一種用于檢測二型糖尿病風險的SNPs引物及其應用的制作方法
【專利摘要】一種用于檢測二型糖尿病風險的SNPs引物及其應用,包含CDK5調(diào)節(jié)亞基相關蛋白1類似物1SNPrs7756992，電壓門控鉀通道的KQT類亞家族成員1SNPrs2237892，胰島素樣生長因子2mRNA結合蛋白SNPrs4402960三種SNPs的引物.通過使用本發(fā)明的引物組合檢測DNA中這三種單核苷酸多態(tài)性的存在可以判斷出高風險人群，從而幫助他們調(diào)節(jié)生活習慣，降低患二型糖尿病的風險，同時定時監(jiān)控，提早發(fā)現(xiàn)二型糖尿病癥狀，有益治療。
【專利說明】-種用于檢測二型糖尿病風險的SNPs引物及其應用 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于生物領域，涉及一種用于檢測二型糖尿病風險的SNPs引物及其應用。 【背景技術】
[0002] 二型糖尿病是糖尿病中最常見的，其主要癥狀有高血糖，不同程度的胰島素抵抗， 和胰島素分泌功能受損。二型糖尿病會給患者帶來各種生活不便，例如口渴，無力，視力下 降等。血液中過高的血糖濃度對血管和器官會造成傷害，引起各種并發(fā)癥，對患者造成較大 痛苦。其發(fā)病原因中有環(huán)境因素，生活方式因素，年齡因素等，基因也是其中一個重要原因。
[0003] 目前糖尿病的確定診斷以血糖水平為依據(jù)。但是等到血糖水平異常升高到確診標 準時，往往為時已晚。作為一種慢性代謝性紊亂病癥，二型糖尿病也是長期內(nèi)分泌失調(diào)的結 果，其發(fā)病過程中伴隨著一系列的激素異常，而此類異常往往發(fā)生在血糖異常出現(xiàn)之前。發(fā) 掘早于血糖指標的早期指標能為預防和治療糖尿病爭取寶貴的時間，也因此成為對抗糖尿 病的關鍵。
[0004] SNP 全稱為 Single-nucleotide polymorphism，單核昔酸多態(tài)性。SNPs 是最常見 的基因突變。每一個SNP代表一個核苷酸的不同。大多數(shù)時候SNPs出現(xiàn)在編碼基因之間， 這可以幫助研究人員定位編碼基因。但是，當SNP出現(xiàn)在編碼基因當中時有可能對基因的 功能造成一定影響。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，SNPs可以影響到一個人對藥物的反應,感染某些疾病 的可能性，比如，心臟病，癌癥和糖尿病。
[0005] 近年來，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種SNPs與二型糖尿病相關。不過，這些研究更多的是 針對歐美人種。在基于中國人遺傳背景的研究中，二型糖尿病相關SNP多以單個形式被報 道，并未建立起相關模型。由于二型糖尿病是一種慢性代謝紊亂癥，與多種蛋白質(zhì)功能失常 相關，以單個SNP來檢測二型糖尿病風險準確性偏低。為了彌補這一缺陷，通過同時檢測這 三種易感基因，本發(fā)明可以提供更加準確的個體化二型糖尿病患病的危險性評估，從而安 排具體干預措施，通過生活方式上的適度調(diào)整（增加每天的身體運動，同時削減熱量的攝 入）顯著地減少或者延緩糖尿病的發(fā)生，降低糖尿病治療成品。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 解決的技術問題：
[0007] 本發(fā)明主要目的是提供一種可以用于檢測二型糖尿病風險的SNPs引物組合。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供上述SNPs引物在制備檢測二型糖尿病風險的試劑盒上 的應用。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測二型糖尿病風險的試劑盒。
[〇〇1〇] 技術方案：
[0011] -種用于檢測_型糖尿病風險的SNPs引物，包含⑶K5調(diào)節(jié)亞基相關蛋白1 類似物1(CDKAL1)SNP rs7756992,電壓門控鉀通道的KQT類亞家族成員1(KCNQ1)SNP rs2237892,胰島素樣生長因子2mRNA結合蛋白（IGF2BP2) SNP rs4402960三種SNPs的引物。
[0012] 所述rs7756992 的引物如 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 所示；rs2237892 的引物 如 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 所示；rs4402960 的引物如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
[0013] 所述的用于檢測二型糖尿病風險的SNPs引物在制備檢測二型糖尿病風險的試劑 盒中的應用。
[0014] 一種用于檢測二型糖尿病風險的試劑盒，該試劑盒用于檢測DNA中CDK5調(diào)節(jié) 亞基相關蛋白1類似物1(⑶KAL1)SNP rs7756992,電壓門控鉀通道的KQT類亞家族成員 1(KCNQ1)SNP rs2237892,胰島素樣生長因子 2mRNA 結合蛋白（IGF2BP2)SNP rs4402960 三 種 SNPs。
[0015] 所述的用于檢測二型糖尿病風險的試劑盒，試劑盒中含有CDK5調(diào)節(jié)亞基相關蛋 白1類似物1 (CDKAL1) SNP rs7756992,電壓門控鉀通道的KQT類亞家族成員1 (KCNQ1) SNP rs2237892，胰島素樣生長因子2mRNA結合蛋白（IGF2BP2) SNP rs4402960三種SNPs的引物。
[0016] 所述的用于檢測二型糖尿病風險的試劑盒，試劑盒中含有rs7756992的引物如 SEQ ID N0. 13 和 SEQ ID N0. 14 所示；rs2237892 的引物如 SEQ ID N0. 15 和 SEQ ID N0. 16 所示；rs4402960 的引物如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
[0017] 所述的用于檢測二型糖尿病風險的試劑盒，該試劑盒還包括PCR反應中常用的酶 和/或試劑。
[0018] 本發(fā)明所述的SNPs引物篩選過程包括以下步驟（圖1)。
[0019] 1)建立統(tǒng)一標準的標本庫和數(shù)據(jù)庫：以標準操作程序（S0P)從醫(yī)院采集的血液樣 本，系統(tǒng)收集完整的人口學資料和臨床資料，患其他類型糖尿病患者不被包括在內(nèi)。
[0020] 2)根據(jù)現(xiàn)有文獻，篩選出11種二型糖尿病相關SNP鉀離子內(nèi)向整流通道蛋 白Jll (KCNJ11) SNP rs5219 (E23K變異），過氧化物酶體增殖物激活受體-γ (PPARG) SNP rsl801282(P12A變異），轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(TCF7L2)SNP rs7903146,胰島素樣生長因 子2mRNA結合蛋白（IGF2BP2)SNP rs4402960, CDK5調(diào)節(jié)亞基相關蛋白1類似物1 (CDKAL1) SNP rs7756992,鋅轉(zhuǎn)運蛋白 8(SLC30A8)SNP rsl3266634,同源框轉(zhuǎn)錄因子（HHEX)SNP rsllll875,肝細胞核因子1β (HNFIP)SNP rs4430796,電壓門控鉀通道的KQT類亞家族成 員 1(KCNQ1)SNP rs2237892, Wolfram 綜合征 I 型基因（WFSl)SNP rsl0010131，細胞周期蛋 白依賴性激酶抑制劑2B(CDKN2B) SNP rs 10811161進行分析。
[0021] 3)使用全血基因組DNA提取試劑盒（BioTeke，China)提取樣本中的DNA。
[0022] 4)根據(jù)發(fā)布的SNP序列設計引物并使用PCR Master Mix (Tiangen Biotech, China)提取相關 SNPs。
[0023] 5)提純聚合酶鏈反應產(chǎn)物，使用ABI PRISM3730xl(Applied Biosystems，California，USA)確定序列。并使用 Chromas software version2.0(Gene Codes Corporation, USA)分析所得結果。
[0024] 6)使用 SAS9. 2 (SAS Institute Inc.，Cary, NC, USA)進行數(shù)據(jù)分析，主要步驟如 下：
[0025] a)使用Chi-square test來分析比較二型糖尿病組與正常對照組的等位基因頻 率，p〈0. 05被視為差異有統(tǒng)計學意義。
[0026] b)精確檢驗的近似檢驗法被用于分析SNP的Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)〇
[0027] c)基于顯性模型，Logistic regression analysis被應用于每一個符合 Hardy-Weinberg equilibrium的SNP，ρ〈0· 05被視為差異有統(tǒng)計學意義。
[0028] d)基于多變量模型，multi-SNP logistic regression analysis被應用于每一個 符合Hardy-Weinberg equilibrium的SNP，ρ〈0· 05被視為差異有統(tǒng)計學意義。
[0029] e)根據(jù)以上結果篩選出在二型糖尿病患者和正常對照組中差異表達顯著的⑶Κ5 調(diào)節(jié)亞基相關蛋白1類似物1 (⑶KAL1)SNP rs7756992,電壓門控鉀通道的KQT類亞家族成 員 1(KCNQ1)SNP rs2237892,胰島素樣生長因子 2mRNA 結合蛋白（IGF2BP2)SNP rs4402960 三種SNPs。
[0030] 7)根據(jù)以上結果制備測試二型糖尿病風險試劑盒，該試劑盒包括以上三種SNPs 的引物，PCR反應中的常用試劑。
[0031] 有益效果：
[0032] 隨著生活方式和飲食結構的改變，糖尿病作為一種慢性常見病越來越成為危害身 體健康的主要疾病。目前，我國成年人的發(fā)病率已高達10%，患者超過1億，其發(fā)病速度增 長迅猛，已在過去的六年翻了兩番。而且糖尿病的未診斷率高達60%。農(nóng)村的未診斷率更 高達到70%，中國的糖尿病患者大部分￠000-7000萬）沒有被發(fā)現(xiàn)和診斷。
[0033] 因此，糖尿病的預防與治療越發(fā)重要。早期基因篩查是目前國際上被廣泛應用的 預防方法之一。本發(fā)明的試劑盒可以對血糖正常的成年人甚至是嬰兒進行二型糖尿病的 早期基因篩查，無需空腹測血糖，也無需其家族史和BMI測量值，實現(xiàn)了對二型糖尿病的快 速可靠的大面積早期篩查，是預防像糖尿病這種目前還無法治愈的慢性疾病的里程碑性突 破。
[0034] 與此同時，在基于中國人遺傳背景的研究中，二型糖尿病相關SNP多以單個形式 被報道，并未建立起相關模型。由于二型糖尿病是一種慢性代謝紊亂癥，與多種蛋白質(zhì)功能 失常相關，以單個SNP來檢測二型糖尿病風險準確性偏低。本發(fā)明所提供試劑盒可以支持 同時檢測多種二型糖尿病易感基因，大大提高了二型糖尿病患病的危險性評估的準確性。
[0035] 本發(fā)明在基于中國人遺傳背景的眾多二型糖尿病相關SNPs中篩選出三種關聯(lián) 性最高的SNPs，CDK5調(diào)節(jié)亞基相關蛋白1類似物1 (CDKALl)SNP rs7756992,電壓門控鉀 通道的KQT類亞家族成員1(KCNQ1)SNP rs2237892,胰島素樣生長因子2mRNA結合蛋白 (IGF2BP2)SNP rs4402960。在本發(fā)明的實驗中，使用dominant model分析SNPs與T2D的關 聯(lián)性時，rs7756992, rs2237892, rs4402960 的 Odds Ratio (0R)分別為 2. 0, 3. 09,1. 56。而使 用 multivariable model 分析 SNPs 與 T2D 的關聯(lián)性時，rs7756992, rs2237892, rs4402960 的 Odds Ratio (OR)分別為 2· 29,4· 22, L 76。
[0036] 本發(fā)明的試劑盒提供了更準確的，更快速的，更便利的早期基因篩查，可以大面積 應用檢測出二型糖尿病高風險人群，從而更有針對性地，效率更高地安排具體干預措施，通 過生活方式上的適度調(diào)整（增加每天的身體運動，同時削減熱量的攝入）顯著地減少或者 延緩糖尿病的發(fā)生，降低糖尿病治療成本。
[0037] 本發(fā)明的試劑盒可以對血糖正常的成年人甚至是嬰兒進行二型糖尿病的早期基 因篩查，無需空腹測血糖，也無需其家族史和BMI測量值，實現(xiàn)了對二型糖尿病的快速可靠 的大面積早期篩查，是預防像糖尿病這種目前還無法治愈的慢性疾病的里程碑性突破。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1為SNPs引物篩選與試劑盒的流程示意圖。 【具體實施方式】
[0039] 下面的實施例可使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本 發(fā)明。
[0040] 實施例1
[0041] 樣本的收集與整理：
[0042] 發(fā)明人于2011年5月至2012年4月間從寧波李惠利醫(yī)院收集了 222例二型糖尿 病患者和140正常對照組的血液樣本進行研究。
[0043] 使用全血基因組DNA提取試劑盒（BioTeke，China)提取DNA，具體步驟如下：
[0044] 1)在1. 5mL的微量離心管中加入900 μ L紅細胞裂解液。
[0045] 2)充分混合抗凝血液，加300 μ L到步驟1中的紅細胞裂解液。
[0046] 3)在室溫中靜置10分鐘。
[0047] 4)以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心20秒。小心去除紅色上清液，震蕩15秒。
[0048] 5)加入300 μ L核裂解液，快速強力地彈動幾下離心管。
[0049] 6)加入30 μ g/mL的RNase Α，充分混合，在37°C中孵育15分鐘，然后靜置至室溫。
[0050] 7)加入100 μ L蛋白質(zhì)沉淀緩沖液，震蕩20-25秒。
[0051] 8)以13000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。
[0052] 9)轉(zhuǎn)移上清液（大約300 μ L)到一個新的1. 5mL的微量離心管中。
[0053] 10)加入同樣體積的異丙醇，輕柔翻轉(zhuǎn)30次，直到一些白色絲狀DNA沉淀出現(xiàn)。
[0054] 11)去除上清液，保留DNA沉淀。
[0055] 12)加入lmL70%乙醇并混合。以13000rpm轉(zhuǎn)速離心1分鐘，去除上清液。
[0056] 13)加入0. 5mL70%乙醇并混合。以12000rpm轉(zhuǎn)速離心1分鐘，去除上清液，在空 氣中自然晾干幾分鐘。
[0057] 14)加入100 μ L DNA溶解液，輕敲離心管來混合，在65°C中孵育30-60分鐘，然后 保持在4 C。
[0058] 使用PCR Master Mix (Tiangen Biotech,中國）提取相關SNP，具體步驟如下：
[0059] 1)取5yL上一步所得DNA溶解液，加入25yL雙蒸水，稍震蕩，離心。
[0060] 2)于超凈工作臺冰板上配置反應體系：25 μ L的PCR反應體系包括12. 5 μ L PCR Master Mix, 1 μ L 濃度為 10 μ m 的 upstream primer, luL 度為 10 μπι 的 downstream primer，2 μ L步所得稀釋DNA溶解液，8. 5 μ L蒸水，稍震蕩，離心。
[0061] 3)設置空白對照，包括 12.5yL PCR Master Mix，lyL濃度為 ΙΟμπι 的upstream primer, 1 μ L 濃度為 10 μ m 的 downstream primer, 10. 5 μ L 雙蒸水，稍震蕩，離心。
[0062] 4)定量PCR，在94°C下3min，然后進行30個熱循環(huán)：94°C下30s，55°C (根據(jù)不同 SNP引物設定不同溫度，見下表1)下30s，72°C下lmin，完成后在72°C下孵育5min。每一組 設置空白對照，以檢測過程中是否有污染。
[0063] 5)反應后，取5 μ L反應產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0064] 提純 PCR產(chǎn)物，使用 ABI PRISM3730xl (Applied Biosystems, California, USA)確 定序列。并使用 Chromas software version2.0 (Gene Codes Corporation, USA)分析所得 結果。
[0065] 使用 SAS9. 2 (SAS Institute Inc. , Cary, NC, USA)進行數(shù)據(jù)分析，主要步驟如下：
[0066] 1)使用Chi-square test來分析比較二型糖尿病組與正常對照組的等位基因頻 率，p〈0. 05被視為差異有統(tǒng)計學意義。
[0067] 2)精確檢驗的近似檢驗法被用于分析SNP的Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)〇
[0068] 3)基于顯性模型，Logistic regression analysis被應用于每一個符合 Hardy-Weinberg equilibrium的SNP，ρ〈0· 05被視為差異有統(tǒng)計學意義。
[0069] 4)基于多變量模型，multi-SNP logistic regression analysis被應用于每一個 符合Hardy-Weinberg equilibrium的SNP，ρ〈0· 05被視為差異有統(tǒng)計學意義。
[0070] 依據(jù)以上數(shù)據(jù)分析結果（表2,表3,表4)篩選出針對中國人遺傳背景的二型糖尿 病易感基因，根據(jù)序列結果設計易感基因 PCR引物并制備試劑盒。
[0071] 應用試劑盒：根據(jù)以上步驟，提取血樣中的DNA，使用PCR提取相關SNPs并使用瓊 脂糖膠電泳檢測，確定二型糖尿病易感基因的存在。
[0072] 表1 :所用寡核苷酸引物
[0073]
【權利要求】
1. 一種用于檢測二型糖尿病風險的SNPs引物，其特征在于包含CDK5調(diào)節(jié)亞基相關蛋 白1類似物1 SNP rs7756992,電壓門控鉀通道的KQT類亞家族成員1 SNP rs2237892,胰 島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白SNP rs4402960三種SNPs的引物。
2. 根據(jù)權利要求1所述所述用于檢測二型糖尿病風險的SNPs引物，其特征在于所述 rs7756992 的引物如SEQIDN(λl3和SEQIDN(λl4所示；rs2237892 的引物如SEQID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 所示；rs4402960 的引物如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
3. 權利要求1或2所述的用于檢測二型糖尿病風險的SNPs引物在制備檢測二型糖尿 病風險的試劑盒中的應用。
4. 一種用于檢測二型糖尿病風險的試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測DNA中CDK5 調(diào)節(jié)亞基相關蛋白1類似物1 SNP rs7756992,電壓門控鉀通道的KQT類亞家族成員1 SNP rs2237892,胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白SNP rs4402960三種SNPs。
5. -種用于檢測二型糖尿病風險的試劑盒，其特征在于試劑盒中含有CDK5調(diào)節(jié) 亞基相關蛋白1類似物1 SNP rs7756992,電壓門控鉀通道的KQT類亞家族成員1 SNP rs2237892,胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白SNP rs4402960三種SNPs的引物。
6. 根據(jù)權利要求5所述的用于檢測二型糖尿病風險的試劑盒，其特征在于所述的用于 檢測二型糖尿病風險的試劑盒，試劑盒中含有rs7756992的引物如SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14 所示；rs2237892 的引物如 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 所示；rs4402960 的引物 如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
7. 權利要求4~6任一所述的用于檢測二型糖尿病風險的試劑盒，其特征在于該試劑盒 還包括PCR反應中常用的酶和/或試劑。
【文檔編號】C12N15/11GK104087658SQ201410243182
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權日:2014年6月3日
【發(fā)明者】劉寧生 申請人:南京醫(yī)科大學, 劉寧生