乳腺癌21基因聯(lián)合檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了乳腺癌21基因聯(lián)合檢測的試劑盒，本發(fā)明的PCR擴增引物由包括21對引物對所組成，可以聯(lián)合檢測21個基因相關(guān)表達量：Ki67,STK15,Survivin,CCNB1,MYBL2,MMP11,CTSL2,GRB7,HER2,GSTM1,CD68,BAG1,ER,PGR,BCL2,SCUBE2,ACTB,GAPDH,PRLPO,GUS,TFRC。本發(fā)明所涉及的21對引物產(chǎn)出片段都小于100bp，大大提高了石蠟標(biāo)本提取mRNA逆轉(zhuǎn)錄后PCR的效率；預(yù)混了21基因的所有引物，省去了實驗者設(shè)計和合成21對基因的時間和精力；無需再添加21基因的相應(yīng)引物，預(yù)混在母液中大大減小了反應(yīng)孔的誤差。本試劑盒操作簡單，只需加入模板就能在定量PCR儀上檢測，大大縮短了檢測實驗時間。本發(fā)明適用于單樣品和多樣品，都能快速得到結(jié)果，能很好的滿足科研和臨床檢測需求。
【專利說明】乳腺癌21基因聯(lián)合檢測試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種試劑盒，具體為一種針對乳腺癌21基因聯(lián)合檢測的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]近幾年來，隨著基因組學(xué)的研究深入，針對雌激素受體陽性患者的“21基因檢測” (Oncotype Dx)已經(jīng)被證實比臨床病理學(xué)指標(biāo)更能準(zhǔn)確預(yù)測雌激素受體陽性、腋下淋巴結(jié)陰性且降低服用他莫昔芬患者的遠處轉(zhuǎn)移風(fēng)險。該檢測是唯一由美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)和美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南聯(lián)合推薦的多基因檢測。這21個基因包括16個腫瘤相關(guān)基因及5個參考基因。其中腫瘤相關(guān)基因包括:增殖相關(guān)基因(K1-67、STK15、Survivin>Cyclin B1、MYBL2)、侵襲相關(guān)基因(Stromelysin3、Cathepsin L2)、Her-2 相關(guān)基因(GRB7、Her-2)、激素相關(guān)基因(ER、PR、Bcl_2、SCUBE2)、GSTM1、BAG1、CD68。而 5 個參考基因則為 Beta-actin、GAPDH、RPLPO,⑶S 和 TFRC。
[0003]而目前21基因的檢測主要是是通過從病人的石蠟標(biāo)本中提取mRNA后進行RT-QPCR的方法來檢測各個基因的表達再量化為復(fù)發(fā)風(fēng)險評分(RS)。在檢測實驗時，一個real time PCR反應(yīng)體系中引物的用量極少不到I μ I。而PCR反應(yīng)本身就是靈敏度極高的實驗，如此多的基因配成反應(yīng)孔在檢測實驗操作時極易產(chǎn)生誤差，且操作過程繁瑣耗時多。如何能得到相應(yīng)基因的精確CT值及能減少實驗時間和減小實驗誤差成了亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服上述存在的問題和技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種快速有效的乳腺癌21基因聯(lián)合檢測試劑盒，其能很好的滿足科研和臨床檢測需求。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案:
[0006]一種乳腺癌21基因聯(lián)合檢測試劑盒，其特征是21個基因為Ki67，STK15, Survivin, CCNB I, MYBL2, MMPl I, CTSL2, GRB7, HER2, GSTM1, CD68, BAG I, ER, PGR, BCL2, SCUBE2, ACTB, GAPDH, PRLPO,⑶S, TFRC ；
[0007]所述試劑盒包括以下擴增21個基因的引物對:
[0008]引物對l:K1-67:
[0009]F:5， CTCCACAGTCAGACCCAG 3，
[0010]R:5， GCACGCTAAGAGTTCTCC 3，；
[0011]引物對2:STK15:
[0012]F:5’ AGGCTCAGCGGGTCTTGT 3’
[0013]R:5’ AACCGGCTTGTGACTGGA 3’ ；
[0014]引物對3:Survivin:
[0015]F:5’ TACGCCTGTAATACCAGCAC 3’
[0016]R:5， AAGCGCAACCGGACGAAT 3，；[0017]引物對4:CyclinBl:
[0018]F ; 5，CGGGAAGTCACTGGAAAC 3，
[0019]R:5， CTCCTGCAACAACCTGAA 3’ ；
[0020]引物對5:MYBL2:
[0021]F:5， AGGGAGGACAGACAATGCT 3’
[0022]R:5， CTTTGGACTCGCTCAAGAA 3，；
[0023]引物對6:MMP11:
[0024]F:5’ GGTGGCAGCCCATGAATT 3’
[0025]R:5’ GGTAGCGAAAGGTGTAGAAGG 3’ ；
[0026]引物對7:CTSL2: [0027]F:5， TACAGCCAAGGGAAACAT 3，
[0028]R:5’ GAAAGCAACCCATCATCT 3’ ；
[0029]引物對8:GRB7:
[0030]F:5’ CCCACTGACTTCGGTTTCT 3’
[0031]R:5’ GTGCGGCTCTGCTCATCT 3’ ；
[0032]引物對9: HER2:
[0033]F:5’ GAGTCCATGCCCAATCCC 3’
[0034]R:5， CCCACGTCCGTAGAAAGGT 3，；
[0035]引物對10:ER:
[0036]F:5’ TGCCAAGGAGACTCGCTAC 3’
[0037]R:5， AGCCCTCACAGGACCAGA 3 ；
[0038]引物對11:PGR:
[0039]F:5’ GCTGCGGTGGAGGTTGAGGA 3’
[0040]R:5’ ACCCAGAGCCCGAGGTTTGC 3’ ；
[0041]引物對12:BCL2，:
[0042]F:5’ CTTCGCCGAGATGTCCAG 3’
[0043]R:5’ CCAGTTCACCCCGTCCCT 3’ ；
[0044]引物對13:SCUBE2:
[0045]F:5’ ATGGGAGGAGCTGCCTTGA 3’
[0046]R:5’ CGCCGTTTCACCCGTTTA 3’ ；
[0047]引物對14:GSTM1:
[0048]F:5’ GACGCTCCTGATTATGACA 3’
[0049]R:5’ TCAAGTAGGGCAGATTGG 3’ ；
[0050]引物對15:BAG1:
[0051]F:5’ ATCTTGGAGGAGATTGACA 3’
[0052]R:5’ AGGAATGCCTGAACCTTT 3’ ；
[0053]引物對I6: CD68:
[0054]F:5’ CTTTGCTGCCATCCTTCA 3’
[0055]R:5’ TTGTGGCTCTTGGTAGTCC 3’ ；[0056]引物對17:ACTB:
[0057]F:5’ TTCCAGCCTTCCTTCCTG 3’
[0058]R:5’ CTTTGCGGATGTCCACGT 3’ ；
[0059]引物對18:GAPDH:
[0060]F:5’ ATCATCAGCAATGCCTCC 3’
[0061]R:5’ TCCTTCCACGATACCAAAG 3’ ；
[0062]引物對19:PRLP0:
[0063]F:5’ GGTCATCCAGCAGGTGTT 3’
[0064]R:5’ CCTCCAGGAAGCGAGAAT 3’ ；
[0065]引物對20:⑶S:
[0066]F:5’ CCACGGTGTCAACAAGCA 3’
[0067]R:5， ACCAAGCCAGCGAAGCAG 3，；
[0068]引物對21:TFRC:
[0069]F:5’ CACCATCTCGGTCATCAG 3’
[0070]R: 5’ TCCATATTCCCAAACAGC 3’。
[0071]本發(fā)明還提供了乳腺癌21基因聯(lián)合檢測試劑盒的制備方法，步驟如下:
[0072](I) 21對基因引物的設(shè)計和合成:根據(jù)primerf設(shè)計引物，目的片段都小于lOObp，大大保證了石蠟標(biāo)本mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的PCR效率，21對基因引物由如下序列表中SEQ IDNO:1-SEQIDNO:21所組成的引物對所組成:
[0073]增殖相關(guān)基因(K1-67、STK15、Survivin、CyclinB1、MYBL2)
[0074]引物對l:K1-67:
[0075]F:5’ CTCCACAGTCAGACCCAG 3’
[0076]R:5， GCACGCTAAGAGTTCTCC 3，；
[0077]引物對2:STK15:
[0078]F:5’ AGGCTCAGCGGGTCTTGT 3’
[0079]R:5’ AACCGGCTTGTGACTGGA 3’ ；
[0080]引物對3:Survivin:
[0081]F:5’ TACGCCTGTAATACCAGCAC 3’
[0082]R:5， AAGCGCAACCGGACGAAT 3，；
[0083]引物對4:CyclinBl:
[0084]F:5， CGGGAAGTCACTGGAAAC 3，
[0085]R:5’ CTCCTGCAACAACCTGAA 3’ ；
[0086]引物對5:MYBL2:
[0087]F:5’ AGGGAGGACAGACAATGCT 3’
[0088]R:5’ CTTTGGACTCGCTCAAGAA 3，；
[0089]侵襲相關(guān)基因(Stromelysin3、CathepsinL2)
[0090]引物對6:Stromelysin-3 (MMPll):
[0091]F:5， GGTGGCAGCCCATGAATT 3，
[0092]R:5’ GGTAGCGAAAGGTGTAGAAGG 3，；[0093]引物對7 =Cathepsin L2 (CTSL2):
[0094]F:5’ TACAGCCAAGGGAAACAT 3’
[0095]R:5’ GAAAGCAACCCATCATCT 3，；
[0096]Her-2 相關(guān)基因(GRB7、HER2)
[0097]引物對8:GRB7:
[0098]F:5’ CCCACTGACTTCGGTTTCT 3’
[0099]R:5’ GTGCGGCTCTGCTCATCT 3，；
[0100]引物對9:HER2:
[0101]F:5’ GAGTCCATGCCCAATCCC 3’
[0102]R:5， CCCACGTCCGTAGAAAGGT 3，；
[0103]激素相關(guān)基因(ER、PR、Bcl_2、SCUBE2)
[0104]引物對10:ER:
[0105]F:5’ TGCCAAGGAGACTCGCTAC 3’
[0106]R:5， AGCCCTCACAGGACCAGA 3 ；
[0107]引物對11:PGR: [0108]F:5’ GCTGCGGTGGAGGTTGAGGA 3’
[0109]R:5’ ACCCAGAGCCCGAGGTTTGC 3，；
[0110]引物對12:BCL2，:
[0111]F:5’ CTTCGCCGAGATGTCCAG 3’
[0112]R:5’ CCAGTTCACCCCGTCCCT 3，；
[0113]引物對13:SCUBE2:
[0114]F:5’ ATGGGAGGAGCTGCCTTGA 3’
[0115]R:5’ CGCCGTTTCACCCGTTTA 3’ ；
[0116]其它(GSTM1、BAG1、CD68)
[0117]引物對14:GSTM1:
[0118]F:5’ GACGCTCCTGATTATGACA 3’
[0119]R:5， TCAAGTAGGGCAGATTGG 3，；
[0120]引物對15:BAG1:
[0121]F:5’ ATCTTGGAGGAGATTGACA 3’
[0122]R:5’ AGGAATGCCTGAACCTTT 3，；
[0123]引物對16:CD68:
[0124]F:5’ CTTTGCTGCCATCCTTCA 3’
[0125]R:5’ TTGTGGCTCTTGGTAGTCC 3’ ；
[0126]參考相關(guān)基因(ACTB、GAPDH、RPLPO、⑶S、TFRC)
[0127]引物對17:ACTB:
[0128]F:5’ TTCCAGCCTTCCTTCCTG 3’
[0129]R:5’ CTTTGCGGATGTCCACGT 3，；
[0130]引物對18:GAPDH:
[0131]F:5’ ATCATCAGCAATGCCTCC 3’[0132]R:5’ TCCTTCCACGATACCAAAG 3，；
[0133]引物對19: RPLPO:
[0134]F:5’ GGTCATCCAGCAGGTGTT 3’
[0135]R:5’ CCTCCAGGAAGCGAGAAT 3，；
[0136]引物對20:⑶S:
[0137]F:5’ CCACGGTGTCAACAAGCA 3’
[0138]R:5’ ACCAAGCCAGCGAAGCAG 3，；
[0139]引物對21:TFRC:
[0140]F:5’ CACCATCTCGGTCATCAG 3’
[0141]R:5’ TCCATATTCCCAAACAGC 3，；
[0142]以上引物均由上海生工生物公司合成；
[0143](2)預(yù)混液的配制:在普通熒光定量PCR試劑盒的基礎(chǔ)上引入這21對引物；制成每個引物對應(yīng)的21管一定劑量反應(yīng)預(yù)混液，包含定量PCR反應(yīng)所需的全部組分和引物，制成成品反應(yīng)液。成品反應(yīng)液中米用熱 啟動性質(zhì)的聞純度DNA聚合酶,保證特異性。引物在低溫都能保存很長時間且較穩(wěn)定。因此只要加入模板就能直接在熒光定量PCR儀上檢測，大大加速實驗的進程且避免了逐個去配制各基因的反應(yīng)液時的誤差；
[0144](3)根據(jù)單個樣品檢測時所需反應(yīng)液的量的比例，計算出檢測100份樣品所需的預(yù)混液用量，配制到一個可以封閉的棕色管子中，混勻，保存，即得本發(fā)明的試劑盒；
[0145](4)試劑盒中成品反應(yīng)液的性能檢測:將上述配制好的試劑盒儲存在一定條件下，在即時，I天，I周，I個月，2個月，3個月的時間段用同一模板來做定量PCR，將得到的CT值算出RS值，統(tǒng)計每次的結(jié)果是否有差異性。
[0146]本發(fā)明有益的效果是:
[0147]1、本發(fā)明所涉及的21對引物產(chǎn)出片段都小于lOObp，大大提高了石蠟標(biāo)本提取mRNA逆轉(zhuǎn)錄后PCR的效率。
[0148]2、該發(fā)明預(yù)混了 21基因的所有引物，省去了實驗者設(shè)計和合成21對基因的時間和精力。
[0149]3、本試劑盒操作簡單，只需加入模板就能在定量PCR儀上檢測，將大大縮短了檢測實驗時間
[0150]4、本試劑盒無需再添加21基因的相應(yīng)引物，成品反應(yīng)液中已包含，大大減小了反應(yīng)孔的誤差
[0151]5、本發(fā)明適用于單樣品和多樣品，都能快速得到結(jié)果，能很好的滿足科研和臨床檢測需求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0152]圖1:石蠟標(biāo)本樣品1、2、3，提取得到的RNA電泳圖。
[0153]圖2:成品反應(yīng)液性能檢測。成品反應(yīng)液制成后即時檢測樣品I統(tǒng)計分析的RS值。檢測結(jié)果高風(fēng)險:RS > 31。
[0154]圖3:成品反應(yīng)液性能檢測。成品反應(yīng)液制成保存I天后檢測樣品I統(tǒng)計分析的RS值。檢測結(jié)果高風(fēng)險:RS > 31。[0155]圖4:成品反應(yīng)液性能檢測。成品反應(yīng)液制成保存I周后檢測樣品I統(tǒng)計分析的RS值。檢測結(jié)果高風(fēng)險:RS > 31。
[0156]圖5:成品反應(yīng)液性能檢測。成品反應(yīng)液制成保存I月后檢測樣品I統(tǒng)計分析的RS值。檢測結(jié)果高風(fēng)險:RS > 31。
[0157]圖6:成品反應(yīng)液性能檢測。成品反應(yīng)液制成保存2月后檢測樣品I統(tǒng)計分析的RS值。檢測結(jié)果高風(fēng)險:RS > 31。
[0158]圖7:成品反應(yīng)液性能檢測。成品反應(yīng)液制成保存3月后檢測樣品I統(tǒng)計分析的RS值。檢測結(jié)果高風(fēng)險:RS > 31。
[0159]圖8:成品反應(yīng)液性能檢測。成品反應(yīng)液檢測樣品2統(tǒng)計分析的RS值。檢測結(jié)果中風(fēng)險:18 < RS < 31。
[0160]圖9:成品反應(yīng)液性能檢測。成品反應(yīng)液檢測樣品3統(tǒng)計分析的RS值。檢測結(jié)果低風(fēng)險:RS < 18。
【具體實施方式】 [0161]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合舉例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的舉例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0162]本發(fā)明在普通的熒光定量PCR試劑盒的基礎(chǔ)上，加入已知的21個基因的引物，預(yù)混成21管反應(yīng)液。每個基因引物對應(yīng)相應(yīng)的預(yù)混液管，并標(biāo)明。再進行預(yù)混液性能檢測。具體步驟如下:
[0163](I)志愿者乳腺癌石蠟標(biāo)本mRNA的提取，分別得到樣品1、2、3:(采用QIAGEN公司RNeasy? FFPE Kit)
[0164]1.首先用刀片，修剪蠟塊。
[0165]2.在石蠟切片機上切成蠟片5 μ m，取5~10張。
[0166]3.馬上把組織片放入到1.5ml EP管中，蓋上蓋子。
[0167]4.加入1ml 二甲苯脫臘,鏇潤振蕩10s, 1000Orpm,離心8min。
[0168]5.離心棄去二甲苯，加入無水乙醇洗脫。如果脫蠟還沒有完全，再加入二甲苯重復(fù)上面的步驟。
[0169]6.加入240 μ I Buffer PKD，漩渦振蕩。加入10 μ I的蛋白酶K，輕柔上下顛倒
[0170]7.在 56°C孵育 15min,然后 80°C孵育 15min。
[0171]8.轉(zhuǎn)移液體到一個新的2ml離心管中。
[0172]9.在冰上孵育 3min。13500rpm 離心 15min。
[0173]10.將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，不要碰到下面的沉淀。
[0174]11.加入 1/10 上清液體積的 DNase Booster Buffer,然后加入 10 μ I DNase I 原液。顛倒管子，離心，使壁上的液體至底部。
[0175]12.室溫放置 15min。
[0176]13.加入 320 μ I Buffer RBC,徹底混合溶解。
[0177]14.加入1200 μ I無水乙醇，立即進行下一步。
[0178]15.吸出700 μ I的樣品，包括沉淀物，移到一個RNeasy MinElute spin column套在2ml EP離心管上，蓋上蓋子，^ 1000Orpm,離心15s。
[0179]16.重復(fù) 17,直到全部的樣品都穿過了 RNeasyMinElute spin column。
[0180]17.加入 500 μ I 的 Buffer RPE 到 RNeasy MinElute spin column 中，蓋上蓋子，≥1000Orpm,離心15s,倒去廢液。
[0181]18.加入 500 μ I 的 Buffer RPE 到 RNeasy MinElute spin column 中，蓋上蓋子，≥1000Orpm,離心2min,洗膜,倒去廢液
[0182]19.將RNeasy MinElute spin column放到一個新的2ml離心管中，打開蓋子,離心5min。倒去廢液。
[0183]20.再將 RNeasy MinElute spin column 放到一個新的 1.5ml EP 管中。加入 14 -30 μ I RNase-free water,正好布滿膜上。蓋上蓋子,離心Imin,洗提RNA。(電泳結(jié)果見圖1)
[0184](2)將提取好的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA: (TaKaRa試劑盒DRR047A)
[0185]A:基因組DNA的去除反應(yīng)
【權(quán)利要求】
1.一種乳腺癌21基因聯(lián)合檢測試劑盒，其特征是21個基因為Ki67，STK15, Survivin,CCNB I, MYBL2, MMPl 1，CTSL2, GRB7, HER2, GSTMl, CD68, BAG I, ER, PGR, BCL2, SCUBE2,ACTB, GAPDH, PRLPO,⑶S，TFRC ； 所述試劑盒包括以下擴增21個基因的引物對: 引物對I:K1-67:
F: 5， CTCCACAGTCAGACCCAG 3，
R: 5， GCACGCTAAGAGTTCTCC 3，； 引物對2:STK15:
F: 5’ AGGCTCAGCGGGTCTTGT 3’
R: 5’ AACCGGCTTGTGACTGGA 3’ ； 引物對 3:Survivin:
F: 5’ TACGCCTGTAATACCAGCAC 3’
R: 5， AAGCGCAACCGGACGAAT 3，； 引物對 4 =Cycl inBl:
F; 5， CGGGAAGTCACTGGAAAC 3，
R: 5’ CTCCTGCAACAACCTGAA 3，； 引物對5:MYBL2:
F: 5， AGGGAGGACAGACAATGCT 3，
R: 5， CTTTGGACTCGCTCAAGAA 3，； 引物對6:MMP11:
F: 5， GGTGGCAGCCCATGAATT 3，
R: 5， GGTAGCGAAAGGTGTAGAAGG 3，； 引物對7: CTSL2:
F: 5， TACAGCCAAGGGAAACAT 3，
R: 5， GAAAGCAACCCATCATCT 3，； 引物對8:GRB7:
F: 5’ CCCACTGACTTCGGTTTCT 3’
R: 5’ GTGCGGCTCTGCTCATCT 3’ ； 引物對9:HER2:
F: 5’ GAGTCCATGCCCAATCCC 3’
R: 5， CCCACGTCCGTAGAAAGGT 3，； 引物對10:ER:
F: 5， TGCCAAGGAGACTCGCTAC 3，
R: 5， AGCCCTCACAGGACCAGA 3 ； 引物對11:PGR:
F: 5’ GCTGCGGTGGAGGTTGAGGA 3’
R: 5’ ACCCAGAGCCCGAGGTTTGC 3’ ； 引物對12:BCL2，:
F: 5’ CTTCGCCGAGATGTCCAG 3’R: 5’ CCAGTTCACCCCGTCCCT 3’ ；
引物對 13:SCUBE2:
F: 5’ ATGGGAGGAGCTGCCTTGA 3’
R: 5’ CGCCGTTTCACCCGTTTA 3’ ； 引物對14 =GSTMl:
F: 5’ GACGCTCCTGATTATGACA 3’
R: 5， TCAAGTAGGGCAGATTGG 3，； 引物對15 =BAGl:
F: 5’ ATCTTGGAGGAGATTGACA 3’
R: 5’ AGGAATGCCTGAACCTTT 3’ ； 引物對16:CD68:
F: 5’ CTTTGCTGCCATCCTTCA 3’
R: 5’ TTGTGGCTCTTGGTAGTCC 3’ ； 引物對17 =ACTB:
F: 5’ TTCCAGCCTTCCTTCCTG 3’
R: 5’ CTTTGCGGATGTCCACGT 3’ ； 引物對18:GAPDH:
F: 5’ ATCATCAGCAATGCCTCC 3’
R: 5’ TCCTTCCACGATACCAAAG 3’ ； 引物對19:PRLPO:
F: 5’ GGTCATCCAGCAGGTGTT 3’
R: 5， CCTCCAGGAAGCGAGAAT 3，； 引物對20:⑶S:
F: 5， CCACGGTGTCAACAAGCA 3，
R: 5， ACCAAGCCAGCGAAGCAG 3，；
引物對21 =TFRC:
F: 5， CACCATCTCGGTCATCAG 3，
R: 5’ TCCATATTCCCAAACAGC 3’ 。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是，所述試劑盒的制備方法包括以下步驟: (O預(yù)混液的配制:在普通熒光定量PCR試劑盒的基礎(chǔ)上引入這21對引物，制成每個引物對應(yīng)的21管一定劑量反應(yīng)預(yù)混液，包含定量PCR反應(yīng)所需的全部組分和引物，制成成品反應(yīng)液，成品反應(yīng)液中采用熱啟動性質(zhì)的高純度DNA聚合酶； (2)根據(jù)單個樣品檢測時所需反應(yīng)液的量的比例，計算出檢測100份樣品所需的預(yù)混液用量，配制到一個可以封閉的棕色管子中，混勻，保存，即得所述試劑盒； (3)試劑盒中成品反應(yīng)液的性能檢測:將上述配制好的試劑盒儲存在一定條件下，在即時，I天，I周，I個月，2個月，3個月的時間段用同一模板來做定量PCR，將得到的CT值算出RS值，統(tǒng)計每次的結(jié)果是否有差異性。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004844SQ201410238140
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】陳偉 申請人:杭州美中疾病基因研究院有限公司