合液(丙酮:乙醇=l:l)10mL蓋塞。在室溫下暗處提取12h后去清液分別在663nm和645nm下測(cè)定光吸收值。
[0020]結(jié)果計(jì)算:
【權(quán)利要求】
1.一株能提高杉木光合作用的內(nèi)生真菌，其特征在于:所述內(nèi)生真菌為刺盤孢(JJolletotrichumsp.) AJ4,已于2014年5月20日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCCN0.9227。
2.一種如權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌的應(yīng)用菌液，其特征在于:所述應(yīng)用菌液的制備方法，是將所述的刺盤孢(CoBeioiricAwffiS/?.) AJ4接入液體培養(yǎng)基,搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間48~72h，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml，備用；液體培養(yǎng)基:為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無(wú)菌水、pH值 6.4±0.2。
3.—種如權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌的用途，其特征在于:應(yīng)用該菌株的菌液，杉木苗木栽植前期蘸根和用于杉木林地澆根。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK104004664SQ201410245645
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】徐彩瑤, 吳承禎, 謝安強(qiáng), 洪偉, 洪滔 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)