一種新型的產(chǎn)生物表面活性劑海水發(fā)酵型菌株的制作方法
【專利摘要】傳統(tǒng)發(fā)酵一般采用淡水資源。本發(fā)明公開了一種新型的產(chǎn)生物表面活性劑的海水發(fā)酵型菌株，能很好的利用天然海水作為發(fā)酵用水和廢棄食用油脂作為單一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂。通過在沿海淡水資源缺乏和水質(zhì)欠佳的地區(qū)興辦海水發(fā)酵企業(yè)，可解決傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)對淡水資源的依賴。本發(fā)明菌株通過海水富集培養(yǎng)、高鹽血平板初篩、合成培養(yǎng)基復(fù)篩以及海水搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證而得到分離純化，并通過生理生化實(shí)驗(yàn)和分子鑒定分析，確定該海水發(fā)酵型菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)，已于2014年4月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC?No.9091。該發(fā)明菌株在利用海水發(fā)酵上的優(yōu)勢，所得粗產(chǎn)物鼠李糖脂可用于區(qū)域性的市場推廣，將在農(nóng)業(yè)、石油化工、環(huán)境治理、土壤修復(fù)、化妝品工業(yè)、制藥行業(yè)和食品行業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮潛在的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種新型的產(chǎn)生物表面活性劑海水發(fā)酵型菌株

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一株海水發(fā)酵型菌株在利用天然海水作為發(fā) 酵用水和廢棄食用油脂作為單一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前市場上的大多數(shù)表面活性劑主要來自石油基的化學(xué)產(chǎn)品，其生產(chǎn)過程需要消 耗大量的石油產(chǎn)品，且易造成環(huán)境污染，而生物表面活性劑的獲得則不存在這樣的問題。生 物表面活性劑鼠李糖脂是由微生物發(fā)酵次級代謝得到的一種新型陰離子生物表面活性劑， 具有可生物降解、低毒性和環(huán)境友好性等特點(diǎn)。且因鼠李糖脂具有良好的乳化性、潤濕性、 起泡性，在農(nóng)業(yè)、石油化工、環(huán)境保護(hù)、化妝品工業(yè)、制藥行業(yè)和食品行業(yè)等具有潛在的應(yīng)用 前景。
[0003] 發(fā)酵用水和無機(jī)鹽成本是發(fā)酵企業(yè)生產(chǎn)成本的重要組成部分。天然海水中含有豐 富的無機(jī)鹽礦質(zhì)元素，可補(bǔ)償發(fā)酵用水中部分無機(jī)鹽離子。傳統(tǒng)發(fā)酵用水多為淡水，目前海 水淡化成本較高，因此在淡水缺乏，水質(zhì)不佳的沿海灘涂地區(qū)利用新型的海水發(fā)酵菌株產(chǎn) 生物表面活性劑鼠李糖脂具有特殊意義。
[0004] 發(fā)酵碳源原料的成本也是發(fā)酵工程生產(chǎn)成本的重要組成部分，而目前地溝油、炸 貨油等廢棄食用油脂并未得到很好的利用，反而成了嚴(yán)重的環(huán)境污染物或被不合理地回收 利用重回餐桌，危害人們的健康。因此興辦利用天然海水作為發(fā)酵用水和廢棄食用油脂為 單一碳源發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵企業(yè)，既可解決傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)酵對淡水資源的依賴， 也可為廢棄食用油脂的處理提供新思路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株海水發(fā)酵型菌株，用于利用天然海水作為發(fā)酵用水和廢 棄食用油脂為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂，可在淡水缺乏，水質(zhì)不佳的沿 海地區(qū)興辦海水發(fā)酵企業(yè)，且采用該菌株生產(chǎn)所得的粗產(chǎn)物，可用于區(qū)域性的市場推廣。
[0006] 本發(fā)明提供的海水發(fā)酵型菌株是具有耐海水鹽度的銅綠假單胞菌，菌株名稱為 Z-2,其分類命名為銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa),并已于2014年4月25日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號中國科學(xué)院微生物研究所），保藏編號為：CGMCC No. 9091。
[0007] 所述新型產(chǎn)生物表面活性劑的海水發(fā)酵型菌株的分離篩選和鑒定步驟為：取沿 海灘涂植物根際土樣或泥樣，在實(shí)驗(yàn)室利用海水發(fā)酵培養(yǎng)基富集培養(yǎng)、高鹽血平板初篩、合 成培養(yǎng)基復(fù)篩和海水搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，分離純化菌株，根據(jù)發(fā)酵液排油圈形成大小和表面張 力的測定，最終篩選出一株能利用天然海水作為發(fā)酵用水和廢棄食用油脂為單一碳源發(fā)酵 生產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂的菌株，標(biāo)號為Z-2 ;然后根據(jù)菌落的形態(tài)特征、生理生化指 標(biāo)，以及16SrDNA測序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較分析發(fā)現(xiàn)，菌株Z-2經(jīng)鑒定 為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.)，命名為銅綠假單胞菌Z-2。
[0008] 采用該菌株海水發(fā)酵制得粗產(chǎn)物鼠李糖脂的過程如下： (1)發(fā)酵種子液的制備：取保藏的銅綠假單胞菌Z-2斜面接種于三角瓶的高鹽種子培 養(yǎng)基中，并將三角瓶置于恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，溫度為30°C轉(zhuǎn)速180r ?mirT1，過夜培養(yǎng)后即得 種子液。 ⑵發(fā)酵液的制備：?、胖兴@得的Z-2菌株種子液，按3%的接種量接種至海水發(fā) 酵培養(yǎng)基中，180r · min'SOt：條件下振蕩培養(yǎng)3d后即得發(fā)酵液。 (3) 發(fā)酵粗產(chǎn)物的分離：將（2)制得的發(fā)酵液在4°C條件下，以SOOOrpm離心20min，去 除菌體，取上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至原來體積的1/3后，加入濃鹽酸并調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH 至2. 0左右，酸沉過濾后，再在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)濃縮，直至濃稠狀粗產(chǎn)物的出現(xiàn)，即得粗 產(chǎn)物鼠李糖脂。 (4) 進(jìn)一步地，所述過程⑴和⑵中的培養(yǎng)基成分：高鹽種子培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨 10,牛肉膏5, NaC130, pH7. 4。海水發(fā)酵培養(yǎng)基：中速濾紙過濾后的天然海水1000ml，加酵 母粉lg，炸貨油3% (V/V)即成，自然pH值。
[0009] 此發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，從上述技術(shù)方案可知：所分離的海 水發(fā)酵型菌株銅綠假單胞菌Z-2具有很好的耐海水鹽度的特征，能利用天然海水作為發(fā)酵 用水和廢棄食用油脂為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂，且同等鹽度和培養(yǎng)條 件下，海水發(fā)酵在產(chǎn)量上于合成培養(yǎng)基發(fā)酵基本相當(dāng)，部分海水發(fā)酵產(chǎn)量較合成培養(yǎng)基發(fā) 酵可高出35%，因此在生產(chǎn)成本和產(chǎn)量上，海水發(fā)酵型菌種已基本克服產(chǎn)量低和過分依賴 淡水資源發(fā)酵的缺陷。此外本發(fā)明的發(fā)酵粗產(chǎn)物鼠李糖脂可作為化學(xué)表面活性劑的新型替 代品，用于石油開采、環(huán)境治理、土壤修復(fù)等對于發(fā)酵產(chǎn)品純度要求不高的行業(yè)。當(dāng)然通過 進(jìn)一步的產(chǎn)物純化，其在化妝品工業(yè)、制藥行業(yè)和食品等方面也是具有潛在的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明菌株Z-2海水發(fā)酵利用廢棄食用油脂并出現(xiàn)乳化的效果圖。
[0011] 圖2是本發(fā)明菌株z-2的在高鹽肉湯培養(yǎng)基中的生長曲線。
[0012] 圖3為本發(fā)明菌株Z-2的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0013] 圖4為本發(fā)明菌株z-2在不同發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物性質(zhì)和產(chǎn)量的對比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面通過具體的實(shí)施方案對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0015] 實(shí)施例1 :新型產(chǎn)生物表面活性劑海水發(fā)酵型菌株的篩選分離步驟
[0016] ⑴采樣 主要采集以下樣品：土樣或泥樣采自沿海灘涂。水樣采自港口附近的近海海水。采集 后立刻帶回保存于4°C中。
[0017] ⑵富集培養(yǎng) 在加有海水發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中加入土樣或泥樣，30°c振蕩培養(yǎng)3d后再轉(zhuǎn)接于新的 海水發(fā)酵培養(yǎng)基，共富集培養(yǎng)3次，致使能利用廢棄食用油脂做唯一碳源的微生物得到富 集。
[0018] ⑶初篩 取（2)中的富集液在高鹽血平板劃線或稀釋涂布培養(yǎng)，挑取透明圈較大且清晰的單菌 落接斜面30°C培養(yǎng)l-2d后4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0019] ⑷復(fù)篩 ?。?)中各菌株的斜面，接高鹽種子培養(yǎng)基，過夜活化后，按3%的量接入合成培養(yǎng)基 中，180r · min'SOt：條件下振蕩培養(yǎng)3d后，取發(fā)酵液進(jìn)行排油圈和表面張力測定。
[0020] (5)海水搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證 從（4)中選擇復(fù)篩發(fā)酵較好的搖瓶，取1. 5mL發(fā)酵液（含菌種）至50mL海水發(fā)酵培養(yǎng) 基中，180r · η?η'βΟ?條件下振蕩培養(yǎng)3d后，取發(fā)酵液進(jìn)行排油圈、表面張力的測定。 測定表面張力采用表面張力儀，排油圈測定大小的方法是：在90mm培養(yǎng)皿小蓋中，力口 入20mL去離子水，滴加100uL柴油形成油膜，再在油膜中心加入10uL的發(fā)酵液。如果排油 圈直徑超過培養(yǎng)皿小蓋的直徑，則將發(fā)酵液稀釋10倍后再加入。取排油圈較大且表面張力 明顯降低的菌株保藏，標(biāo)號為Z-2。
[0021] 進(jìn)一步地，步驟（2)、（3)和（4)中所述培養(yǎng)基成分如下： 高鹽種子培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨10,牛肉膏5，NaC130，pH7.4。 海水發(fā)酵培養(yǎng)基（SM):中速濾紙過濾后的海水1000ml，加酵母粉lg，炸貨油3% (V/V) 即成，pH為自然狀態(tài)。 合成培養(yǎng)基（CM，g/L) :NaN032. 5，K2HP044，KH2P044，MgS0 40. 2，CaCl20. 02，KCll，NaC130， 酵母粉1，炸貨油3% (V/V)，pH調(diào)至6. 5左右。 高鹽血平板采用肉胨培養(yǎng)基中加入5%的脫纖維羊血制得。高鹽肉胨培養(yǎng)基成份為 (g/L):蛋白胨10,牛肉膏3,氯化鈉30,日本瓊脂15,去離子水lOOOmL，pH調(diào)至7. 4左右。 配制血平板時(shí)，將肉胨培養(yǎng)基滅菌取出冷卻至50°C左右后，加入5%的脫纖維無菌羊血混 勻后迅速傾倒培養(yǎng)皿，冷卻后即得血平板。
[0022] 實(shí)施例2 :海水發(fā)酵型菌株Z-2的鑒定 對海水發(fā)酵型菌株Z-2進(jìn)行了生理生化鑒定以及16S rDNA分子鑒定，并結(jié)合細(xì)菌的形 態(tài)特征及生理生化特征確定該海水發(fā)酵型菌株的種屬。
[0023] (1)海水發(fā)酵型菌株Z-2細(xì)胞形態(tài)，生理生化特征 根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，進(jìn)行包括形態(tài)鏡檢、產(chǎn)生芽孢、革蘭氏染色，膿青素、 產(chǎn)生吲哚、還原硝酸鹽、葡萄糖氧化發(fā)酵、過氧化氫酶、明膠液化、淀粉水解、檸檬酸鹽、甲基 紅、乙酰甲基甲醇（V-P)、丙二酸鹽等各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。測定結(jié)果如下表1 : 表1海水發(fā)酵型菌株Z-2的細(xì)胞形態(tài)和生理生化特征

【權(quán)利要求】
1. 一種新型的產(chǎn)生物表面活性劑海水發(fā)酵型菌株，其特征在于，所述菌株為銅綠假單 胞菌菌株Z_2(Pseudomonas aeruginosa Z-2)，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC No. 9091。
2. -種利用如權(quán)利要求1所述銅綠假單胞菌產(chǎn)生物表面活性劑，其特征是：在海水中 添加少量酵母粉和以炸貨油為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑，海水發(fā)酵培養(yǎng)基成份 為：酵母粉1. 〇g，炸貨油30mL，中速濾紙過濾后的天然海水1000mL，pH值自然狀態(tài)，121°C滅 囷后備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的銅綠假單胞菌Z-2具有很好的耐鹽性，其特征在于：在鹽度 為30-35%。的天然海水中可正常發(fā)酵。
【文檔編號】C12N1/20GK104087525SQ201410211268
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】張祥勝, 張飛, 苗麗平, 周沖 申請人:鹽城師范學(xué)院