血漿特定片段游離dna定量檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒，包括以下組分：用于擴(kuò)增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對，所述2個引物對的后向引物位點(diǎn)一致，通過前向引物確定所擴(kuò)增的TP53基因片段的長度；用于擴(kuò)增內(nèi)參基因Beta-actin的1個引物對；胎兒基因組DNA。本發(fā)明試劑盒在熒光定量PCR技術(shù)基礎(chǔ)上引入了校準(zhǔn)系統(tǒng)，以胎兒基因組DNA為背景DNA，看家基因Beta-actin為內(nèi)參基因，抑癌基因TP53為目的基因，針對抑癌基因TP53不同長度片段設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法同步擴(kuò)增Beta-actin基因和TP53基因不同長度片段，可定量檢測血漿中特定片段大小的游離DNA含量。
【專利說明】血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種DNA檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]外周血游離DNA是指外周血中游離于細(xì)胞外的部分降解了的機(jī)體內(nèi)源性DNA。其來源主要有三個:細(xì)胞凋亡、壞死、分泌。
[0003]1989年，STROUN等對腫瘤患者血液游離DNA進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有腫瘤細(xì)胞DNA的一些特征，因而提出腫瘤患者血液游離DNA可能源自腫瘤細(xì)胞。5年后研究者在腫瘤患者的血漿和血清中檢測到了癌基因突變，對其進(jìn)行光譜分析后發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤相一致?，F(xiàn)已證實(shí)，腫瘤患者血液中，具有腫瘤生物學(xué)特征的DNA主要源于腫瘤細(xì)胞壞死和凋亡后自然散發(fā)或者在增生活躍時(shí)自動釋放。另有文獻(xiàn)報(bào)道，癌變?nèi)巳貉獫{中游離100~400bp大小的DNA片段濃度明顯高于正常人，可以作為癌癥篩查的標(biāo)志物。
[0004]但現(xiàn)有技術(shù)中，尚未見對血漿中特定大小片段的游離DNA進(jìn)行定量檢測的方法。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道，可通過實(shí)時(shí)熒光定量檢測技術(shù)檢測人基因組中某一個看家基因來對外周血中游離DNA進(jìn)行定量檢測，但由于外周血中DNA片段大小分布多樣，這種檢測技術(shù)并不能獲得其中某一特定大小DNA片段的相關(guān)信息。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒，可以對與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的血漿中特定片段大小的游離DNA進(jìn)行定量檢測，結(jié)果準(zhǔn)確、特異、靈敏。
[0006]經(jīng)研究，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0007]1.血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒，包括以下組分:
[0008]用于擴(kuò)增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對；所述2個引物對的后向引物位點(diǎn)一致，通過前向引物確定所擴(kuò)增的TP53基因片段的長度；
[0009]用于擴(kuò)增內(nèi)參基因Beta-actin的I個引物對；
[0010]胎兒基因組DNA。
[0011]優(yōu)選的，所述用于擴(kuò)增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對序列分別如 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.6 所示。
[0012]優(yōu)選的，所述用于擴(kuò)增內(nèi)參基因Beta-actin的I個引物對序列分別如SEQ IDN0.7 和 SEQ ID N0.8 所示。
[0013]本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血漿中150_400bp DNA片段在血漿總游離DNA中的相對含量百分比明顯高于健康人群，差異顯著，因此，測定血漿中150-400bp DNA片段的濃度可以作為腫瘤篩查的有效手段之一。上述血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒中包括用于擴(kuò)增長度分別為400bp和150bp的TP53基因片段的2個引物對。以胎兒基因組DNA為背景DNA，看家基因Beta-actin為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法同步擴(kuò)增Beta-actin基因和TP53基因不同長度片段，可以分別獲得血漿中400bp DNA片段與150bp DNA片段的濃度，然后用150bp DNA片段的濃度減去400bp DNA片段的濃度可獲得150_400bp DNA片段的濃度，從而進(jìn)行腫瘤篩查。
[0014]進(jìn)一步，所述血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒還包括以下組分:用于擴(kuò)增長度分別為大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3個引物對；所述3個引物對與用于擴(kuò)增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對的后向引物位點(diǎn)一致，通過前向引物確定所擴(kuò)增的TP53基因片段的長度。
[0015]優(yōu)選的，所述用于擴(kuò)增長度分別為大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3個引物對序列分別如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.6、SEQ IDN0.5 和 SEQ ID N0.6 所示。
[0016]上述血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒包括用于擴(kuò)增長度分別為大于400bp、400bp、150bp、100bp、60bp的TP53基因片段的5個引物。以胎兒基因組DNA為背景DNA,看家基因Beta-actin為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法同步擴(kuò)增Beta-actin基因和TP53基因不同長度片段，可以分別獲得血漿中大于400bp DNA片段、400bp DNA片段、150bp DNA片段、10bp DNA片段、60bp DNA片段的濃度，然后用150bp DNA片段的濃度減去400bp DNA片段的濃度可獲得150-400bp DNA片段的濃度，用10bp DNA片段的濃度減去150bp游離DNA片段的濃度可獲得100-150bp DNA片段的濃度，用60bp DNA片段的濃度減去10bp DNA片段的濃度可獲得60-100bp DNA片段的濃度，從而對血漿中特定片段大小的游離DNA進(jìn)行定量檢測。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明試劑盒在熒光定量PCR技術(shù)基礎(chǔ)上引入了校準(zhǔn)系統(tǒng)，以胎兒基因組DNA為背景DNA，看家基因Beta-actin為內(nèi)參基因，抑癌基因TP53為目的基因，針對抑癌基因TP53不同長度片段設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法同步擴(kuò)增Beta-actin基因和TP53基因不同長度片段，可定量檢測血漿中特定片段大小的游離DNA含量。其中，以胎兒基因組DNA為背景DNA，能夠有效去除反應(yīng)體系的誤差和干擾；以Beta-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，與TP53基因不同長度片段在同一體系內(nèi)同步擴(kuò)增，二者的擴(kuò)增無相互干擾，特異性好，獲得的Cp值可以用來校準(zhǔn)擴(kuò)增體系產(chǎn)生的誤差。本發(fā)明試劑盒實(shí)現(xiàn)了與腫瘤密切相關(guān)的血漿中特定大小游離DNA片段的定量檢測，排除了其他片段DNA的影響，對腫瘤的篩查、療效判斷、預(yù)后等都具有重要意義，其檢測靈敏度達(dá)到Ing/mL，批間重復(fù)性和穩(wěn)定性達(dá)到三類醫(yī)療器械注冊的要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明:
[0019]圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020]圖2為Beta-actin基因擴(kuò)增曲線。
[0021]圖3為TP53基因擴(kuò)增曲線。
[0022]圖4為Beta-actin基因與TP53基因同時(shí)擴(kuò)增圖。
[0023]圖5為加入胎兒基因組作為背景DNA的樣品擴(kuò)增效果。
[0024] 圖6為未加入胎兒基因組作為背景DNA的擴(kuò)增效果。

【具體實(shí)施方式】
[0025]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0026]由于TP53基因作為一種抑癌基因存在于所有類型的癌細(xì)胞中，因此，本發(fā)明選擇TP53基因作為目的基因。針對其DNA序列，分別設(shè)計(jì)不同引物進(jìn)行不同長度DNA片段(長度分別為大于400bp、400bp、150bp、100bp、60bp)的擴(kuò)增與定量檢測。引物設(shè)計(jì)方法為:固定后向引物位點(diǎn)，通過前向引物確定DNA擴(kuò)增片段的大小。優(yōu)選的引物序列如下:
[0027]前向引物:TP53-D400F:5’ -ACACCACTGTGCTCCAGCCT-3，(SEQ ID N0.1)；
[0028]TP53-400F:5，-GTTCACTTGTGCCCTGACTTTC-3，(SEQ ID N0.2)；
[0029]TP53-150F:5，-CTGCTCAGATAGCGATGGTGAGCAG-3，(SEQ ID N0.3)；
[0030]TP53-100F:5，-GGTTGCCCAGGGTCCCCAGGCCTCT-3，(SEQ ID N0.4)；
[0031]TP53-60F:5，-CTCAGCATCTTATCCGAGTGGAA-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0032]后向引物:TP53-R:5’ -TGTTTCTGTCATCCAAATACTCCA-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0033]其中，TP53-D400F和TP53-R用于擴(kuò)增長度大于400bp的TP53基因片段；TP53-400F和TP53-R用于擴(kuò)增長度為400bp的TP53基因片段；TP53_150F和TP53-R用于擴(kuò)增長度為150bp的TP53 基因片段；TP53-100F和TP53-R用于擴(kuò)增長度為10bp的TP53基因片段；TP53-60F和TP53-R用于擴(kuò)增長度為60bp的TP53基因片段。
[0034]同時(shí)，選擇看家基因Beta-actin為內(nèi)參基因，并設(shè)計(jì)內(nèi)參引物序列如下:
[0035]前向引物:ACTB-F:5’ -TACCACTGGCATCGTGATGGAC-3’ (SEQ ID N0.7)；
[0036]后向引物:ACTB-R:5’ -CATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3’ (SEQ ID N0.8)。
[0037]取胎兒基因組DNA，梯度稀釋后作為DNA標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度通過Nanodrop分光光度計(jì)測定。向25ul PCR反應(yīng)體系中加入5ul上述DNA標(biāo)準(zhǔn)品作為DNA模板，以ACTB-F和ACTB-R為引物，用羅氏熒光定量PCR儀(Roche LightCycler480)進(jìn)行熒光定量檢測。PCR反應(yīng)體系具體為:13 μ I mix (包含 10XPCR buffer2 μ 1、SYBR Green 飽和性染料 I μ 1、5U/μ I TaqDNA polymerase0.2μ lU5mM MgCl22 μ 1、1mM dNTP0.5 μ I 和 ddH207.3 μ 1，其中 10XPCRbuffer 包含 10-40mM Tris-Cl、50_200mM 氯化鉀、0-5.0mM 二硫蘇糖醇(DTT) ,0-1.0mM乙二胺四乙酸二鈉鈣(EDTA)、0-20vol%乙基苯基聚乙二醇(Nonidet) P-40、0_2.0vol %吐溫 20 (Tween20)、30_70vol % 甘油和穩(wěn)定劑(pH7.0-10.0))，1mM ACTB-F0.5 μ 1，1mMACTB-R0.5 μ 1，5 μ I DNA 模板(lOng/ μ I 血漿 DNA2 μ I 和 lng/ μ I 胎兒基因組 DNA3 μ I)，ddH206 y I。PCR反應(yīng)程序?yàn)?變性階段:95°C 3min ;擴(kuò)增階段:95°C 10s，60。。30s，共40個循環(huán)；溶解階段:55-90°C，每0.2°C采集一次熒光。以Cp值為縱坐標(biāo)，DNA模板濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y = -1.36471ηχ+32.327，R2 = 0.9951 ;x代表血漿DNA濃度，Y代表Cp值。
[0038]取外周血樣品，分離血漿，提取血漿DNA，加入胎兒基因組DNA作為背景DNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法同步擴(kuò)增Beta-actin基因與TP53基因不同長度片段，定量檢測血漿特定片段游離DNA的濃度。PCR反應(yīng)體系具體為:13μ I mix(包含10XPCR buffer2y 1、SYBR Green 飽和性染料 I μ 1、5U/μ I Taq DNA polymerase0.2 μ lU5mM MgCl22 μ 1、1mMdNTP0.5 μ I 和 ddH207.3 μ 1，其中 10XPCR buffer 包含 10_40mM Tris-Cl、50_200mM 氯化鉀、0-5.0mM 二硫蘇糖醇(DTT) ,0-1.0mM乙二胺四乙酸二鈉鈣(EDTA)、0_20vol %乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40、0-2.0vol % 吐溫 20 (Tween20)、30_70vol % 甘油和穩(wěn)定劑(pH7.0-10.0)),1mM ACTB-F0.5 μ I,1mM ACTB-R0.5 μ I,1mM TP53-D400F0.5 μ I,1mMTP53-400F0.5 μ I,1mM TP53-150F0.5 μ I,1mM TP53-100F0.5 μ I,1mM TP53-60F0.5 μ 1，1mM TP53-R0.5 μ 1，5μ I DNA 模板(lOng/μ I 血漿 DNA2 μ I 和 lng/μ I 胎兒基因組Ε)ΝΑ3μ 1)，ddH203 y I。PCR反應(yīng)程序?yàn)?變性階段:95°C 3min ;擴(kuò)增階段:95 °C 1s,600C 30s，共40個循環(huán)；溶解階段:55-90°C，每0.2°C采集一次熒光。獲得Cp值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到血漿中大于400bp、400bp、150bp、100bp、60bp游離DNA片段的濃度。然后，用150bp游離DNA片段的濃度減去400bp游離DNA片段的濃度可以獲得150_400bp游離DNA片段的濃度，用10bp游離DNA片段的濃度減去150bp游離DNA片段的濃度可以獲得100-150bp游離DNA片段的濃度，用60bp游離DNA片段的濃度減去10bp游離DNA片段的濃度可以獲得60-100bp游離DNA片段的濃度。
[0039]圖2為Beta-actin基因擴(kuò)增曲線。圖3為TP53基因擴(kuò)增曲線。圖4為Beta-actin基因與TP53基因同時(shí)擴(kuò)增圖。從圖2、圖3和圖6可以看出，以Beta-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，與TP53基因不同長度片段在同一體系內(nèi)同步擴(kuò)增，二者的擴(kuò)增無相互干擾，特異性好，獲得的Cp值可以用來校準(zhǔn)擴(kuò)增體系產(chǎn)生的誤差。
[0040]圖5為加入胎兒基因組作為背景DNA的樣品擴(kuò)增效果。圖6為未加入胎兒基因組作為背景DNA的擴(kuò)增效果。從圖5和圖6可以看出，以胎兒基因組DNA為背景DNA，能夠有效去除反應(yīng)體系的誤差和干擾。
[0041]Gene Science公司的統(tǒng)計(jì)數(shù)顯示，當(dāng)血衆(zhòng)中游離DNA濃度大于25ng/ml時(shí)，70.8%會發(fā)展為癌癥患者。本發(fā)明采用上述引物和檢測方法，對400例健康人群、198例腸癌患者、298例胃癌患者、200例乳腺癌患者血漿中特定大小的游離DNA片段進(jìn)行了定量檢測。結(jié)果見表1。
[0042]表1血漿中特定大小游離DNA片段的定量檢測結(jié)果

【權(quán)利要求】
1.血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒，其特征在于，包括以下組分: 用于擴(kuò)增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對；所述2個引物對的后向引物位點(diǎn)一致，通過前向引物確定所擴(kuò)增的TP53基因片段的長度； 用于擴(kuò)增內(nèi)參基因Beta-actin的I個引物對； 胎兒基因組DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒，其特征在于，所述用于擴(kuò)增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對序列分別如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.6 所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒，其特征在于，還包括以下組分: 用于擴(kuò)增長度分別為大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3個引物對；所述3個引物對與用于擴(kuò)增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對的后向引物位點(diǎn)一致，通過前向引物確定所擴(kuò)增的TP53基因片段的長度。
4.如權(quán)利要求3所述的血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒，其特征在于，所述用于擴(kuò)增長度分別為大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3個引物對序列分別如SEQ IDN0.1 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 所示。
5.如權(quán)利要求1所述的血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒，其特征在于，所述用于擴(kuò)增內(nèi)參基因Beta-actin的I個引物對序列分別如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104073554SQ201410174787
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】王弢, 樂飚, 李宗飛, 張利清, 張麗 申請人:江蘇至真生物醫(yī)藥科技有限公司