提高大腸桿菌耐鹽性的基因GhASS1及其制備以及利用其編碼的蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于新基因的制備，特別是指一種提高大腸桿菌耐鹽性的基因GhASS1及其制備以及利用其編碼的蛋白。以5’-ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATG?GCTCAGTTCAAAG-3’為上游引物5ZWASS，以5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCCAC?TTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3’為下游引物3ZWASS，以棉花植株根中的RNA反轉(zhuǎn)錄所合成的cDNA為模板，采用PCR擴增方法獲得。本發(fā)明填補了現(xiàn)有技術存在的在植物中未見到精氨酸琥珀酸合成酶的相關分子生物學研究報道的空白。具有基因GhASS1在重組菌中的表達提高了重組菌在鹽脅迫下的生長活力，增強了菌株的耐鹽能力的優(yōu)點。
【專利說明】提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSI及其制備以及利用其 編碼的蛋白

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于新基因的制備，特別是指一種提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSI及 其制備以及利用其編碼的蛋白。

【背景技術】
[0002] 尿素循環(huán)（Urea Cycle)，又稱為鳥氨酸循環(huán)，是第一個被發(fā)現(xiàn)的環(huán)式代謝途徑。在 哺乳動物中，2分子氨（1分子氨是游離的，1分子氨來自天冬氨酸）和1分子C0 2生成1分子 尿素的環(huán)式代謝途徑，是氮代謝最終產(chǎn)物一尿素的生成過程，因此具有除去氨毒害作用。 此外，其不僅將氨和C0 2合成為尿素，而且生成一分子延胡索酸，使尿素循環(huán)與檸檬酸循環(huán) 聯(lián)系起來。肝臟是哺乳動物尿素合成的主要器官，在臨床實踐中，尿素循環(huán)的任何一個步驟 出問題都有可能產(chǎn)生疾病。如果完全缺乏尿素循環(huán)中的某一個酶，嬰兒在出生不久就昏迷 或死亡；如果部分缺乏，會引起智力發(fā)育遲滯、嗜睡和經(jīng)常嘔吐。
[0003] 尿素在植物體內(nèi)是尿素循環(huán)的一種主要代謝產(chǎn)物，在體外又是作物生產(chǎn)中被廣泛 使用的氮肥，但尿素循環(huán)在植物體內(nèi)的生理作用還不清楚。長期以來一般認為植物體內(nèi)尿 素循環(huán)的轉(zhuǎn)運活性低，其意義在于合成精氨酸。個別植物也可產(chǎn)生尿素，在脲酶作用下分解 產(chǎn)生氨，用以合成其他含氮化合物，包括核酸、激素、葉綠體、血紅素、胺、生物堿等。
[0004] 精氨酸琥拍酸合成酶（Argininosuccinate synthetase,簡稱ASS)或稱精氨酸琥 珀基合成酶，是一種從瓜氨酸及天冬氨酸催化合成精氨酸琥珀酸的酶（EC6. 3. 4. 5)。它負責 尿素循環(huán)中的第3個步驟及瓜氨酸-一氧化氮循環(huán)（Citrulline-Nitric Oxide Cycle)中 的一個反應。一般認為ASS為尿素循環(huán)或瓜氨酸-一氧化氮循環(huán)的限速酶。目前在植物中 還未見到相關分子生物學研究的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSI。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSI的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之三在于提供利用提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSI編碼的蛋 白。
[0008] 本發(fā)明的整體技術構(gòu)思是：
[0009] 提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSI，其序列如下：
[0010] ATTTCAGTGA AAGAAAAAAA AAATCGCTCA GTTCAAAGCC GTTTCACTCT CTTCGTCCAT TAATCTTGCA AGTTACCGTC CCAAAAGAAA TACATTGTTA CATTCCCATA ATTTGATCTG 丁TCTAGGAAG TTATCCACH TCCATGAGTT AACTCCAAAA TCTAGTTCGC TTCATGGTAA 丁GCTATTGTA AGCAACMTG TGTGTATGAC TCTMCACCT MGMTCMG GTATTCAMX 丁GTTCTTTCC AGCMCTCAG GGACGGATCT TTCCACACTT ACMAGGGTG GAGGGCTTCG AGGCAAATTA AACAAGCTTC TTTTACCCTA CACTCCCCGC TTACATACTT CTGTTATTGT 丁CCATGGCTA AGGGAGMTT ATGGTTGTCA GGTTGTFTCC TTCACTGCCG ATGHGGCCA AGGCATAAAA GAATTGCATG GTTTCCAAGC AAAGGCCAAG GCAAGCGGGG CTTGCCAGTT AGTAGTTAAG GACTTAAAGG AGGAATTTGT GAAAGACTAT ATATTTCCAT GCTTGCGAGC TGGTGCCATT TACGAGAGGA AATACTTCTT GGGAACCTCA ATGGCCAGGC CTGTTATTGC AAAGGCCATG GTGGATATTG CTAGACACGT TGGGGCTGAT GCCGTTTCTC ATGGATGCAC AGGGAAAGGA AATGATCAGG TTCGCTTTGA GCTCACCTTC TTTGCTCTAA GTCCGGAATT AAACGTTGTG GCTCCTTGGA CACAATGCGA TATTACAGGG AGAGAACATG CTATTGAATA 丁GCTAAGAAG CATAATGTGC CTGTTCCAGT GACAAAGAM TCMTATACA GCAGAGACAG GAACTTATGG CACTTGAGCC ACGAGCGAGA TATCTTGGAG GATCCAGCAA ATGAACCGAA GGAAGATATG TACATGATGA GTGTTCACCC GAAAGATGCT CCTGATAAAC CTCAATACGT GAAAATCGGA ATTGAATCAG GCATCCCTGT TTCACTTGAT GCAAAAACTT ATTTGCCGGC 丁GAACTTCTT GC丁ACACTCA ATGMATTGG TGGGMACAT GGGATTGGTC GTATTGACAT GGTTGAAAAT CGGCTCGTTG CTATGAAGAG TCGTGCGGTC TACGAAACTC CGGCTGGTAC CATCCTATTC AACGCCGTTC GTGAGCTGGA ATCTCTAACC CTTGACCGCG AAACCATTCA AGTTAAAGAT TCACTTGCCC TCAACTATGC GGAGTTAGTT TATGCAGGAA GGTGGTTCGA CCCACTTCGT GAATCCATGG ATGCATTTAT GGAGAAGATA ACTGAAACCA CCACTGGTTC CGTGACTTTG AAGCTATACA AAGGATCAGT TTCCGTAACT GGCCGGACCA GTGCTTATAG CTTGTACAGA GAGGATATCT CCTCCTTTGA GAGTGGAGAC ATATATAATC AAGCCGATGC TGCCGGATTT ATTCGGCTCT ATGGTCTTCC AATGAGGGTT AGGGCAATGC TTAACAAAGG TATCTAAGTC CTTTCTATTT TGTTTTTCAT TGTCTGGAAT TTCAAGGCTA Λ?ΤΤΛΤΛΤΛΤ TATCAATGCA CTAGTTTTCA TTCC"
[0011]
[0012] 提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSl的制備包括如下步驟：
[0013] 以 5 ' -ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3 ' 為上游引物 5ZWASS，以 5 ' -T TGCGGACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3 ' 為下游引物 3ZWASS，以棉花植株根 中的RNA反轉(zhuǎn)錄所合成的cDNA為模板，采用PCR擴增方法獲得。
[0014] 利用提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSl編碼的蛋白，其序列如下：
[0015] MET Ala Gin Phe Lys Ala Val Set Leu Ser Ser Ser lie Asn Leu Ala Ser Tyr Gly Pro Lys Arg Asn Thr Leu Leu His Ser Asp Asn Leu lie Cys Ser Arg Lys Leu Ser Thr Phe iis Giu Leu Ser Gly Lys Ser Ser Ser Leu His Gly Asn Ala lie Val Ser Asn Asn Val Cys MET Thr Leu Thr Pro Lys Asn Gin Gly Tie Gin Ala Val Leu Ser Ser Asn Ser Gly Thr Asp Val Ser Thr Val Thr Lys Gly Gly Gly Leu Arg Gly Lys Leu Asn Lys Val Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Ser Val lie Val Pro Trp Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Cys Ghi Val Val Cys Phe Thr Ala Asp Val Gly Gin Gly lie Lys Glu Leu Asp Gly Leu Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ser Gly Ala Cys Gin Leu Val Val Lys Asp Leu Lys Glu Glu Phe Val Lys Asp Tyr He Phe Pro Cys Leu Arg Ala Gly Ala lie Tyr Glu Arg Lys Tyr Leu Leu Gly Thr Ser MET Ala Arg Pro Val Tie Ala Lys Ala MET Val Asp lie Ala Arg Glu Val Cly Ala Asp Ala Val Ser His Cly Cys Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gin Val Arg Phe Glu Leu Thr Phe Phe Ala Leu Ser Pro Glu Leu Asn Val Val Ala Pro Trp Arg Glu Trp Asp lie Thr Gly Arg Glu Asp Ala Ile Glu Tyr Ala Lys Lys Hi s Asn Val Pro Va1 Pro Val 丁hr Lys Lys Ser lie Tyr Ser Arg Asp Arg Asn Leu Trp Hi s Leu Ser His Glu Gly Asp Tie Leu Glu Asp Pro Ala Asn Glu Pro Lys Glu Asp MET Tyr MET MET Ser Val Asp Pro Lys Asp Ala Pro Asp Lys Pro Gin Tyr Val Lys Tie Gly Tie Glu Ser Gly Tie Pro Val Ser Leu Asp Cly Lys Thr Tyr Leu Pro Ala Glu Leu Leu Ala Thr Leu Asn Clu He Cly Gly Lys His Gly He Gly Arg lie Asp MET Val Glu Asn Arg
[0016] Leu Vai Gly MET Lys Ser Arg Gly Val Tyr Glu Thr Pro Gly Gly Thr He Leu Phe Asn Ala Va1 Arg Glu Leu Glu Ser Leu Thr Leu Asp Arg Glu Thr lie Gin Va1 Lys Asp Ser Leu Ala Leu Lys Tyr Ala Glu Leu Val Tyr Ala Gly Arg Trp Fhe Asp Pro Leu Arg Glu Ser MET Asp Ala Phe MET Glu Lys He Thr Chi Thr Thr Thr Gly Ser Val Thr Leu Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Val Ser Val Thr Gly Arg Thr Ser Ala Tyr Ser Leu Tyr Arg Glu Asp lie Ser Ser Phe Glu Ser Gly Asp lie Tyr Asn Gin Ala Asp Ala Ala Gly Phe lie Arg Leu Tvr Gly Leu Pro MET Arg Val Arg Ala MET Leu Asn Lys Gly MET。
[0017] 本發(fā)明的具體技術內(nèi)容還有：
[0018] 提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSl的制備，其工藝步驟如下：
[0019] A、PCR反應模板的制備；
[0020] B、引物的制備；
[0021] C、基因 GhASSl全序列的擴增和克隆。
[0022] 所述的步驟A是選取新鮮棉花的根，在液氮中研磨成粉末狀，置于預先凍存在冰 上無 RNase的離心管中，提取棉花的根組織中的RNA，提取的RNA經(jīng)1 %瓊脂糖甲醛變性膠 電泳檢測，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于PCR反應的模板。
[0023] 所述的RNA提取采用Takara公司生產(chǎn)的總RNA提取試劑盒。
[0024] 所述的反轉(zhuǎn)錄包括如下工藝步驟：
[0025] a、向 RNase-free 離心管中加入 2μ gRNA，濃度為 0· 5μ g/μ 1 的 Oligo (1Τ182μ 1， DEPC-H207. 75 μ 1，在溫度70°C的條件下反應5分鐘后，迅速冰?。?br> [0026] b、向步驟a的溶液中加入以下反應液后制成混合液
[0027] 5 x緩沖液 5 μ 1 濃度為10mM的dNTP L 3μ 1 濃度為40 μ / μ 1 的RNase Ribonucleuse inhibitor 1 μ I MMLV反轉(zhuǎn)錄疇 Ιμ?
[0028] 將上述混合液在轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30秒后，42°C的條件下于PCR 儀中反應1小時；
[0029] c、混合液在72°C的條件下反應10分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶，混合液的體積為20μ 1，將 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-7〇°C凍存。
[0030] 所述的步驟B是以名稱為NM-118616的擬南芥ASS cDNA序列為探針，在NCBI數(shù) 據(jù)庫中尋找棉花EST序列，獲得注冊號分別為DR461332, ES847521，H0104400的3條棉花 EST序列信息，對獲得的3條EST序列信息進行電子拼接，獲得含有完整開放閱讀框的較長 的cDNA序列，以步驟A中獲得的反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為PCR反應的模板，設計兩條PCR引物對 獲得的cDNA序列擴增，上、下游擴增引物中分別引入Κρη I和BamH I識別序列，上游引物為 5ZWASS:5' -ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3' ；下游引物為 3ZWASS:5' -TTGCG GACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3 '。
[0031] 所述的步驟C是利用步驟A中獲得的cDNA作模板，使用步驟B中獲得的上、下游 引物進行PCR擴增；
[0032] 20 μ 1PCR反應體系如下：
[0033] ddH20 14. 5ul 1 0 χ Taq plus Buffer 2υI 濃度5μηι的Ji游引物 lul 濃度5μηι的下游引物 Ud cDNA 模板 hil Taq phis 酶 G. 5ul
[0034] 反應程序為：95°C預變性5分鐘；95°C變性1分鐘，50°C復性30秒，72°C延伸2分 鐘，循環(huán)30次；72°C繼續(xù)延伸10分鐘，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)濃度為1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳分 離后，采用Takara公司膠回收試劑盒回收目的基因，回收產(chǎn)物與反應體系連接，將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩選陽性克隆提取質(zhì)粒DNA，進行測序分析；
[0035] 20 μ 1連接體系有如下體積的組分組成：
[0036] 1? X 1i gase Buffer 2 μ 1 濃度為 5 0ng/ul ft pGEM-T 1 μ 1 回收產(chǎn)物 1 5 μ 1 Τ4-_Α 1 igase 2 μ 1
[0037] 將連接體系混合均勻后，16°C過夜。
[0038] 申請人:對本發(fā)明獲得的基因進行了如下試驗。
[0039] 1、基因 GhASS 1 cDNA 的克隆
[0040] 1-1、依據(jù)電子拼接所得到的序列信息，設計引物進行RT-PCR擴增。擴增產(chǎn)物通過 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果得到一條大小為1500bp的片段，該片段大小與預期一致（圖 1)。
[0041] 1-2、將得到的RT-PCR產(chǎn)物回收并與pGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5,提取 轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，分別用Spe I單酶切，和用Sph I、Spe I雙酶切，0.8%瓊脂糖電泳檢 測。如圖，Spe I單酶切產(chǎn)生1條含pGEM+GhASSl片段的長為4500bp的大片段，而用Sph I、 Spe I雙酶切則產(chǎn)生1條pGEM骨干載體片段和1條GhASSl基因，片段大小約為3000bp和 1500bp，電泳（圖2)結(jié)果與預期相符，說明外源基因與T載體成功連接。北京三博遠志生 物技術有限公司測序。
[0042] 2、基因 GhASSlcDNA序列分析
[0043] 2-1、將RT-PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與電子拼接所得相應序列進行比對，二者的同 源性達99. 1%，證明目標基因在棉花中真實存在，因此確定其cDNA序列如圖3。
[0044] 2-2、該cDNA序列長1584bp，5'非翻譯區(qū)（5, -UTR)包含22bp，從第23bp至第 1507bp為其開放閱讀框（0RF)，共有1485bp，自第1508bp后為其3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR)。 0RF區(qū)翻譯的蛋白多肽序列如圖4。
[0045] 2-3、該多肽由494個氨基酸組成，推斷產(chǎn)物的分子量（MW)為54kD，等電點 (pi) 5. 03。序列中不存在跨膜螺旋和信號肽，可能定位于細胞質(zhì)中。利用NPSA中的MLRC 方法預測棉花GhASSl二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示無規(guī)則卷曲所占比例最大，為53. 09 % ;而α -螺 旋和β -折疊所占比例分別為31. 67%和15. 24%。利用網(wǎng)站Expasy中Swiss Model程序 進行同源建模，推測GhASSl蛋白的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖5)顯示該蛋白可能含有較多的無規(guī) 卷曲，α螺旋比β折疊多，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致。
[0046] 3、基因 GhASSl編碼產(chǎn)物的同源對比與系統(tǒng)進化分析
[0047] 3-1、將所得基因 GhASSl編碼的氨基酸序列與落葉松蕈（Agaricus bisporus) (Genbank 注冊號為 CAI12846)和人類（Homo sapiens) (Genbank 注冊號為 P00966)進行 序列比對，結(jié)果如圖6,顯示在GhASSl中有與ASS同源蛋白的高度保守序列，其中富含甘 氨酸的 A 模序（[A/S] - [F/Y] -S-G-G- [LV] -D-T- [S/T])為 Mg2+-ATP 酶共有序列，B 模序 (G-x-T-x-K-G-N-D-x (2) -R-F)為天冬氨酸結(jié)合位點，C 模序（S-x-D-x-N-x (6) -E)和 D 模序 (E-[N/D]-R-x(4)-K-x(4)-Y-E)通過形成β發(fā)卡結(jié)構(gòu)參與與胍氨酸的結(jié)合。
[0048] 3-2、序列相似性分析顯示，GhASSl與擬南芥、水稻等植物同源蛋白的相似性在 80%以上，與人等哺乳動物、釀酒酵母等真菌中同源蛋白的相似性在40-50%，與大腸桿菌 同源蛋白的相似性在20-30%。系統(tǒng)進化分析顯示（圖7)，GhASSl的系統(tǒng)進化與參比各物 種的進化地位基本一致。
[0049] 美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Info rmation， NCBI)推測開放閱讀框架的 0RF Finder,網(wǎng)址為：（http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/ gorf. html)。蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫ExPASy在線服務器，分析GhASSl蛋白的分子量、 等電點、疏水性等。蛋白質(zhì)跨膜預測服務器HMMT0P(http://www. enzim. hu/hmmtop/index. html)，蛋白質(zhì)信號膚預測工具 Signal Ρ4· OSever (http: //www. cbs. dtu. dk/services/ SignalP/)，蛋白質(zhì)亞細胞定位預測工具 PS0RT Predition(http://psort. hqc. jp/form. html)，蛋白質(zhì) Domain 分析工具 SMART (http: //smart, embl-heidelberg. de)，蛋白質(zhì)二級 結(jié)構(gòu)的預測工具 NPSA_MLRC(http://npsa-pbil. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pi ? page = /NPSA/npsa_htm. html),并通過Pymol軟件對GhASSl蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行顯示。 用 ClustalW(http: //www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/)進行在線的同源序列比對， 用DNAMAN軟件進行系統(tǒng)發(fā)生樹分析。
[0050] 4、GhASSl原核表達與體外催化特征分析
[0051] 4-l、pCold-GhASSl原核表達載體的構(gòu)建
[0052] 用Xbal和ΚρηΙ雙酶切GhASSl測序載體，因在GhASSlORF序列內(nèi)部的1118bp處存 在1個ΚρηΙ的識別序列，且0RF序列上游設計添加了 1個ΚρηΙ的識別序列，因此ΚρηΙ和 Xbal雙酶切GhASSl測序載體時需嚴格控制反應條件，使該反應處于不完全酶切狀態(tài)，此時 電泳回收與GhASSlORF序列大小相符的酶切片段，與同樣酶切反應獲得的pCold TF片段連 接，經(jīng)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選，獲得pCold-GhASSl重組質(zhì)粒。同樣，用Xbal和ΚρηΙ雙酶切檢測 獲得的pCold-GhASSl重組質(zhì)粒，反應完全后，采用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產(chǎn)物， 可觀察到清晰的3個條帶（圖8)，其中最大的片段與pCold TF載體大小一致，另2條帶大 小分別約為1200bp和300bp，兩帶大小之和與GhASSlORF大小一致，說明GhASSlORF已成功 構(gòu)建入pColdTF。將此載體送送北京三博遠志生物技術有限公司測序，測序結(jié)果與預期相 符。
[0053] 4-2、基因 GhASSl在大腸桿菌中的表達
[0054] 經(jīng)IPTG誘導后，含有pCold TF空載體的對照菌在54KDa處表達較高水平的標簽蛋 白帶，重組菌中因為GhASSl在pCold-TF質(zhì)粒中的插入，產(chǎn)生特異的1條融合蛋白條帶，大 小約為標簽蛋白與目標蛋白分子量之和，本研究中約為l〇8KDa。電泳結(jié)果如圖9所示，說明 在含pCold-GhASSl質(zhì)粒的Rosetta工程菌株中，GhASSl重組蛋白得到了有效表達。
[0055] 4-3、棉花精氨酸琥珀酸合成酶GhASSl體外催化特征分析
[0056] 精氨酸琥珀酸合成酶催化天冬氨酸和瓜氨酸合成精氨酸琥珀酸，同時消耗一份子 的ATP，使其生成焦磷酸和AMP，在焦磷酸酶的作用下，焦磷酸水解成磷酸，在酸性條件下， 磷酸與鑰酸結(jié)合生成磷鑰酸，磷鑰酸與硫胺反應產(chǎn)生硫胺熒，并發(fā)出很強的熒光。依據(jù)熒光 強度，可間接測定ASS活性。通過測定反應液中總蛋白含量計算酶比活力。
[0057] 取菌體15°C誘導24h后的菌液裂解液作為催化粗酶液，以天冬氨酸，瓜氨酸和ATP 為底物，進行體外酶催化特性的研究，以每分鐘產(chǎn)生1 μ molPO,的酶量為一個酶活力單 位（U/L)，得到粗提取液的酶活性和比活力（圖10A，圖10B)。由圖10A及圖10B可知，含 pCold-GhASSl質(zhì)粒的重組菌表達蛋白GhASSl的酶活性和比活力都遠遠高于含pCold-TF質(zhì) 粒的對照菌。說明GhASSl成功的轉(zhuǎn)移到了大腸桿菌Rosetta菌株中，并可表達有活性的蛋 白。
[0058] GhASSl酶活測定采用如下方法：
[0059] ASS催化瓜氨酸與天冬氨酸縮合成精氨酸代琥珀酸，消耗一分子ATP，生成AMP和 焦磷酸，焦磷酸在焦磷酸酶的作用下水解成磷酸，磷酸與鑰酸在酸性條件下結(jié)合生成磷鑰 酸，其與非熒光的硫胺反應產(chǎn)生高熒光性的硫胺熒，熒光激發(fā)波長375nm，測定波長440nm。 利用這一原理通過檢測其熒光強度，來測定GhASSl的酶活性。
[0060] 基質(zhì)緩沖液：50mm〇l/LTris-HCl緩沖液（pH = 7. 7)，去離子水配制。
[0061] 基質(zhì)液：10mL基質(zhì)緩沖液內(nèi)含0. 005mmol天冬氨酸，0. 004mmol瓜氨酸， 0. 01mmolATP，0. 025mmolMgC12,10U焦磷酸酶，臨用前去離子水配制。
[0062] 熒光混合液：1% H2S04, lmmol/L鑰酸銨，0. 2mmol/L鹽酸硫胺，按2 :1 :1比例去離 子水配制。
[0063] 標準液：0· lmmol/L硼砂，去離子水配制。
[0064] 裂解緩沖液：50mMTris-HCl 緩沖液（pH = 8. 0)，2mMEDTA，0· 5 % TritonX-100， lmg/mL溶菌酶，去離子水配制。
[0065] (1)菌體 15°C誘導 24h 后，各取 1. 4mL 至 1. 5mL 的 EP 管中，4000rpm 低溫（4°C ) 離心10min，倒掉上清液，用移液槍吸干培養(yǎng)基。
[0066] (2)各加入100 μ L裂解液，移液槍輕輕吹打使菌液懸浮。
[0067] (3) - 20°C和室溫反復凍融3-5次。
[0068] (4)4°C、4000rpm離心lOmin，所得上清即為粗酶液。
[0069] (5) 37°C保溫lOmin，各加入2mL熒光混合液，其中測定對照管加 10 μ L待測酶液， 37°C保溫5min后，各管加入100mmol/L硼砂，混勻，測定突光度。
[0070] 表1熒光測定酶活力
[0071]

【權(quán)利要求】
1. 提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSl，其特征在于其序列如下： ATTTCAGTGA AAGAAAAAAA AAATGCCTCA GTTCAAAGCC GTTTCACTCT CTTCGTCCAT TAATCTTCCA AGTTACCGTC CCAAAAGAAA TACATTGTTA CATTCCGATA ATTTGATCTG TTCTAGGAAG TTATCCACTT TCCATCAGTT AAGTGGAAAA TCTAGTTCGC TTCATGGTAA TGCTATTCTA AGCAACAATG TGTGTATGAC TCTAACACCT AAGAATCAAG GTATTCAAGC TGTTCTTTCC AGCAACTCAG GGACGGATGT TTCCACAGTT ACAAAGGGTG GAGGGCTTCG AGGCAAATTA AACAAGGTTG TTTTAGCCTA CAGTGGCGGC TTAGATACTT CTGTTATTGT TCCATGGCTA AGGGAGAATT ATGGTTGTGA GGTTGTTTGC TTCACTGCCG ATGTTGCCCA AGGCATAAAA GAATTGGATG GTTTGGAAGC AAAGGCCAAG GCAAGCGGGG CTTGCCAGTT AGTAGTTAAG GACTTAAAGG AGGAATTTGT GAAAGACTAT ATATTTCCAT GCTTGCCAGC TGGTGCCATT TACGAGAGGA AATACTTGTT GGGAACCTCA ATGGCCAGGC CTGTTATTGC AAAGGCCATC GTGGATATTG CTAGAGACGT TCGCGCTGAT CCCGTTTCTC ATGGATGCAC AGCGAAAGGA AATGATCACG TTCGCTTTGA GCTCACCTTC TTTGCTCTAA GTCCGCAATT AAACGTTGTC GCTCCTTGCA CAGAATGCGA TATTACAGCG AGAGAAGATC CTATTCAATA TGCTAAGAAG CATAATGTGC CTGTTCCAGT GACAAACAAA TCAATATACA CttGACACAG GAACTTATGG CACTTGAGCC ACGAGGGAGA TATCTTCGAG GATCCAGCAA ATGAACCGAA GGAAGATATG TACATGATGA GTGTTGACCC GAAAGATGCT CCTGATAAAC CTCAATACGT GAAAATCGGA ATTGAATCAG CCATCCCTGT TTCACTTGAT GGAAAAACTT ATTTGCCGGC TGAACTTCTT GCTACACTCA ATGAAATTGG TGGCAAACAT CGCATTGCTC GTATTGACAT GGTTGAAAAT CGGCTCGTTG CTATCAACAG TCGTGGCGTC TACGAAACTC CCGCTGCTAC CATCCTATTC AACGCCGTTC CTGACCTCGA ATCTCTAACC CTTGACCCCC AAACCATTCA AGTTAAAGAT TCACTTGCCC TCAACTATGC GGACTTAGTT TATGCAGCAA GCTCGTTCGA CCCACTTCGT GAATCCATCG ATGCATTTAT GGACAACATA ACTGAAACCA CCACTGCTTC CGTGACTTTG AAGCTATACA AAGGATCAGT TTCCGTAACT GGCCGGACCA GTGCTTATAG CTTGTACAGA GAGGATATCT CCTCCTTTGA GAGTGGAGAC ATATATAATC AAGCCGATGC TGCCGGATTT ATTCGGCTCT ATGGTCTTCC AATGAGGGTT AGGGCAATGC TTAACAAAGG TATGTAAGTG CTTTCTATTT TGTTTTTCAT TGTCTGGAAT TTCAAGGCTA ACTTATATAT TATCAATGGA GTAGTTTTCA TTCC"
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSl的制備，其特征在于所述 的制備方法包括如下步驟： 以 5' -ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3' 為上游引物 5ZWASS，以 5' -TTGC GGACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3' 為下游引物 3ZWASS，以棉花植株根中 的RNA反轉(zhuǎn)錄所合成的cDNA為模板，采用PCR擴增方法獲得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSl的制備，其特征在于其工 藝步驟如下： A、 PCR反應模板的制備； B、 引物的制備； C、 基因 GhASSl全序列的擴增和克隆。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSl的制備，其特征在于所述 的步驟A是選取新鮮棉花的根，在液氮中研磨成粉末狀，置于預先凍存在冰上無 RNase的離 心管中，提取棉花的根組織中的RNA，提取的RNA經(jīng)1 %瓊脂糖甲醛變性膠電泳檢測，反轉(zhuǎn)錄 合成cDNA用于PCR反應的模板。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSl的制備，其特征在于所述 的RNA提取采用Takara公司生產(chǎn)的總RNA提取試劑盒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5中任一項所述的提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhA SS1的制備， 其特征在于所述的反轉(zhuǎn)錄包括如下工藝步驟： a、 向 RNase-free 離心管中加入 2 μ gRNA，濃度為 0· 5 μ g/ μ 1 的 Oligo dT182 μ 1， DEPC-H207. 75 μ 1，在溫度70°C的條件下反應5分鐘后，迅速冰??； b、 向步驟a的溶液中加入以下反應液后制成混合液 5 X緩沖液 5 μ 1 濃度為 10mM的dNTP 1, 3μ 1 濃度為40 μ / μ 1 的RNase Ribonucleuse inhibitor 1 μ 1 MMLV反轉(zhuǎn)錄酶 1 μ 1 將上述混合液在轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30秒后，42°C的條件下于PCR儀中反 應1小時； c、 混合液在72°C的條件下反應10分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶，混合液的體積為20 μ 1，將反轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物于_70°C凍存。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSl的制備，其特征在于所述 的步驟B是以名稱為NM-118616的擬南芥ASScDNA序列為探針，在NCBI數(shù)據(jù)庫中尋找棉花 EST序列，獲得注冊號分別為DR461332, ES847521，H0104400的3條棉花EST序列信息，對 獲得的3條EST序列信息進行電子拼接，獲得含有完整開放閱讀框的較長的cDNA序列，以 步驟A中獲得的反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為PCR反應的模板，設計兩條PCR引物對獲得的cDNA序 列擴增，上、下游擴增引物中分別引入Κρη I和BamH I識別序列，上游引物為5ZWASS:5'-AC CATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3' ；下游引物為 3ZWASS:5' -TTGCGGACTCTAGAGGAT CCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3 '。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的提高大腸桿菌耐鹽性的基因 GhASSl的制備，其特征在于所 述的步驟C是利用步驟A中獲得的cDNA作模板，使用步驟B中獲得的上、下游引物進行PCR 擴增； 20 μ 1PCR反應體系如下： ddH20 14.5ul 10x Taq plus Buffer 2ul 濃度5μηι的上游引物 lul 濃度5μηι的下游引物 lul c+DM 模板 lul Taq plus 酶 0. Sul 反應程序為：95°C預變性5分鐘；95°C變性1分鐘，50°C復性30秒，72°C延伸2分鐘，循 環(huán)30次；72°C繼續(xù)延伸10分鐘，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)濃度為1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳分離后， 采用Takara公司膠回收試劑盒回收目的基因，回收產(chǎn)物與反應體系連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 大腸桿菌后篩選陽性克隆提取質(zhì)粒DNA，進行測序分析； 20 μ 1連接體系有如下體積的組分組成： 10 X 1igase Buffer 2 μ 1 濃度為 50ng/ul 的 pGBM-T 1 μ 1 回收產(chǎn)物 15 μ 1 T.;-DNA H gase 2 μ 1 將連接體系混合均勻后，16 °C過夜。
9.利用如權(quán)利要求1所述的基因 GhASSl編碼的蛋白，其特征序列如下： MET Ala Gin Phe Lys Ala ￥a1 Ser Leu Ser Ser Ser lie Asn Leu Ala Ser Tyr Gly Fro Lys Arg Asn Thr Leu Leu His Ser Asp Asn Leu Tie Cys Ser Arg Lys Leu Ser Thr Phe His G1u Leu Ser Gly Lys Ser Ser Ser Leu His Gly Asn Ala lie Va1 Ser Asn Asn Va1 Cys MET Thr Leu Thr Pro Lys Asn (；!n Oly lie Gin Ala Val Leu Ser Ser Asn Ser Gly Thr Asp Va! Ser Thr Va1 Thr Lys Gly Gly Gly Leu Arg G1y Lys Leu Asn Lys Va1 Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Ser Va1 lie Val Pro Trp Leu Arg Glu Asn Tyr Giy Cys Glu Val Val Cys Phe Thr Ala Asp Val Gly Gin Gly He Lys Glu Leu Asp Gly Leu Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ser Gly Ala Cys Gin Leu Val Val Lys Asp Leu Lys Glu Glu Phe Va1 Lys Asp Tyr lie Phe Pro Cys Leu Arg Ala Gly Ala lie Tyr Glu Arg Lys Tyr Leu Leu Gly Thr Ser MET Ala Arg Pro Val lie Ala Lys Ala MET Val Asp lie Ala Arg Glu Val Gly Ala Asp Ala Val Ser His Gly Cys Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gin Val Arg Phe Glu Leu Thr Phe Phe Ala Leu Ser Pro Glu Leu Asn YaI Val Ala Pro Trp Arg Glu Trp Asp lie Thr Gly Arg Glu Asp Ala He Giu Tyr Ala Lys Lys His Asn Val Pro Val Pro Va1 Thr Lys Lys Ser lie Tyr Ser Arg Asp Arg Asn Leu Trp His Leu Ser His Glu Gly Asp lie Leu Glu Asp Pro Ala Asn Glu Pro Lys Glu Asp MET Tyr MET MET Ser Val Asp Pro Lys Asp Ala Pro Asp Lys Pro Gin Tyr Val Lys lie Glv lie Glu Ser Gly lie Fro Val Ser Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Pro Ala Glu Leu Leu Ala Thr Leu Asn G!u He Gly Gly Lys His Gly lie Gly Arg lie Asp MET ￥a! Glu Asn Arg Leu Yal Gly MET Lys Ser Arg Gly ￥al Tyr Glu Thr Pro Gly Gly Thr lie Leu Phe Asn Ala Val Arg Glu Leu Clu Ser Leu Thr Leu Asp Arg Glu Thr lie CIn Val Lys Asp Ser Leu Ala Leu Lvs Tyr Ala Glu Leu Val Tyr Ata Cly Arg Trp Phe Asp Pro Leu Arg Glu Ser MET Asp Ala Phe MET Glu Lys lie Thr Glu Thr Thr Thr Gly Ser Val Thr Leu Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Val Ser Val Thr Gly Arg Thr Ser Ala Tvr Ser Leu Tyr Arg Glu Asp lie Ser Ser Phe Glu Ser Gly Asp lie Tyr Asn Gin Ala Asp Aia Ala Giy Phe Tie Arg Leu Tvr Gly l,eu Pro MET Arg Val Arg Ala MF,T !xu Asn Lys Gly * Μψ% X 0
【文檔編號】C12N15/10GK104059928SQ201410238026
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】孫艷香, 王慧飛, 馮雪, 賈永紅, 張一名 申請人:廊坊師范學院