一種快速檢測轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四重pcr引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四重PCR引物及方法。該方法所涉及的引物由煙草內(nèi)源基因元件NR(硝酸還原酶基因)及外源基因元件(包括35S啟動(dòng)子、NOS終止子、NPTII篩選標(biāo)記基因)組成。通過四重PCR擴(kuò)增，在一次PCR反應(yīng)中可同時(shí)檢測NR基因及3個(gè)外源基因，檢測方法包括以下步驟：四對(duì)引物稀釋成等摩爾濃度后按1:1:1:1(V/V)比例混合，在20μL反應(yīng)體系中添加Mg2+1.5mmol/L、dNTP125μmol/L、Taq酶1U、混合引物1μmol/L，DNA100ng，在退火溫度65℃，循環(huán)數(shù)35個(gè)的PCR反應(yīng)條件下，能夠有效檢測出烤后煙葉百分比含量為0.9％(V/V)的轉(zhuǎn)基因成分。本發(fā)明的效果是：重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡單、節(jié)約成本。
【專利說明】-種快速檢測轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四重PCR引物及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物檢測領(lǐng)域，特別涉及一種快速檢測轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四重 PCR引物及方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 煙草制品作為特殊消費(fèi)品，各國消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草均采取"零"容忍態(tài)度，對(duì)煙 草制品的轉(zhuǎn)基因檢測已成為煙草國際貿(mào)易的重要壁壘，因此，對(duì)煙葉轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測 非常重要。
[0003] 作物轉(zhuǎn)基因成分檢測主要包括基于DNA檢測和基于蛋白質(zhì)檢測的方法，其中基于 DNA的轉(zhuǎn)基因檢測方法應(yīng)用最為廣泛，該方法首先通過對(duì)某些遺傳元件進(jìn)行篩查，挑選出使 用頻率最高的少數(shù)幾個(gè)遺傳元件作為檢測靶標(biāo)，如果檢測出其中任何一個(gè)元件，表明該樣 品含有轉(zhuǎn)基因成分，如果未檢出，則表明樣品中不含有已知轉(zhuǎn)基因成分。
[0004] 烤后煙葉作為一種經(jīng)高溫和多環(huán)節(jié)加工的生物材料，其轉(zhuǎn)基因檢測方法受DNA降 解程度、PCR擴(kuò)增效率等多方面影響，與一般植物組織的轉(zhuǎn)基因檢測有很大不同。國際上對(duì) 烤后煙葉進(jìn)行轉(zhuǎn)基因篩查的遺傳元件為35S啟動(dòng)子、N0S終止子和NPTII篩選標(biāo)記基因。目 前國標(biāo)《GB/T24310-2009煙草及煙草制品轉(zhuǎn)基因檢測方法》對(duì)以上三種遺傳元件的PCR定 性檢測為單一 PCR反應(yīng)，即需要在3支PCR管內(nèi)分別反應(yīng)對(duì)三種靶標(biāo)序列進(jìn)行檢測，該種方 法不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且檢測成本較高。另外，也有二重PCR反應(yīng)的報(bào)道，如對(duì)35S和NR二重 PCR擴(kuò)增，或?qū)PTII和N0S二重PCR擴(kuò)增，但尚無通過四重PCR反應(yīng)，一次反應(yīng)同時(shí)檢測4 種基因（內(nèi)源基因 NR，外源基因35S、N0S、NPTII)的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提出一種快速檢測轉(zhuǎn)基因烤 后煙葉的四重PCR引物，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提出一種快速檢測轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四 重PCR方法，通過一次PCR反應(yīng)，同時(shí)檢測煙葉的1個(gè)內(nèi)源基因及3個(gè)外源基因，本方法較 傳統(tǒng)單一 PCR檢測方法具有操作簡單、重復(fù)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可節(jié)省試劑成本及提高檢測效率。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0007] -種快速檢測測轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四重PCR引物，四對(duì)引物序列分別為：
[0008] NPTII:SEQIDN0:15'-TCACTGAAGCGGGAAGGGACTG-3'
[0009] SEQIDN0:25'-GCGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3'
[0010] 35S:SEQIDN0:35'-CTACCCGAGCAATAATCTCCAGG-3'
[0011] SEQIDN0:45'-TGCTCCACCATGTTGACGAAG-3'
[0012] NOS:SEQIDN0:55'-CCGGTCTTGCGATGATTATCAT-3'
[0013] SEQIDN0:65'-AGTAACATAGATGACACCGCGC-3'
[0014] NR:SEQIDN0:75'-CGCTGATAACTGGATTGAACGC-3'
[0015] SEQIDN0:85'-GGTTACGAACGTAATGAAGTGGGAC-3' 。
[0016] 進(jìn)一步的，該方法利用上述四重PCR引物在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)對(duì)4種目的基因 元件進(jìn)行檢測，所述4種目的基因元件分別是煙草內(nèi)源基因 NR(煙草內(nèi)源硝酸還原酶基 因）、35S啟動(dòng)子（花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子）、N0S終止子（農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因終 止子）、NPTII篩選標(biāo)記基因（大腸桿菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因）。
[0017] 進(jìn)一步的，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件為：
[0018] (1)將上文所述4對(duì)引物經(jīng)ddH20稀釋成等摩爾濃度后按比例混合制成混合引物；
[0019] (2)PCR 反應(yīng)體系：每 20 μ L，含 Mg2+0. 75-4. 5mmol/L、dNTP100-275 μ mol/L、Taq 酶 L 0-3. 0U、混合引物 0· 50-2. 00 μ mol/L，DNAlOOng，用 ddH20 將終體積調(diào)整到 20ul ;
[0020] (3)PCR 擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，57. 5-67. 5°C退火 45s，72°C延 伸45s，共27-35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選的，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件為：
[0022] (1)將上文所述4對(duì)引物經(jīng)ddH20稀釋成等摩爾濃度后按比例混合制成混合引物；
[0023] (2)所述 PCR 反應(yīng)體系：每 20 μ L，含 Mg2+1. 5mmol/L、dNTP125 μ mol/L、Taq 酶 1U、 混合引物1 μ mol/L，DNAlOOng，用ddH20將終體積調(diào)整到20ul。
[0024] (3)PCR 擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，65°C退火 45s，72°C延伸 45s， 共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min。
[0025] 進(jìn)一步的，所述混合引物的混合比例為1:1:1:1 (V/V)。
[0026] 進(jìn)一步的，該方法應(yīng)用于快速檢測烤后煙葉或鮮煙葉是否有含35S啟動(dòng)子、N0S終 止子、NPTII篩選標(biāo)記基因3種轉(zhuǎn)基因成分，檢測限為0. 9% (V/V)。
[0027] 本發(fā)明方法的具體步驟為：
[0028] (1)提取待測烤后煙葉基因組DNA (DNA濃度大于100ng/ μ L，0D260/280在 1. 70-1. 90 之間），用 ddH20 將 DNA 濃度調(diào)至 100ng/ μ L。
[0029] (2)將SEQIDN0:1-8的4對(duì)引物預(yù)先按1:1:1:1 (稀釋成相等摩爾濃度）等體積混 合。
[0030] (3)PCR 反應(yīng)體系：含 Mg2+1. 5mmol/L、dNTP125 μ mol/L、Taq 酶 1U、混合引物 1 μ mol/L，DNAlOOng，用 ddH20 將終體積調(diào)整到 20ul。
[0031] (4)?〇?擴(kuò)增條件：941：預(yù)變性51^11，941：變性308,651：退火458,721：延伸458， 共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min。
[0032] (5) PCR反應(yīng)結(jié)束后加入5 μ L6 X loadingbuf f er，取8 μ L產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電 泳檢測，如果出現(xiàn)大小為137bp的NR基因擴(kuò)增條帶，說明所提取的煙葉DNA質(zhì)量附合PCR檢 測要求；如果出現(xiàn)大小為490bp的NPTII基因擴(kuò)增條帶，說明該煙葉含有外源基因 NPTII ; 如果出現(xiàn)大小為345bp的35S基因擴(kuò)增條帶，說明該煙葉含有外源基因35S ;如果出現(xiàn)大小 為199bp的N0S基因擴(kuò)增條帶，說明該煙葉含有外源基因 N0S。
[0033] 所述的一種快速檢測轉(zhuǎn)基因煙葉外源基因的四重PCR引物及方法可在一個(gè)PCR反 應(yīng)內(nèi)同時(shí)檢測4種基因元件，分別是煙草內(nèi)源基因 NR，外源基因35S啟動(dòng)子、N0S終止子、 NPTII篩選標(biāo)記基因。
[0034] 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0035] (1)效率高：選用NR基因作為內(nèi)源參照基因，利用四重PCR反應(yīng)技術(shù)建立了一種 簡單、高效、快速、低成本的轉(zhuǎn)基因烤后煙葉檢測方法，在同一次PCR反應(yīng)可以同時(shí)檢出4種 基因，包括煙草內(nèi)源基因 NR，外源基因35S啟動(dòng)子、NOS終止子、NPTII篩選標(biāo)記基因。
[0036] (2)特異性強(qiáng)：1次PCR反應(yīng)同時(shí)檢測4種基因，各擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，互不干擾， 該方法檢測限為0.9% (V/V)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1轉(zhuǎn)基因煙葉的單一 PCR檢測，其中泳道1 -3、4-6、7-9、10-12分別為ΝΡΤ11篩 選標(biāo)記基因、35S啟動(dòng)子、N0S終止子、NR基因的單次PCR產(chǎn)物，其中1、4、7、10為已知含有 3種外源基因成分的轉(zhuǎn)基因煙葉DNA，2、5、8、11為非轉(zhuǎn)基因煙葉DNA對(duì)照，3、5、9、12為空白 對(duì)照，Μ 為 lOObpLadderDNAMarker ;
[0038] 圖2不同Mg2+含量對(duì)四重PCR的影響，泳道1-6為轉(zhuǎn)基因煙葉DNA，Mg 2+依次為 0·75、1.50、2.25、3. 00、3. 75、4. 50mmol/L, Μ 為 lOObpLadderDNAMarker ;
[0039] 圖3不同dNTP含量對(duì)四重PCR的影響，泳道l-8dNTP含量分別為100、125、150、 175、200、225、250、275 μ mol/L，Μ 為 lOObpLadderDNAMarker ;
[0040] 圖4不同Taq酶含量對(duì)四重PCR的影響，泳道l_5Taq酶含量分別為1. 0U、1. 5U、 2.0U、2. 5U、3. 0U，Μ 為 lOObpLadderDNAMarker ;
[0041] 圖5不同混合引物含量對(duì)四重PCR的影響，泳道1-7引物含量分別為0. 50、0. 75、 1.00、1.25、1.50、1. 75、2· 00 μ mol/L，Μ 為 lOObpLadderDNAMarker ;
[0042] 圖6不同退火溫度對(duì)四重PCR的影響，泳道1-5退火溫度分別為57. 5°C、60. 0°C、 62. 5°C、65. (TC、67. 5°C，Μ 為 100bpLadderDNA Marker ;
[0043] 圖7不同循環(huán)對(duì)四重PCR的影響，泳道1-5循環(huán)數(shù)為27、29、31、33、35個(gè)循環(huán)，M為 lOObpLadderDNAMarker ；
[0044] 圖8四重PCR檢測限的確定，泳道1-5煙葉轉(zhuǎn)基因含量分別為0.9 %、0.7 %、 0. 5%、0. 3%、0. 1%，泳道1-6為非轉(zhuǎn)基因煙葉。

【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)說明：
[0046] -種快速檢測轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四重PCR方法，具體步驟為：
[0047] (1)提取待測烤后煙葉基因組DNA (DNA濃度大于100ng/ μ L，0D260/280在 1. 70-1. 90 之間），用 ddH20 將 DNA 濃度調(diào)至 100ng/ μ L。
[0048] (2)將SEQIDN0:1-8的4對(duì)引物預(yù)先按1:1:1:1 (稀釋成相等摩爾濃度）等體積混 合。
[0049] (3)PCR 反應(yīng)體系：含 Mg2+1. 5mmol/L、dNTP125 μ mol/L、Taq 酶 1U、混合引物 1 μ mol/L，DNAlOOng，用 ddH20 將終體積調(diào)整到 20ul。
[0050] (4)?〇?擴(kuò)增條件：941：預(yù)變性51^11，941：變性308,651：退火458,721：延伸458， 共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min。
[0051] (5) PCR反應(yīng)結(jié)束后加入5 μ L6 X loadingbuf f er，取8 μ L產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電 泳檢測，如果出現(xiàn)大小為137bp的NR基因擴(kuò)增條帶，說明所提取的煙葉DNA質(zhì)量附合PCR檢 測要求；如果出現(xiàn)大小為490bp的NPTII基因擴(kuò)增條帶，說明該煙葉含有外源基因 NPTII ; 如果出現(xiàn)大小為345bp的35S基因擴(kuò)增條帶，說明該煙葉含有外源基因35S ;如果出現(xiàn)大小 為199bp的NOS基因擴(kuò)增條帶，說明該煙葉含有外源基因 NOS。
[0052] 所述的一種快速檢測轉(zhuǎn)基因煙葉外源基因的四重PCR引物及方法可在一個(gè)PCR反 應(yīng)內(nèi)同時(shí)檢測4種基因元件，分別是煙草內(nèi)源基因 NR，外源基因35S啟動(dòng)子、N0S終止子、 NPTII篩選標(biāo)記基因。
[0053] 試驗(yàn)例
[0054] 1引物設(shè)計(jì)
[0055] 根據(jù)GB/T24310-2009《煙草及煙草制品轉(zhuǎn)基因檢測方法》所提出的NPTII、35S、 NOS、NR引物序列在NCBI中搜索原序列，用PrimerPremierV5. 0設(shè)計(jì)引物，通過軟件中的 Multiplex/NestedPrimers功能，篩選出引物間干擾最小的引物組合，再利用01ige6. 0對(duì) 設(shè)計(jì)引物Tm值進(jìn)行評(píng)估，確定最終引物序列。
[0056] 四對(duì)引物序列及擴(kuò)增片段長度如下表：
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四重PCR引物，其特征在于，四對(duì)引物序列分別為： NPTII:SEQIDNO:15'-TCACTGAAGCGGGAAGGGACTG-3' SEQIDNO:25'-GCGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3' 35S:SEQIDNO:35'-CTACCCGAGCAATAATCTCCAGG-3' SEQIDNO:45'-TGCTCCACCATGTTGACGAAG-3' NOS:SEQIDNO:55'-CCGGTCTTGCGATGATTATCAT-3' SEQIDNO:65'-AGTAACATAGATGACACCGCGC-3' NR:SEQIDNO:75'-CGCTGATAACTGGATTGAACGC-3' SEQIDNO:85'-GGTTACGAACGTAATGAAGTGGGAC-3' 。
2. -種快速檢測轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四重PCR方法，其特征在于：該方法利用權(quán)利要求1 所述四重PCR引物在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)對(duì)4種目的基因元件進(jìn)行檢測，所述4種目的基 因元件分別是煙草內(nèi)源硝酸還原酶基因、花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、農(nóng)桿菌胭脂堿合成 酶基因終止子、大腸桿菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速檢測轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四重PCR方法，其特征在于， PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件為： (1) 將權(quán)利要求1所述4對(duì)引物經(jīng)ddH20稀釋成等摩爾濃度后按比例混合制成混合引 物； (2) PCR 反應(yīng)體系：每 20 μ L，含 Mg2+0. 75-4. 5mmol/L、dNTP100-275 μ mol/L、Taq 酶 L 0-3. 0U、混合引物 0· 50-2. 00 μ mol/L，DNAlOOng，用 ddH20 將終體積調(diào)整到 20ul ; (3) PCR 擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，57. 5-67. 5°C退火 45s，72°C延伸 45s，共 27-35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種快速檢測轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四重PCR方法，其特征在于， PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件為： (1)將權(quán)利要求1所述4對(duì)引物經(jīng)ddH20稀釋成等摩爾濃度后按比例混合制成混合引 物； ⑵所述 PCR 反應(yīng)體系：每 20 μ L，含 Mg2+1. 5mmol/L、dNTP125 μ mol/L、Taq 酶 1U、混合 弓丨物1 μ mol/L，DNAlOOng，用ddH20將終體積調(diào)整到20ul ; (3)卩〇?擴(kuò)增條件：941：預(yù)變性51^11，941：變性308,651：退火458,721：延伸458，共35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述混合引物的混合比例為 1:1:1:1(V/V)〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求2-5所述的方法，其特征在于，該方法應(yīng)用于快速檢測烤后煙葉或 鮮煙葉是否有含35S啟動(dòng)子、N0S終止子、NPTII篩選標(biāo)記基因3種轉(zhuǎn)基因成分，檢測限為 0.9% (V/V)〇
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104152541SQ201410217600
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】余婧, 趙杰宏, 鄒頡, 郭玉雙, 林世鋒, 付強(qiáng), 張孝廉, 余世洲 申請(qǐng)人:貴州省煙草科學(xué)研究院