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一種提取純化TthDNA聚合酶的方法

文檔序號(hào):475410閱讀:733來(lái)源:國(guó)知局
一種提取純化Tth DNA聚合酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種提取純化TthDNA聚合酶的方法。包括如下步驟:取TthDNA聚合酶工程菌進(jìn)行活化和IPTG誘導(dǎo)表達(dá);用溶菌酶室溫處理后加入DTT,吐溫-20,冰上處理一段時(shí)間,離心得到粗蛋白;粗蛋白中緩慢加入二氧化硅顆粒,磁力攪拌器上攪拌,離心去除沉淀;上清液補(bǔ)足NaCl后流過(guò)已螯合Ni2+的Ni-NTA柱,再用5倍床體積洗滌緩沖溶液依次洗滌,最后用洗脫液洗脫目的蛋白,接收含目的蛋白的洗脫液;脫鹽后即得到純化的TthDNA聚合酶;得到的TthDNA聚合酶加入甘油使體積分?jǐn)?shù)為50%,-20℃保存。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單,酶活性損失小,回收蛋白的純度和回收量高。
【專利說(shuō)明】—種提取純化Tth DNA聚合酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】,尤其涉及一種提取純化Tth DNA聚合酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]Tth DNA Polymerase (Tth DNA聚合酶)是一種熱穩(wěn)定性酶,分子量為94kDa,原始酶的來(lái)源是從嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB-8中分離得到。該酶在74°C是可進(jìn)行DNA復(fù)制。Tth DNA聚合酶在鎂離子存在的條件下可催化核苷酸5’-3’方向發(fā)生聚合反應(yīng),形成雙鏈DNA,也可在錳離子存在的條件下,以RNA為模板沿5’ -3’方向發(fā)生核苷酸聚合反應(yīng)。該酶也具有5’-3’外切酶活性。Tth DNA聚合酶可用于PCR、逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR和較高溫度條件下的引物延伸反應(yīng)。特別適合應(yīng)用于一步法qRT-PCR試劑盒的開(kāi)發(fā)。
[0003]最初Tth DNA聚合酶的來(lái)源是從嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus) HB-8中分離得到,由于嗜熱棲熱菌培養(yǎng)所需要的設(shè)備昂貴、培養(yǎng)基配置復(fù)雜、培養(yǎng)溫度高、培養(yǎng)周期長(zhǎng),在培養(yǎng)過(guò)程中容易出現(xiàn)誤差導(dǎo)致培養(yǎng)效率低下,不易于大規(guī)模培養(yǎng),再加上純化過(guò)程中需要漫長(zhǎng)的層析過(guò)程,導(dǎo)致酶活性大量下降,因此酶的產(chǎn)能極其有限。
[0004]目前,因活性蛋白容易變性失活因而純化都是要求在低溫條件下進(jìn)行(冰上操作),常規(guī)純化Tth DNA聚合酶方法采用低溫超聲破碎,反復(fù)通過(guò)硫酸銨沉淀、離子交換、層析和脫鹽進(jìn)行純化,不僅高達(dá)50%的蛋白會(huì)在純化初期就會(huì)損失,而且部分基因組蛋白很難完全去除,再加上基因組蛋白的存在會(huì)導(dǎo)致上柱速度緩慢,延長(zhǎng)純化時(shí)間,純化得到的蛋白酶活降低,影響了后期酶的擴(kuò)增和逆轉(zhuǎn)錄活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單,酶活性損失小,回收蛋白的純度和回收量高的活性蛋白酶的提取方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供一種提取純化Tth DNA聚合酶的方法,其步驟為,
O工程菌的活化和表達(dá):取Tth DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)
基中,370C,200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;取活化好的菌液轉(zhuǎn)接到同樣的LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)后加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8小時(shí);離心收集菌體;收集的菌體用緩沖液A洗滌一次,離心;再用緩沖液A重懸得到表達(dá)的工程菌;
2)粗蛋白制備:將所述表達(dá)的工程菌用溶菌酶室溫處理后加入DTT,再加入吐溫-20,冰上處理一段時(shí)間,15000g/4°C /20分鐘,得到的上清即為粗蛋白;
3)粗蛋白中緩慢加入 二氧化硅顆粒,磁力攪拌器上攪拌,離心去除沉淀;
4)上清液補(bǔ)足NaCl后流過(guò)已螯合Ni2+的N1-NTA柱,該柱先用10倍床體積結(jié)合緩沖液平衡;所述結(jié)合緩沖液為20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0,5mM咪唑;再用5倍床體積洗滌緩沖溶液依次洗滌,所述洗滌緩沖液為20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0,15mM/50mM咪唑;最后用洗脫液洗脫目的蛋白,所述洗脫液為20mM Tris-HCL, 0.1MNaCl, PH8.0, 200mM咪唑,接收含目的蛋白的洗脫液;含目的蛋白的洗脫液用sephadexG25脫鹽,脫鹽緩沖液為緩沖液 B:1OmM Tris-HCl ,pH 7.5,25° C,300mM KC1,ImM DTT,0.1mM EDTA,0.5mg/mlBSA ;脫鹽后即得到純化的Tth DNA聚合酶;
任選的, 得到的Tth DNA聚合酶加入甘油使體積分?jǐn)?shù)為50%,-20°C保存。
[0007]所述Tth DNA聚合酶工程菌為從嗜熱棲熱菌HB-8中PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物,所得PCR產(chǎn)物經(jīng)Nde 1、Sal I雙酶切后克隆入經(jīng)Nde 1、Sal I雙酶切的PET28a載體上,構(gòu)建表達(dá)載體PET28a_taq,將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21 (DE3),即獲得生產(chǎn)重組Tth DNA聚合酶的工程菌株。
[0008]所述PCR擴(kuò)增所用的引物為SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2。
[0009]所述步驟I)為取Tth DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,370C,200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;取活化好的菌液轉(zhuǎn)接到同樣的LB液體培養(yǎng)基中,37°C,250轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4小時(shí)后加入IM IPTG至終濃度1.0mmol/L,28°C、250 rpm件下培養(yǎng)8小時(shí);用離心管超聲洗滌30min,并用雙蒸水潤(rùn)洗一次;12000rpm,4°C離心5分鐘收集菌體;收集的菌體用緩沖液A洗滌一次,12000rpm,4°C離心5分鐘;再用緩沖液A重懸得到表達(dá)的工程菌;所述緩沖液 A 為 20mM Tris-HCL, 0.2MNaCl, PH8.0。
[0010]所述步驟2)為將所述表達(dá)的工程菌用4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分鐘后加入DTT使終濃度為ImM,加入吐溫-20使體積百分比為0.5%,冰上處理45分鐘,15000g/4°C /20分鐘,得到的上清即為粗蛋白。
[0011]所述步驟3)為粗蛋白中緩慢加入體積系數(shù)5%的二氧化硅顆粒,磁力攪拌器上攪拌10分鐘,15000g,4°C離心20分鐘,去除沉淀。
[0012]所述步驟4)為上清液補(bǔ)足NaCl至終濃度為0.5M。
[0013]本發(fā)明生產(chǎn)工藝合理簡(jiǎn)單,僅需要溶菌酶破碎菌體,二氧化硅吸附雜蛋白和核酸,親和層析進(jìn)行純化,避免了常規(guī)耐熱聚合酶純化中加熱處理、反復(fù)通過(guò)離子交換,層析和脫鹽進(jìn)行純化。保證酶活性得到很好的保持,保證了產(chǎn)品產(chǎn)量和純度,后期使用過(guò)程中基因擴(kuò)增和逆轉(zhuǎn)錄效果良好。
[0014]1.產(chǎn)品的確認(rèn)
(I)基因來(lái)源
Tth DNA聚合酶基因?yàn)閺氖葻釛珶峋?Thermus thermophilus) HB-8中擴(kuò)增得到。
[0015]擴(kuò)增引物為:
Tth F:ataCATATGATGGAGGCGATGCTTCCGCTCTTTG SEQ ID NO:1
Tth R:ataGTCGACCTAACCCTTGGCGGAAAGCCAGTCC SEQ ID NO:2
基因序列信息:Thermus thermophilus gene for DNA polymerase I, complete cds,strain: Ml
GenBank: AB744210.1 SEQ ID NO:3 ;
(2)載體來(lái)源
PET-28a表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Novagen公司。該質(zhì)粒在克隆位點(diǎn)前有I個(gè)T7啟動(dòng)子,在T7啟動(dòng)子前有I個(gè)6XHis_Tag coding序列,是T7的增強(qiáng)子,多克隆位點(diǎn)上有NcoI—Xholll個(gè)酶切位點(diǎn),載體上還有I個(gè)卡那霉素(Kan)的篩選標(biāo)記;
(3)宿主菌
宿主菌為BL21 (DE3)菌株,即宿主菌BL21經(jīng)噬菌體DE3溶源化后,DE3的lacUV5強(qiáng)啟動(dòng)子及位于其下游的T7 RNA聚合酶基因被整合到宿主菌的基因組DNA中。宿主菌在非代謝性乳糖類似物IPTG的誘導(dǎo)作用下能產(chǎn)生大量的T7RNA聚合酶,而T7RNA聚合酶能特異性地識(shí)別Pet-28a表達(dá)載體中的T7啟動(dòng)子序列,從而高效地表達(dá)目的重組蛋白。由于IPTG不會(huì)被宿主菌利用,因此向培養(yǎng)液中加入少量的IPTG就能對(duì)lacUV5強(qiáng)啟動(dòng)子產(chǎn)生持久的誘導(dǎo)作用;
(4)Tth DNA聚合酶工程菌株
Tth DNA聚合酶基因的per產(chǎn)物經(jīng)Nde 1、Sal I雙酶切經(jīng)Nde 1、Sal I雙酶切的PET28a載體上,構(gòu)建表達(dá)載體PET28a_taq,將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21 (DE3),即獲得生產(chǎn)重組Tth D NA聚合酶的工程菌株。
[0016]2.產(chǎn)品的制備
①用50ml 緩沖液 A (20mM Tris-HCL, 0.2MNaCl, PH8.0)重懸菌體(生產(chǎn)重組 Tth DNA聚合酶的工程菌株),4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分鐘,加入DTT使終濃度為ImM,加入吐溫-20使體積百分比為0.5%,冰上處理45分鐘,15000g/4°C /20分鐘,得到的上清即粗蛋白;
②粗蛋白中緩慢加入體積系數(shù)5%的二氧化硅顆粒,磁力攪拌器上攪拌10分鐘(吸附基因組DNA和雜蛋白),15000g/4°C /20分鐘,去除沉淀;
③上清液補(bǔ)足NaCl至終濃度為0.5M,流過(guò)已螯合Ni2+的N1-NTA柱,該柱先用10倍床體積結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0, 5mM咪唑)平衡;再用5倍床體積洗滌緩沖溶液(20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0,15mM/50mM咪唑)依次洗滌;最后用洗脫液(20mM Tris-HCL, 0.1MNaCl, PH8.0, 200mM咪唑)洗脫目的蛋白。含目的蛋白的洗脫液用s印hadexG25 脫鹽,脫鹽緩沖液為緩沖液 B:(10mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25° C),300mMKCl7ImM DTT,0.1mM EDTA,0.5mg/ml BSA)。脫鹽后加入甘油使體積分?jǐn)?shù)為50%,_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0017]3.產(chǎn)品的用途
本酶具有在Mn2+離子存在的條件下顯示逆轉(zhuǎn)錄活性的獨(dú)有的特性。利用該特性,可用同一酶在同一管中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與PCR(one-STEP RT-PCR )反應(yīng)。
[0018]特點(diǎn)1:擴(kuò)增高GC含量具有高效率
與Taq DNA polymerase相比,對(duì)GC-rich目的片段及粗樣品的擴(kuò)增效率更出色。
[0019]特點(diǎn)2:可用單酶完成RT-PCR
由于本酶在Mn2+離子存在條件下顯示RTase活性,優(yōu)化反應(yīng)緩沖液后只用本酶即可完成RT-PCR并且本酶在55-60°C時(shí)可進(jìn)行RT反應(yīng),因此適用于容易形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的目的片段的逆轉(zhuǎn)錄及后續(xù)擴(kuò)增。
[0020]有益效果:
1.和傳統(tǒng)DNA聚合酶提取方法對(duì)比,本發(fā)明只需要親和層析柱和脫鹽柱,步驟少,操作簡(jiǎn)單,避免反復(fù)使用離子交換柱和層析柱,容易在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蛋白純化并且有效保障蛋白回收率。
[0021]2.和傳統(tǒng)DNA聚合酶提取方法對(duì)比,提取純化過(guò)程不需要75°C加熱步驟,最大限度降低Tth DNA聚合酶提取過(guò)程的酶活性損失,保障后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄和基因擴(kuò)增效果。
[0022]3.和傳統(tǒng)DNA聚合酶提取方法對(duì)比,提取純化過(guò)程加入二氧化硅進(jìn)行基因組和雜雜蛋白的吸附,去除大部分核酸和雜蛋白,上柱速度快,有效減少親和層析柱中核酸和雜蛋白的非特異性吸附機(jī)會(huì),有利于保證回收蛋白的純度和回收量。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1是SDS-PAGE純度檢測(cè)電泳圖。
[0024]圖2是Tth DNA聚合酶活性檢測(cè)結(jié)果圖。
[0025]圖3是不加Tth DNA聚合酶的活性檢測(cè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例,所述實(shí)施例的示例在附圖中示出,其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的,旨在用于解釋本發(fā)明,而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者,按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀 器未注明生產(chǎn)廠商者,均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0027]實(shí)施例1:
一、主要試劑準(zhǔn)備
1.LB液體培養(yǎng)基(1000 mL)
NaCl:10g
蛋白胨:10g 酵母粉:5g
2.緩沖液A (20mM Tris-HCl, 0.2M NaCl,pH 8.0) (1000 mL)
Trizma-HCl:1.7651g
Trizma-Base: 1.066g
NaCl:11.688g
3.緩沖液B (20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,pH 8.0) (1000 mL)
Trizma-HCl:1.7651g
Trizma-Base: 1.066g
NaCl:29.22g
4.洗滌緩沖液C:(20mMTris-HCl,0.5M NaCl,5mM 咪唑,0.5%Tween_20 ,pH 8.0)(100
mL)
緩沖液B:1OOmL 3M 咪唑:167uL Tween-20:500 uL
5.洗滌緩沖液D:(20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM 咪唑,pH 8.0) (100 mL)
緩沖液B:1OOmL
3M 咪唑:167uL
二、TthDNA聚合酶工程菌的構(gòu)建和表達(dá) UTth DNA聚合酶工程菌的構(gòu)建
模板為含嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus) HB-8DNA聚合酶(Tth)基因質(zhì)粒。(Invitrogen全基因人工合成,序列見(jiàn)SEQ ID NO: 3。
[0028]擴(kuò)增引物為:
Tth F:ataCATATGATGGAGGCGATGCTTCCGCTCTTTG SEQ ID NO:1
Tth R:ataGTCGACCTAACCCTTGGCGGAAAGCCAGTCC SEQ ID NO:2
PCR反應(yīng)體系配置見(jiàn)表1
【權(quán)利要求】
1.一種提取純化Tth DNA聚合酶的方法,其步驟為, O工程菌的活化和表達(dá):取Tth DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,370C,200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;取活化好的菌液轉(zhuǎn)接到同樣的LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)后加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8小時(shí);離心收集菌體;收集的菌體用緩沖液A洗滌一次,離心;再用緩沖液A重懸得到表達(dá)的工程菌; 2)粗蛋白制備:將所述表達(dá)的工程菌用溶菌酶室溫處理后加入DTT,再加入吐溫-20,冰上處理一段時(shí)間,15000g/4°C /20分鐘,得到的上清即為粗蛋白; 3)粗蛋白中緩慢加入二氧化硅顆粒,磁力攪拌器上攪拌,離心去除沉淀; 4)上清液補(bǔ)足NaCl后流過(guò)已螯合Ni2+的N1-NTA柱,該柱先用10倍床體積結(jié)合緩沖液平衡;所述結(jié)合緩沖液為20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0,5mM咪唑;再用5倍床體積洗滌緩沖溶液依次洗滌,所述洗滌緩沖液為20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0,15mM/50mM咪唑;最后用洗脫液洗脫目的蛋白,所述洗脫液為20mM Tris-HCL, 0.1MNaCl, PH8.0, 200mM咪唑,接收含目的蛋白的洗脫液;含目的蛋白的洗脫液用sephadexG25脫鹽,脫鹽緩沖液為緩沖液 B:1OmM Tris-HCl ,pH 7.5,25° C,300mM KCl, ImM DTT, 0.1mM EDTA,0.5mg/mlBSA ;脫鹽后 即得到純化的Tth DNA聚合酶; 任選的,得到的Tth DNA聚合酶加入甘油使體積分?jǐn)?shù)為50%,-20°C保存。
2.權(quán)利要求1所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法,其特征在于,所述Tth DNA聚合酶工程菌為從嗜熱棲熱菌HB-8中PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物,所得PCR產(chǎn)物經(jīng)Nde 1、Sal I雙酶切后克隆入經(jīng)Nde I ,Sal I雙酶切的PET28a載體上,構(gòu)建表達(dá)載體PET28a_taq,將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21 (DE3),即獲得生產(chǎn)重組Tth DNA聚合酶的工程菌株。
3.權(quán)利要求2所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法,其特征在于,所述PCR擴(kuò)增所用的引物為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列。
4.權(quán)利要求1或2所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法,其特征在于,所述步驟I)為取Tth DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,370C,200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;取活化好的菌液轉(zhuǎn)接到同樣的LB液體培養(yǎng)基中,37°C,250轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4小時(shí)后加AIM IPTG至終濃度1.0mmol/L,28°C、250 rpm件下培養(yǎng)8小時(shí);用離心管超聲洗滌30min,并用雙蒸水潤(rùn)洗一次;12000rpm,4°C離心5分鐘收集菌體;收集的菌體用緩沖液A洗滌一次,12000rpm, 4°C離心5分鐘;再用緩沖液A重懸得到表達(dá)的工程菌;所述緩沖液A為20mMTris-HCL, 0.2MNaCl, PH8.0。
5.權(quán)利要求1或2所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法,其特征在于,所述步驟2)為將所述表達(dá)的工程菌用4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分鐘后加入DTT使終濃度為ImM,加入吐溫-20使體積百分比為0.5%,冰上處理45分鐘,15000g/4°C /20分鐘,得到的上清即為粗蛋白。
6.權(quán)利要求1或2所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法,其特征在于,所述步驟3)為粗蛋白中緩慢加入體積系數(shù)5%的二氧化硅顆粒,磁力攪拌器上攪拌10分鐘,15000g, 4°C離心20分鐘,去除沉淀。
7.權(quán)利要求1或2所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法,其特征在于,所述步驟4)為上清液補(bǔ)足NaCl至終濃度為0.5M。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK103966182SQ201410179490
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】林家旺, 魏超, 魏劭 申請(qǐng)人:廈門安普利生物工程有限公司
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