用蜜蜂loc726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一用蜜蜂LOC726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法，包括蜜蜂樣本采集、蜜蜂頭部RNA提取、蜜蜂頭部cDNA合成、引物設(shè)計(jì)、qRT-PCR反應(yīng)體系和條件，以及蜂王漿產(chǎn)量性能鑒別。本發(fā)明從分子生物學(xué)高度，針對(duì)蜂王漿生產(chǎn)受蜂群群勢(shì)、蜜源、環(huán)境、氣候等條件影響巨大的問題，提供了能夠更科學(xué)、準(zhǔn)確地鑒別蜂群的王漿產(chǎn)量性能優(yōu)劣的熒光定量PCR方法，可以大大縮短蜂王漿生產(chǎn)性狀考察周期，加快蜜蜂育種速度，降低蜂王漿生產(chǎn)性狀考察的成本和育種成本，還能減輕田間蜂王漿產(chǎn)量性能考察的工作強(qiáng)度。
【專利說明】用蜜蜂L0C726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用熒光定量PCR技術(shù)鑒別蜂王漿產(chǎn)量性能的方法，具體涉及一種用蜜蜂L0C726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是養(yǎng)蜂大國，更是蜂王漿的主要生產(chǎn)國，全世界90 %以上王漿產(chǎn)自中國，王漿高產(chǎn)蜜蜂更是我國特有的蜂種資源。一直以來，我國的蜂業(yè)科技工作者致力于王漿高產(chǎn)蜜蜂遺傳育種的相關(guān)研究，以期發(fā)現(xiàn)王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為蜜蜂王漿高產(chǎn)育種服務(wù)。在蜜蜂形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞學(xué)水平、生化水平及分子水平對(duì)王漿高產(chǎn)相關(guān)的遺傳標(biāo)記進(jìn)行了研究。概述如下:
[0003]1、形態(tài)學(xué)遺傳標(biāo)記
[0004]邵瑞宜等(2003)發(fā)現(xiàn)工蜂頭重與咽下腺重量存在極顯著相關(guān)性，且咽下腺重量可作為衡量王漿生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)，因此吐漿工蜂的頭部重量與王漿生產(chǎn)性能可能存在一定相關(guān)性。鄭愛娟等(2010)發(fā)現(xiàn)，漿蜂工蜂蛹的頭重在各日齡均極顯著高于原種意大利蜜蜂工蜂蛹頭重，工蜂頭重有可能成為王漿高產(chǎn)蜂種在外部形態(tài)學(xué)水平上的標(biāo)記。蜜蜂咽下腺是位于工蜂頭部的合成并分泌蜂王漿的主要腺體，其活性常被用于衡量蜜蜂的泌漿能力。人們研究咽下腺的解剖形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)，工蜂的咽下腺小囊數(shù)、咽下腺大小和重量、以及咽下腺體外合成蛋白質(zhì)的速率均可作為咽下腺活性的衡量指標(biāo)，其中工蜂的咽下腺長度與王漿產(chǎn)量的相關(guān)性最大，可能作為意蜂王漿生產(chǎn)性能較理想的形態(tài)學(xué)遺傳標(biāo)記。
[0005]2、細(xì)胞學(xué)遺傳標(biāo)記
[0006]通過對(duì)“浙農(nóng)大I號(hào)”意蜂雄蜂和原種意蜂雄蜂的染色體核型進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)不同蜂種雄蜂的第7、10、12條染色體的臂比存在著極顯著差異。這種差異可能是“浙農(nóng)大I號(hào)”意蜂雄蜂染色體復(fù)制時(shí)，控制產(chǎn)漿性狀的多對(duì)等位基因片段重復(fù)復(fù)制，造成了微效基因數(shù)增多的緣故。染色體G帶分析中還發(fā)現(xiàn)第三條染色體“浙農(nóng)大I號(hào)”意蜂比原種意蜂多了一個(gè)條帶。
[0007]3、生化遺傳標(biāo)記
[0008]同工酶是由遺傳差異產(chǎn)生的多酶形式，可以直接反映基因表達(dá)的差異性，可作為一種生化遺傳標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于群體遺傳、分子育種和種屬鑒定的研究。蜜蜂研究中的蘋果酸脫氫酶(MDH)是由三個(gè)等位基因編碼的等位基因酶，其遺傳性極穩(wěn)定。其酶譜可分為三個(gè)區(qū)帶:MDH 1、MDH I1、MDH III，但只有MDH II在不同級(jí)型和不同發(fā)育階段呈多態(tài)性。通過分析MDH II的基因型頻率、基因頻率和雜合純合度，已在王漿高產(chǎn)蜂種的生化遺傳標(biāo)記研究方面取得了一定進(jìn)展。關(guān)迎輝等(1994)研究發(fā)現(xiàn)，王漿高產(chǎn)蜜蜂(“浙農(nóng)大I號(hào)”意蜂)的MDH II雜合度比其他兩種意蜂(湖北意蜂和原種意大利蜜蜂)的高，且新發(fā)現(xiàn)了其他兩種王漿低產(chǎn)意蜂中所沒有的aa、ab基因型，可作為王漿高產(chǎn)蜂種的生化遺傳標(biāo)記。此外，西方蜜蜂的三個(gè)亞種蜜蜂的MDH II的基因型頻率、基因頻率及雜合純合度均存在極顯著差異，這一結(jié)果表明，可通過測定MDH II的基因頻率和雜合純合度從生化遺傳角度對(duì)不同蜂種進(jìn)行鑒定。鮑秀良(1997)研究報(bào)道，王漿高產(chǎn)蜜蜂(“浙農(nóng)大I號(hào)”意蜂)及其他四種意蜂品系的MDH II多態(tài)性呈顯著性差異。綜上得知，蜜蜂的蘋果酸脫氫酶II (MDH II)有可能成為王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的生化水平的遺傳標(biāo)記。
[0009]4、分子遺傳標(biāo)記
[0010]目前已在微衛(wèi)星位點(diǎn)研究、基因研究方面取得的一定進(jìn)展，但是在基因水平的研究不多見，還需要運(yùn)用更成熟、更科學(xué)的技術(shù)對(duì)其進(jìn)一步研究。
[0011]自從1993年在蜜蜂的基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星以來，蜜蜂遺傳學(xué)家利用微衛(wèi)星進(jìn)行了許多研究，這些研究主要集中在蜜蜂種質(zhì)資源上的品質(zhì)分類、起源、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析以及遺傳多樣性研究等，為蜜蜂的遺傳育種工作奠定了基礎(chǔ)。有學(xué)者通過采用10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)3種產(chǎn)漿能力不同的蜜蜂(“浙農(nóng)大I號(hào)”意蜂、本地意蜂、原種意蜂)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在3個(gè)蜂種中共擴(kuò)增出96個(gè)等位基因，包含48個(gè)差異等位基因，即表明這10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在3個(gè)蜂種中呈高度多態(tài)性，且這3個(gè)蜂種之間存在一定的遺傳距離。等位基因頻率的分析結(jié)果表明，其中6個(gè)位點(diǎn)的7個(gè)等位基因的頻率是隨著蜜蜂產(chǎn)漿能力的變強(qiáng)而順序增加，且“浙農(nóng)大I號(hào)”意蜂的這7個(gè)等位基因頻率均顯著高于其他兩種蜜蜂，同時(shí)，另外4個(gè)位點(diǎn)的4個(gè)等位基因頻率則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，即“浙農(nóng)大I號(hào)”意蜂的等位基因頻率顯著低于其他兩種蜜蜂。“浙農(nóng)大I號(hào)”意蜂、本地意蜂、原種意蜂都是屬于西方蜜蜂的同一亞種，它們的產(chǎn)漿性能差異主要來自于人工選擇后形成的遺傳多樣性，通過微衛(wèi)星DNA分析技術(shù)對(duì) 三個(gè)蜂種研究證明了蜜蜂產(chǎn)漿性狀的62% -89%是由遺傳因素決定，而上述10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率在三個(gè)產(chǎn)漿性能各異的蜂種中呈現(xiàn)出了非常規(guī)律的多樣性。據(jù)此推測，這10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因的頻率可能與王漿產(chǎn)量性狀存在緊密的連鎖關(guān)系。
[0012]1999年，有人從基因水平對(duì)王漿高產(chǎn)性狀進(jìn)行了初步探索。W316bp是以隨機(jī)引物W(5’ 一CGGCCCCGGT—3’)，通過RAPD-PCR擴(kuò)增獲得的特異DNA片段，眾多研究表明W316bp只出現(xiàn)在王漿高產(chǎn)意蜂的多態(tài)性圖譜中。王尉平等(2002)利用12種隨機(jī)引物對(duì)產(chǎn)漿能力不同的四個(gè)蜜蜂品系(“浙農(nóng)大I號(hào)”意蜂、平湖漿蜂、蕭山漿蜂、卡蜂)進(jìn)行了 RAPD-PCR和Southern雜交分析，得到了王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的特異標(biāo)記P2W316bp。張婭娟等(2001)將W316bp制備成探針，分別與王漿高產(chǎn)蜜蜂和卡蜂的RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，結(jié)果再次表明，W316bp可能是王漿高產(chǎn)意蜂特有的基因片段。
[0013]但也有學(xué)者對(duì)此提出了質(zhì)疑。他們認(rèn)為，以上實(shí)驗(yàn)的蜜蜂種類和樣本量太少，以及樣本選擇也不是非?？茖W(xué)，不能因?yàn)槿齻€(gè)王漿高產(chǎn)蜜蜂中有而低產(chǎn)蜜蜂中沒有就簡單推定W316bp可以作為王漿高產(chǎn)性狀的標(biāo)記，它還有可能與四個(gè)不同蜂種的其他生物學(xué)特性有關(guān)。
[0014]因此，有必要借助更加強(qiáng)大成熟、更加科學(xué)的分子研究技術(shù)從基因水平對(duì)王漿高產(chǎn)性狀進(jìn)行研究，以探討從分子生物學(xué)水平上鑒別蜜蜂王漿產(chǎn)量性能的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用蜜蜂L0C726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法。所述蜜蜂L0C726515基因，指蜜蜂預(yù)測的新基因L0C726515。
[0016]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明一種用蜜蜂L0C726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法，包括以下步驟:
[0017](1)蜜蜂取樣:從被考察蜂群中，每群分別采集30只哺育蜂，所述哺育蜂指蜂群中哺育幼蟲的工蜂，即6 — 12日齡的工蜂；
[0018](2)蜜蜂頭部RNA提取及cDNA合成:提取所采集哺育蜂頭部的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ;即采用TRizol方法提取RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成cDNA的合成；
[0019](3)引物設(shè)計(jì):設(shè)計(jì)合成引物Primer-F和Primer-R, Primer-F的序列如SEQ IDN0.3所示，Primer-R的序列如SEQ ID N0.4所示；
[0020](4)熒光定量PCR檢測:以稀釋后的蜜蜂頭部cDNA為模板，以Primer-F和Primer-R為引物，進(jìn)行熒光定量PCR ;選用蜜蜂頭部的GAPDH為內(nèi)參基因，采用2_ΛΛ et方法計(jì)算蜜蜂L0C726515基因的表達(dá)量；在每個(gè)蜂群樣本的每次qRT-PCR反應(yīng)中均重復(fù)多次，取多次重復(fù)的平均值為蜜蜂L0C726515基因的最終表達(dá)量，最終表達(dá)量越高，則表明該蜂群的蜂王漿產(chǎn)量性能越好；所述2_ΛΛε?為蜜蜂L0C726515基因的相對(duì)表達(dá)量，其中AACt =
(Cttarget ^^GAPDH^ treatment (Cttarget Ct(JAPDH) control °
[0021]進(jìn)一步地，所述熒光定量PCR的反應(yīng)體系為:總體積為20ul，內(nèi)含SYBR GreenI IOul, Rox0.4ul, Primer-F0.4ul, Primer-R0.4ul, cDNA2ul, DEPC 水補(bǔ)足到 20ul。
[0022]進(jìn)一步地，所述熒光定量PCR的反應(yīng)條件如下:預(yù)變性95°C，30s，PCR反應(yīng)40cycles，95°C，5s，61°C，31s，溶解曲線 55°C，20s。
[0023]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果:本發(fā)明對(duì)篩選蜜蜂L0C726515基因進(jìn)行深入的研究，通過定向選育手段，在同一蜂種中分別培育了王漿高產(chǎn)和王漿低產(chǎn)蜜蜂。根據(jù)從NCBI上檢索的9792條已注釋的蜜蜂基因和本發(fā)明在蜜蜂幼蟲中新檢測的1722條基因，以及175條與王漿分泌可能緊密相關(guān)的基因，設(shè)計(jì)和制備了含有11689條蜜蜂基因的基因芯片(Agilent)，分別與王漿高產(chǎn)蜜蜂及王漿低產(chǎn)蜜蜂中正在吐漿的哺育蜂的頭部cDNA進(jìn)行雜交，初步篩選出369條差異表達(dá)的基因。另外，采集王漿高、低產(chǎn)蜜蜂樣本，通過qRT-PCR技術(shù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出蜜蜂L0C726515基因，作為蜂王漿產(chǎn)量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。進(jìn)而設(shè)計(jì)引物，以蜜蜂頭部cDNA為模板，以Primer-F和Primer-R為引物，進(jìn)行熒光定量PCR;選用蜜蜂頭部的GAPDH為內(nèi)參基因，采用2_AAet方法計(jì)算蜜蜂L0C726515基因的表達(dá)水平；其結(jié)果為蜂王漿產(chǎn)量性能與蜜蜂L0C726515基因的最終表達(dá)量密切相關(guān)，蜜蜂L0C726515基因的最終表達(dá)量高，則蜂王漿產(chǎn)量性能好。
[0024]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，顯著優(yōu)點(diǎn)是:
[0025]1、因?yàn)榉渫鯘{生產(chǎn)受蜂群群勢(shì)、蜜源、環(huán)境、氣候等條件影響巨大，本發(fā)明采用的蜜蜂L0C726515基因作為蜂王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，能夠更科學(xué)、準(zhǔn)確地檢測蜂群的王漿生產(chǎn)性狀的優(yōu)劣，為蜜蜂王漿高產(chǎn)育種提供分子輔助選育手段。
[0026]2、可以在實(shí)驗(yàn)室方便地檢測蜜蜂L0C726515基因表達(dá)豐度以判斷蜂群的王漿生產(chǎn)性狀，減輕田間蜂王漿生產(chǎn)性狀考察的工作強(qiáng)度。
[0027]3、蜂群從繁殖到蜂王漿生產(chǎn)需要兩個(gè)月以上的時(shí)間，蜂王漿生產(chǎn)性狀考察周期在三個(gè)月以上，而蜜蜂L0C726515基因表達(dá)豐度檢測只需要一天時(shí)間，所以，采用本發(fā)明可以大大縮短蜂王漿生產(chǎn)性狀考察周期，加快育種速度。
[0028]4、本發(fā)明方法與傳統(tǒng)方法相比，能大大降低蜂王漿生產(chǎn)性狀考察的成本和育種成本?！揪唧w實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。
[0030]實(shí)施例1
[0031]本發(fā)明一種用蜜蜂L0C726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法，包括以下步驟:
[0032]1、蜜蜂樣本采集
[0033]①產(chǎn)漿季節(jié)，連續(xù)5次對(duì)浙江千島湖實(shí)驗(yàn)蜂場的30群蜜蜂組織生產(chǎn)王漿，稱量并記錄每群每次的王漿重量及王臺(tái)接受數(shù)量。
[0034]②分別篩選出5個(gè)王漿高產(chǎn)蜂群和5個(gè)王漿低產(chǎn)蜂群以及其他4個(gè)王漿產(chǎn)量在高產(chǎn)和低產(chǎn)之間且王漿產(chǎn)量呈梯度趨勢(shì)的蜂群，共14個(gè)蜂群作為被考察蜂群。所述王漿高產(chǎn)蜂群和王漿低產(chǎn)蜂群的王漿產(chǎn)量范圍為高產(chǎn)群三天一批群產(chǎn)蜂王漿不低于100克，而低產(chǎn)群三天一批群產(chǎn)蜂王漿不高于80克；
[0035]③再次組織所選定蜂群進(jìn)行王漿生產(chǎn)，產(chǎn)漿的第二天，用鑷子分別在14個(gè)蜂群中每群采集30只正在吐 漿的哺育蜂，立即放入液氮，接著分類裝管并于_80°C冰箱保存。
[0036]2、RNA 提取
[0037]①從超低溫冰箱中取出蜜蜂樣本，用滅菌后的剪刀剪下蜜蜂的頭部(在冰上操作)，并用DEPC水配制的PBS緩沖液洗去蜜蜂頭部的灰塵。所述PBS為磷酸緩沖液。
[0038]②將蜜蜂頭部放入研缽中，加入液氮并研磨為粉末，然后將粉末轉(zhuǎn)移至50ml離心管，于離心管中加入TRizol，30只蜜蜂加3ml。用勻漿儀或振蕩器進(jìn)行振蕩、勻漿處理。
[0039]③將勻漿樣品在室溫放置lOmin，使核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物完全分離，且4°C 12000g離心IOmin,取上清。
[0040]④將所取上清轉(zhuǎn)移至3個(gè)1.5ml離心管，并加入氯仿，振蕩15秒，室溫放置5min，所述氯仿的加入量為每使用3mlTRizol,加入0.6ml氯仿。
[0041]⑤4°C 12000g離心15min,取上清500ul轉(zhuǎn)移至新的2ml離心管中。
[0042]⑥上清液中加入等體積的異丙醇(沉淀水相中的RNA)，混勻后室溫放置lOmin。
[0043]⑦4°C 12000g離心10min。管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，棄上清(若沉淀質(zhì)量不好，需在此沉淀的基礎(chǔ)上，重新加TRizol進(jìn)行抽提)。
[0044]⑧用體積濃度為75 %的乙醇(冰預(yù)泠，DEPC水配制)洗滌RNA沉淀。每使用3mlTRizol至少加3111175%乙醇,振蕩幾下,不超過7500g離心5min,棄上清。
[0045]⑨室溫干燥lOmin，加40ul DEPC水，用槍頭吸打幾次，55°C放置lOmin，使RNA溶解。
[0046]⑩Total RNA濃度測定:用NanoDrop2000檢測所提取RNA的濃度以及A260/A280值。
[0047]3、cDNA 合成
[0048]①將上述符合要求的RNA稀釋40倍(3ulRNA+117ulDEPC水)。
[0049]②把RNA在65°C條件下熱變性5min，立即放于冰上冷卻。
[0050]③用反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成cDNA的合成，配置如下反應(yīng)液(50ul體系):
[0051]Total RNA，0.6ul (注 Total RNA 的使用量為 500_1000ng) ;5*RTbuffer，IOul ;Primer mix, 2.5ul ；RT Enzyme Mix, 2.5ul ；RNase free dH20 加至總反應(yīng)體積為 50ul。[0052]④反應(yīng)條件:37°C 15min (反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))
[0053]98°C 5min (酶失活反應(yīng))
[0054]⑤取出置于冰上備用，或置于_20°C條件下保存。
[0055]⑥cDNA濃度測定:用NanoDrop2000測定cDNA的濃度以及A260/A280值。
[0056]4、引物設(shè)計(jì)
[0057]我們對(duì)蜜蜂基因組預(yù)測(L0C726515)基因進(jìn)行了 qRT_PC篩選驗(yàn)證，應(yīng)用primer5.0和Primer3Plus軟件設(shè)計(jì)該基因引物，由上海生工生物工程有限公司完成引物合成。共設(shè)計(jì)與合成了 2對(duì)引物，包括I個(gè)驗(yàn)證基因和I個(gè)參照基因GAPDH(Control)。設(shè)計(jì)和選擇引物的最主要原則是，首先確保引物的特異性，能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增出目的產(chǎn)物；其次是擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為80~250bp，因?yàn)檫@個(gè)范圍內(nèi)的擴(kuò)增片段比較適用于qRT-PCR方法，擴(kuò)增片段太長會(huì)降低擴(kuò)增效率且容易導(dǎo)致非特異性反應(yīng)，擴(kuò)增片段太短也會(huì)影響產(chǎn)物的非特異性擴(kuò)增，影響定量的準(zhǔn)確性；最后，所用引物的GC含量在40-60%范圍內(nèi)，且退火溫度(Tm值)宜保持一致，有利于整體反應(yīng)條件的設(shè)置。引物序列結(jié)果如表1所示。
[0058]表1:目的基因的引物序列(SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.4)
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種用蜜蜂L0C726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法，其特征在于，鑒別方法如下: (1)蜜蜂取樣:從被考察蜂群中，每群分別采集30只哺育蜂；所述哺育蜂指蜂群中哺育幼蟲的工蜂，即6 — 12日齡的工蜂； (2)蜜蜂頭部RNA提取及cDNA合成:提取所采集哺育蜂頭部的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA； (3)引物設(shè)計(jì):設(shè)計(jì)合成引物Primer-F和Primer-R,Primer-F的序列如SEQID N0.3所示，Primer-R的序列如SEQ ID N0.4所示； (4)熒光定量PCR檢測:以稀釋后的蜜蜂頭部cDNA為模板，以Primer-F和Primer-R為引物，進(jìn)行熒光定量PCR;選用蜜蜂頭部的GAPDH為內(nèi)參基因，采用2_AAct方法計(jì)算蜜蜂LOC726515基因的表達(dá)量；在每個(gè)蜂群樣本的每次qRT-PCR反應(yīng)中均重復(fù)多次，取多次重復(fù)的平均值為蜜蜂LOC726515基因的最終表達(dá)量，最終表達(dá)量越高，則該蜂群的蜂王漿產(chǎn)量性能越好；所述2_ΛΛε?為蜜蜂LOC726515基因的相對(duì)表達(dá)量，其中ΛΛ Ct =(Cttarget Ct(JAPDH) treatment (Cttarget Ct(JAPDH) control °
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蜜蜂L0C726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述熒光定量PCR的反應(yīng)體系為:總體積為20ul，內(nèi)含SYBR Green I IOul, Rox0.4ul, Primer-F 0.4ul, Primer-R 0.4ul, cDNA 2ul, DEPC 水補(bǔ)足到 20ul。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蜜蜂L0C726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述熒光定量PCR的反應(yīng)條件如下:預(yù)變性95°C，30s，PCR反應(yīng)40 cycles，95°C，5s，61。。，31s，溶解曲線 55°C, 20sο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蜜蜂L0C726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述蜂頭部RNA提取及cDNA合成，采用TRizol方法提取RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成cDNA的合成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蜜蜂L0C726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述稀釋后的蜜蜂頭部cDNA，即用DEPC水將蜜蜂頭部cDNA稀釋6倍體積。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蜜蜂L0C726515基因檢測蜂王漿產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述在每個(gè)蜂群樣本的每次qRT-PCR反應(yīng)中均重復(fù)多次，其重復(fù)次數(shù)為3次。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103937903SQ201410190650
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】蘇松坤, 潘嬌, 陳盛祿 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)