一種短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株(Vibrio?sp.S-3)及其應(yīng)用，該短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株于2013年9月30日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC?No.8299。本發(fā)明的短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株在生產(chǎn)洗滌劑添加劑方面以及生產(chǎn)酶解豆粕的蛋白酶方面的應(yīng)用。本發(fā)明篩選到的產(chǎn)蛋白酶菌株Vibrio?sp.S-3能高效地產(chǎn)生蛋白酶，用于洗滌劑添加劑，酶解豆粕，提高了資源利用率，降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白酶是作用于蛋白質(zhì)或多肽催化肽鍵水解的水解酶類，是最重要的三大工業(yè)用酶之一，具有催化能力高、反應(yīng)條件溫和、底物專一性等特點。蛋白酶的銷售額約占全球酶制劑市場的60 %，對經(jīng)濟的發(fā)展起著重要的作用。蛋白酶廣泛分布于動物、植物、微生物中。通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶我們把它稱之為微生物蛋白酶，與菠蘿、木瓜、豬胰臟等傳統(tǒng)的動植物資源相比，微生物蛋白酶資源具有無法比擬的優(yōu)勢。隨著基因工程的加入、發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展、酶制劑的廣泛應(yīng)用及新型發(fā)酵設(shè)備的發(fā)明，微生物成為工業(yè)用蛋白酶的主要來源。蛋白酶的用途非常廣泛，最大的用途是洗滌劑，其次用于飼料、食品工業(yè)、釀酒釀造，以及制革工業(yè)和醫(yī)藥。全世界洗滌劑的年產(chǎn)量已達1.3億噸，在歐洲加酶洗衣粉的比例達到80%左右，美國45%的 洗滌劑加酶，日本加酶的洗衣粉比例也達60%以上，全世界堿性蛋白酶的銷售額約占世界酶制劑市場的25%。
[0003]我國是世界上最大的養(yǎng)殖生產(chǎn)國、飼料原料(特別是蛋白質(zhì)原料)需求大國之一，但是我國飼料工業(yè)生產(chǎn)中蛋白質(zhì)飼料資源的嚴(yán)重不足，魚粉等高品質(zhì)動物蛋白原料主要依賴國際進口，而目前全球性魚類資源的日趨減少直接導(dǎo)致魚粉價格上漲，動物蛋白價格高漲使得人們將視線逐漸轉(zhuǎn)向了植物蛋白。豆柏作為一種質(zhì)量穩(wěn)定的植物蛋白原料，一直是餅柏消費的主體，加之動物性蛋白資源日益短缺，價格居高不下，促使豆柏植物性蛋白原料需求的擴大。但由于豆柏中抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在以及其適口性差等問題限制了豆柏的應(yīng)用價值。
[0004]目前，我國的蛋白酶研究還存在蛋白酶種類單一、微生物來源較少等問題，因此尋找和開發(fā)新的微生物蛋白酶來源是目前科研的重點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株及其應(yīng)用，旨在解決我國蛋白酶研究還存在蛋白酶種類單一、微生物來源較少等問題。
[0006]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株(Vibrio sp.S-3)，于2013年9月30日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC N0.8299，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。該短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株的16S rRNA序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，該菌株為革蘭氏陰性菌，菌落為乳白色、圓形、平整、邊緣整齊濕潤的光滑小菌落。
[0007]本發(fā)明進一步提供上述短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株在生產(chǎn)洗滌劑添加劑方面的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明進一步提供上述短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株在生產(chǎn)酶解豆柏的蛋白酶方面的應(yīng)用。
[0009]相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明從短蛸胃腸道內(nèi)篩選了一種產(chǎn)蛋白酶菌株Vibrio sp.S-3，高效地產(chǎn)生蛋白酶，用于洗滌劑添加劑，酶解豆柏，提高了資源利用率，降低了生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本發(fā)明實施例1中各菌株發(fā)酵液的蛋白酶活力圖；
[0011]圖2為本發(fā)明實施例1中Vibrio sp.S_3系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0012]圖3為本發(fā)明實施例2中不同碳源對Vibrio sp.S-3菌株產(chǎn)蛋白酶的影響圖；
[0013]圖4為本發(fā)明實施例2中不同氮源對Vibrio sp.S-3菌株產(chǎn)蛋白酶的影響圖；
[0014]圖5為培養(yǎng)基起始pH值對Vibrio sp.S-3菌株產(chǎn)蛋白酶的影響圖；
[0015]圖6為本發(fā)明實施例2中培養(yǎng)溫度對Vibrio sp.S-3菌株產(chǎn)蛋白酶活力的影響圖；
[0016]圖7為本發(fā)明實施例2中培養(yǎng)時間對Vibrio sp.S_3菌株產(chǎn)蛋白酶活力的影響圖?！揪唧w實施方式】
[0017]以往人們多從土壤、溫泉水中采集樣本篩選產(chǎn)蛋白酶微生物，近年來，人們逐漸將開發(fā)利用的眼光投向海洋。海洋特有的環(huán)境造就了海洋生物的多樣性與獨特性，低溫、高壓、高鹽量使得海洋生物中一些酶、激素以及其他代謝產(chǎn)物有著極高的活性,海洋生物也將成為各國學(xué)者研究的主要對象。章魚屬軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、八腕目(Octopoda)、章魚科(octopodidae),學(xué)名“蛾”。其體短，卵圓形，無鰭，頭上生八腕，腕長短不等，腕間有膜相連，腕上吸盤無柄。根據(jù)腕的長短，章魚主要分為8種，分別為短蛸、卵蛸、雙點蛸、真蛸、環(huán)蛸、長蛸、紡錘蛸、嘉庚蛸。本發(fā)明所選用的章魚為短蛸(Octopusocellatus)，屬軟體動物門、頭足綱、八腕目、章魚科、蛸屬，主要棲居于溫帶偏北海域，是我國北方沿岸蛸類中最重要的經(jīng)濟種。
[0018]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0019]實施例1:Vibrio sp.S-3菌株的制備:
[0020]一、材料與培養(yǎng)基:
[0021]1、材料短蛸
[0022]2、培養(yǎng)基
[0023]選擇培養(yǎng)基:2216E培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的制備方法詳見文獻:Christer0.1ntestinalColonization Potential of Turbot(Scophthalmus maximus)-and Dab(LimandaIimanda)-Associated Bacteria with Inhibitory Effects against VibrioanguiIlarum[J].APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 1992(58):551-556.；
[0024]酪蛋白培養(yǎng)基:酪蛋白1%，酵母膏0.1%，瓊脂1.5%，pH7.2，海水配制，以上為質(zhì)量濃度，即酪蛋白為lg/100mL ； [0025]液體發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉0.5 %，蛋白胨0.5 %，酵母膏0.1%，磷酸高鐵0.0I %，培養(yǎng)基起始PH8.0，該培養(yǎng)基用海水配制，以上為質(zhì)量濃度，即淀粉為0.5g/100mL ；
[0026]固體培養(yǎng)基:稱取4gLB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基溶解于100mL海水中。
[0027]二、短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌的篩選:
[0028]選用酪蛋白培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基的原理是產(chǎn)蛋白酶菌種在酪蛋白培養(yǎng)基中生長時，產(chǎn)的蛋白酶可水解培養(yǎng)基中的酪蛋白，產(chǎn)生透明圈。因此，以酪蛋白水解透明圈的大小可進行產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選。
[0029]1、初篩
[0030]將活短蛸解剖，取其胃腸道，去掉腸道雜物，用無菌海水沖洗數(shù)次，勻漿，得到菌液原液，將原液稀釋成10_\ 10_2濃度梯度，分別涂布于2216E培養(yǎng)基，于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0031]挑取培養(yǎng)基上的單菌落，稀釋劃線培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)ld，得到純的單菌落，將單菌落點種于酪蛋白培養(yǎng)基上，觀察各菌株產(chǎn)透明圈情況。
[0032]結(jié)果:酪蛋白培養(yǎng)基上水解透明圈直徑與菌落直徑的比值(D/d值)越大說明產(chǎn)酶能力越強。菌株的初篩共得到10株在酪蛋白培養(yǎng)基上產(chǎn)透明圈的菌株，記為S-1，
S-2，......，S-10，其中，菌株S-l、S-2、S-3和S-8所產(chǎn)透明圈直徑和菌落直徑比值較大。
[0033]2、復(fù)篩:
[0034]將產(chǎn)透明圈的菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，于25 °C搖瓶培養(yǎng)3d,在4°C,10000r/min條件下離心10min，取上清液，測定其蛋白酶活力，篩選出產(chǎn)蛋白酶活力最高的菌株，作為出發(fā)菌株。
[0035]三、蛋白酶活力測定方法:
[0036]參照《SBT10317-1999蛋白酶活力測定法》的福林酚法，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%酪蛋白溶于0.2mol/LPBS(pH7.2)緩沖液中作為底物，將0.2ml酪蛋白底物和0.2ml樣品分別在37°C預(yù)熱lOmin，充分混勻后，37°C水浴反應(yīng)lOmin。反應(yīng)結(jié)束后加入0.4mlTCA終止反應(yīng)，放入37°C水浴鍋中靜置20min, 10000r/min離心5min,取上清液0.2ml,向上清液中加入ImlNa2CO3和0.2ml福林試劑，37 °C靜置水浴20min，結(jié)束后660nm下測吸光值，計算酶活力。
[0037]酶活力定義為在40°C，每毫升酶液每分鐘催化酪蛋白水解生成I μ g酪氨酸的酶量為I個單位(U/mL)。
[0038]將初篩得到的10株菌株分別接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，進行搖瓶培養(yǎng)，測定其粗酶液的蛋白酶活力，結(jié)果見圖1所示，S-3菌株產(chǎn)的蛋白酶活性最高，其次為S-1菌株和S-8菌株，蛋白酶活力分別為52，49和35U/mL，綜合水解透明圈和酶活力兩個因素，選擇S-3菌株為出發(fā)菌株，進行后續(xù)試驗。
[0039]四、S-3菌株的鑒定:
[0040] 1、形態(tài)特征:
[0041]觀察S-3菌株在固體培養(yǎng)基上的生長狀況，記錄形態(tài)特征，通過革蘭氏染色觀察菌株的個體形態(tài)等。
[0042]對培養(yǎng)24h的S-3菌株進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)，S-3菌株為革蘭氏陰性菌，短桿狀。菌落為乳白色、圓形、平整、邊緣整齊濕潤的光滑小菌落。
[0043]2、生理生化鑒定[0044]對S-3菌株進行生理生化鑒定試驗，結(jié)果如表1所示:
[0045]表1生理生化實驗結(jié)果
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株(Vibrio sp.S-3)，于2013年9月30日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC N0.8299。
2.權(quán)利要求1所述的短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株在生產(chǎn)洗滌劑添加劑方面的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述 的短蛸胃腸道產(chǎn)蛋白酶菌株在生產(chǎn)酶解豆柏的蛋白酶方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK103966132SQ201410195252
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月9日
【發(fā)明者】金玉蘭, 王玉榮, 肖 琳 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)