專利名稱：一種生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素的方法。
背景技術(shù)：
人生長激素(hGH)是腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，由191個氨基酸組成。正常成年人血漿hGH水平約為1～5ng/ml，半衰期為15～20分鐘。
hGH是人體內(nèi)含量最高的幾種激素之一，由于影響全身細(xì)胞、骨骼、肌肉合器官的生長，因此對于人體新陳代謝合各種生理功能有著廣泛的調(diào)節(jié)作用，如hGH促進(jìn)脂肪分解而使血漿游離脂肪酸升高；促進(jìn)許多組織中RNA及蛋白質(zhì)的合成，出現(xiàn)正氮平衡，使軟骨、骨骼、肌肉結(jié)締組織及內(nèi)臟等組織合成胰島素生長因子ILG，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分裂和基質(zhì)增生，與骨骼和結(jié)締組織的生長有關(guān)；又有胰島素樣作用，能促進(jìn)脂肪組織、肌肉組織等對葡萄糖的攝取氧化，增強(qiáng)肌肉中蛋白質(zhì)的合成。
目前，美國、歐洲和中國都已經(jīng)生產(chǎn)出重組hGH產(chǎn)品上市，但所有廠家均采用大腸桿菌表達(dá)的重組hGH產(chǎn)品，按照表達(dá)方式又分為細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與分泌型表達(dá)這兩種。大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的hGH形成包涵體而成為不溶性，提取困難，需要經(jīng)過變性復(fù)性的復(fù)雜步驟，故損失很大；有些是分泌型表達(dá)的，但大腸桿菌表達(dá)宿主含有內(nèi)毒素，為了從產(chǎn)品中去除內(nèi)毒素需要更加繁復(fù)的提純步驟，致使產(chǎn)品得率更加降低，粗品中仍然含有大量的大腸桿菌雜蛋白，特別是表達(dá)宿主所特有的大腸桿菌內(nèi)毒素。為了去除這些對人體有害的成分，必須經(jīng)過繁復(fù)的提純步驟，損失也很大，最終的產(chǎn)品得率很低(25mg/L)。由于此表達(dá)系統(tǒng)所固有的缺陷，導(dǎo)致生產(chǎn)成本居高不下。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對已有技術(shù)所存在的缺點，提供一種用基因工程重組法生產(chǎn)192肽人生長激素的方法。
本發(fā)明所生產(chǎn)的重組hGH是192肽，即在天然人生長激素的N端加上了一個甲硫氨酸，作為翻譯起始子。完整的192肽hGH序列如下MFPTIPLSRL FDNAMLRAHR LHQLAFDTYQ EFEEAYIPKEQKYSFLQNPQ TSLCFSESIP TPSNREETQQ KSNLELLRISLLLIQSWLEP VQFLRSVFAN SLVYGASDSN VYDLLKDLEEGIQTLMGRLE DGSPRTGQIF KQTYSKFDTN SHNDDALLKNYGLLYCFRKD MDKVETFLRI VQCRSVEGSC GF本發(fā)明的技術(shù)方案由以下步驟組成(一)、獲取192肽人生長激素基因以Phil-D2質(zhì)粒作為穿梭質(zhì)粒，將生長激素cDNA轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，通過與酵母細(xì)胞染色體上的基因之間的同源重組，構(gòu)建了基因工程hGH酵母；(二)、表達(dá)系統(tǒng)用畢赤酵母的菌株作為表達(dá)宿主、以細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式進(jìn)行192肽人生長激素表達(dá)；(三)、誘導(dǎo)hGH酵母表達(dá)生產(chǎn)人生長激素。
把人生長激素cDNA克隆進(jìn)pHil-D2質(zhì)粒中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pHil-D2/hGH，此重組質(zhì)粒包含一個HGH基本表達(dá)單元，此表達(dá)單元由三部分組成畢赤酵母酒精氧化酶(AOX)啟動子、192肽人生長激素cDNA序列、畢赤酵母酒精氧化酶(AOX)轉(zhuǎn)錄終止序列。然后將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞內(nèi)，通過與酵母細(xì)胞染色體上的基因之間的同源重組，使得人生長激素的基因整合進(jìn)酵母染色體中特定的基因位點之一，構(gòu)建了基因工程HGH酵母。
其中步驟一中所使用的酵母菌株為畢赤酵母，包括GS115、SMD1163、SMD1165、SMD1168或其他經(jīng)過基因修飾的合適的畢赤酵母菌株。
其中步驟一中所使用酵母染色體上的基因為HIS4基因或AOX1基因，相應(yīng)地，所構(gòu)建成的基因工程HGH酵母菌株的表型分別為Mut+和Mut-。
其中步驟一中所構(gòu)建的HGH酵母含單拷貝或者多拷貝的HGH基本表達(dá)單元，其中多拷貝表達(dá)單元以頭尾相連的方式排列。
其中步驟三中所使用的誘導(dǎo)物為甲醇，通過誘導(dǎo)AOX啟動子，啟始hGH基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，完成hGH蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
人生長激素蛋白的表達(dá)水平因HGH酵母所含表達(dá)單元拷貝數(shù)的不同而有顯著差異，本專利中HGH酵母的最高表達(dá)水平是250mg/100g濕重酵母。
其中步驟一中所使用酵母染色體上的基因為HIS4基因或AOX1基因。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明用畢赤酵母的4種特定的菌株作為表達(dá)宿主，以細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式來生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素。酵母既是一種微生物，同時又是一種真核細(xì)胞型生物(不同于原核生物的大腸桿菌)，具有很接近高等生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。所以，酵母作為表達(dá)宿主來生產(chǎn)人體激素和細(xì)胞因子，具有特別的優(yōu)勢。與大腸桿菌相比，酵母細(xì)胞內(nèi)環(huán)境更加適合所表達(dá)的人體蛋白質(zhì)分子的正確折疊，其表達(dá)的基因工程蛋白質(zhì)都是可溶型、構(gòu)象正確的產(chǎn)物。同時，酵母表達(dá)宿主不含內(nèi)毒素，無須經(jīng)過去處內(nèi)毒素的方法步驟，保證了產(chǎn)品的高得率。
就基因工程領(lǐng)域而言，在所有的酵母中，畢赤酵母是最優(yōu)秀的表達(dá)系統(tǒng)，它生長旺盛，每升培養(yǎng)液含酵母菌體量濕重可達(dá)450g，對外源基因的表達(dá)良好，表達(dá)產(chǎn)物為可溶于水，產(chǎn)品易純化，收得率高，其表達(dá)水平也遠(yuǎn)高于釀酒酵母。畢赤酵母無毒無害，含高蛋白，富含維生素B，本身就是很好的營養(yǎng)品。
由于畢赤酵母把外源蛋白質(zhì)cDNA通過基因重組整合入其染色體基因組中，人生長激素基因已成為酵母宿主染色體DNA的一部分，所以遺傳學(xué)性狀十分穩(wěn)定，徹底解決了其他基因工程表達(dá)系統(tǒng)(例如釀酒酵母、大腸桿菌)的宿主細(xì)胞在傳代過程中因選擇壓力而丟失外源基因載體(例如附著體、質(zhì)粒)的問題。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)使用價格低廉的酵母培養(yǎng)液，誘導(dǎo)表達(dá)所用的甲醇也很便宜，所以生產(chǎn)成本相當(dāng)?shù)汀?br> 畢赤酵母生長旺盛，單位體積培養(yǎng)液中可收獲的菌體含量極高(每升培養(yǎng)液可以收獲450克濕重的酵母)，而酵母本身又是不含有害成分、營養(yǎng)特別豐富的食品，所以非常適合開發(fā)成口服、噴霧等劑型的保健品。
本產(chǎn)品是酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，蛋白質(zhì)分子沒有糖基化，因而與天然的人生長激素分子完全相同，也就不存在分泌型表達(dá)產(chǎn)品因糖基化而對人體產(chǎn)生抗原性的問題。
具體實施例方式(一)人生長激素cDNA的合成、克隆和序列測定1.腦垂體前葉組織總RNA的提取(使用Stratagene公司的Absolutely RNATMRT-PCR Miniprep KitCatalog#400800，Revision#021002)(1)、腦垂體前葉組織一旦從尸體上解剖分離，馬上放入液氮內(nèi)進(jìn)行快速冷凍處理。
(2)、切取一小塊冷凍的組織，快速稱量后即移入新鮮配制的β基乙醇-組織裂解緩沖液內(nèi)，裂解液用量為每50mg腦垂體組織用1mg裂解緩沖液。
(3)、對腦垂體組織進(jìn)行勻漿破細(xì)胞，預(yù)過濾離心一次，收集濾出液。
(4)、加入等體積的70％乙醇，震蕩混勻，移入RNA結(jié)合管內(nèi)，離心，棄去濾出液。
(5)、分別用1X低鹽洗滌緩沖液、Dnasel溶液、1X高鹽洗滌緩沖液、1X低鹽洗滌緩沖液先后洗滌沖洗。
(6)、加入洗脫緩沖液，室溫下放置2分鐘，離心洗滌，收集純化的RNA，常規(guī)方法定量。
2.用逆轉(zhuǎn)錄方法合成總cDNA(1)、去1～5μg總RNA，加入1ugOligodT和適量dH2O至總體積為11μl。
(2)、加熱上述反應(yīng)液，70℃，10分鐘。
(3)、離心，加入4μl 5X Frist Strand Buffer，1μl 10mMdNTP，混勻，置于42℃2分鐘。
(4)、加入11μl SuperScriptTMIITranscriptase，混勻，置于42℃50分鐘，70℃15分鐘。
3.用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增hGH cDNA。
(1)、設(shè)計下列2個引物用于PCR擴(kuò)增，并配成20μM。
(2)、HGH5’端引物5’ATGTTCCCAACCATTCCC3’HGH3’端引物5’CTAGAAGCCACAGCTGC3’(3)把下述試劑加入PCR管內(nèi)，1μl cDNA，1ul 5’端引物，1μl3’端引物，5μl 2mM dNTP，0.5μl Vent酶，5μl 10X Vent Buffer，36.5μldH2O。
(4)PCR反應(yīng)程序如下第一步變性95℃3分鐘，第二步做30個循環(huán)，每個循環(huán)由以下3個步驟組成a、變性95℃30秒，b、退火55℃30秒，c、延伸72℃1分鐘，第三步最終72℃10分鐘。
(4)PCR反應(yīng)程序如下第一步變性95℃3分鐘，第二步做30個循環(huán)，每個循環(huán)由以下3個步驟組成a、變性95℃30秒，b、退火55℃30秒，c、延伸72℃1分鐘，第三步最終72℃10分鐘。
4.PCR產(chǎn)物(即hGH cDNA)的純化。
(使用Qiagen公司的QIAquickTMGel Extraction Kit Cat.No.28706)(1)、用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳法分離上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠濃度為1％，恒電壓90V，電泳60分鐘，電泳標(biāo)準(zhǔn)品用5μl.λ/Hind III+EcoRI。
(2)、在紫外線燈下，在凝膠上580bp處切取DNA條帶，稱重(100mg相當(dāng)于100μl)。
(3)、加入3倍體積的QG緩沖液，加熱溶解凝膠，加入1倍體積異丙醇，混勻。
(4)、把樣品加入QIAquick柱內(nèi)，吸附DNA，用PE緩沖液洗滌一次。
(5)、加入dH2O，離心洗脫，收集純化的DNA。
5.hGH cDNA的克隆(使用Invitrogen公司的Zero Blunt TM PCR Cloning KitCatalog No.K2700-20/40).
(1)、連接反應(yīng)如此進(jìn)行1μlPCR純化產(chǎn)物，0.5μl PCR-Blunt質(zhì)粒，0.5μl T4 DNA Ligase，1μl 10X T4 DNA Ligase Buffer，7μl dH2O。12℃放置過夜。
(2)、取5μl上述連接反應(yīng)液，用常規(guī)的熱休克方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)菌。
(3)、把轉(zhuǎn)化菌鋪于LB固體培養(yǎng)板上(含kanamycin50μg/ml)37℃過夜。
(4)、次日，用接種棒從LB培養(yǎng)板上挑取9株菌落，培養(yǎng)闊增。
(5)、常規(guī)方法抽提重組質(zhì)粒DNA，然后分別用單個限制性內(nèi)切酶EcoRI和聯(lián)合酶切(Bsu36I+Xbal)的方法，確認(rèn)hGH cDNA的插入。
酶切反應(yīng)結(jié)果可以用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳法確認(rèn)。
6.hGH cDNA的序列測定(使用Amersham Pharmacia Biotech公司的Thermo Sequenasecycle sequecing kit，Product No.US78500)在上述含有hGH cDNA插入的重組質(zhì)粒Pcr-Blunt/hGH中選取3個做DNA序列測定。
(1)、分別對M13反向和M13正向引物做5’端同位素標(biāo)記，標(biāo)記使用[γ-32P]ATP。
(2)、用M13反向和M13正向引物所選的3株重組質(zhì)粒做序列測定。根據(jù)這兩個引物的溶解溫度，熱反應(yīng)循環(huán)程序設(shè)計如下95℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘，共做55個循環(huán)。
(3)、把熱循環(huán)反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳(6％凝膠)，總共加樣3次。電泳結(jié)束后，干燥凝膠，放置X線底片進(jìn)行曝光。沖洗底片，讀取DNA序列。
結(jié)果顯示所選取的3個重組質(zhì)粒都有hGH cDNA插入，且序列全部正確，與其開放閱讀框相對應(yīng)的氨基酸為192肽(其中第一個氨基酸是翻譯起始子甲硫氨酸)，完整的氨基酸序列如下MFPTIPLSRL FDNAMLRAHR LHQLAFDTYQ EFEEAYIPKEQKYSFLQNPQ TSLCFSESIP TPSNREETQQ KSNLELLRISLLLIQSLEP VQFLRSVFAN SLVYSKFDTN VYDLLKDLEEGIQTLMGRLE DGSPRTGQIF KQTYSKFDTN SHNDDALLKNYGLLYCFRKD MDKVETFLRI VQCRSVEGSC GF電子計算機(jī)檢索確認(rèn)此氨基酸序列與國際基因庫中人生長激素序列完全一致。
(二)重組質(zhì)粒pHil-D2/hGH的構(gòu)建與線性化1.用限制性內(nèi)切酶EcoRI把hGH cDNA片段從重組質(zhì)粒pCR-Blunt/hGH中切除下來，按(一)4.步驟所示的方法純化。
2.用限制性內(nèi)切酶EcoRI把質(zhì)粒pHil-D2線性化，然后加入1μl鹼性磷酸酶以作5’脫磷酸。
最后按(一)4.步驟所示的方法純化。
3.把上述hGH cDNA片段克隆進(jìn)pHil-D2質(zhì)粒中去克隆方法按照(一)5.(1)～(4)進(jìn)行，但細(xì)菌轉(zhuǎn)化以后鋪板和后來培養(yǎng)所用的抗菌素是100μg/ml的Ampicillin而不是Kanamycin。
4.常規(guī)方法抽提重組質(zhì)粒DNA，然后分別用單個限制性內(nèi)切酶EcoRI和聯(lián)合酶切(PstI+XbaI)的方法，確認(rèn)hGH cDNA的插入及定向。
酶切反結(jié)果用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳法確認(rèn)。
5.重組質(zhì)粒pHil-D2/hGH中hGHcDNA序列的確認(rèn)。
根據(jù)上述步驟(4)的結(jié)果，選取第1和第7株質(zhì)粒作DNA序列測定。方法按照(一)6.步驟進(jìn)行，測序反應(yīng)所用的引物分別是AOX5’和AOX3’引物。
測序結(jié)果顯示，這些重組質(zhì)粒中的hGH cDNA的序列和插入方向都是正確的。
6.分別使用限制性內(nèi)切酶SalI和NotI對pHil-D2/hGH進(jìn)行酶切使其線性化，用(一)4.步驟所示的方法純化。
(三)HGH酵母表達(dá)宿主的建立(操作方法參照Invitrogen公司的The Pinchia Expression Kit)表達(dá)宿主使用畢赤酵母GS115株，SMD1163株，SMD1165株，SMD1168株，以下構(gòu)建成的hGH酵母即包括了上述這4種畢赤酵母細(xì)胞株。
1.畢赤酵母的轉(zhuǎn)化(1)、把酵母常規(guī)培養(yǎng)至OD600在0.2～0.3之間，收獲細(xì)胞。
(2)、分別用蒸餾水，SED溶液，1M山梨醇洗滌細(xì)胞，每次洗完后既低速離心，收集細(xì)胞，棄去洗滌溶液。
(3)、把細(xì)胞重懸于SCE緩沖液中，加入適量的Zymolyase酶，然后把細(xì)胞管子置于30℃水浴內(nèi)，制備原生質(zhì)球。
(4)、當(dāng)原生質(zhì)球比例達(dá)到70％，低速離心收集細(xì)胞，然后用1M山梨醇和CaS溶液分別洗滌一次，最后將酵母重懸于適當(dāng)體積的CaS溶液內(nèi)，分成數(shù)管。
(5)、對于每一個轉(zhuǎn)化，加入1～10μg(二)6.步驟所制備的DNA，室溫放置10分鐘，加入10倍體積的PEG/CaT，室溫放置10分鐘。
(6)、低速離心收集細(xì)胞，重懸于150μlSOS培養(yǎng)液內(nèi)，室溫放置20分鐘，加入850μl 1M山梨醇。
(7)、把上述細(xì)胞懸液加入融化的RD培養(yǎng)基內(nèi)，混勻后倒在RDB培養(yǎng)板上。等上層RD培養(yǎng)基凝結(jié)以后，把培養(yǎng)板倒置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)。
(8)、4天以后，轉(zhuǎn)化成功的酵母細(xì)胞就開始長出來。
2.高表達(dá)酵母宿主的篩選(1)、對于每一個畢赤酵母細(xì)胞株，都從相應(yīng)的RDB培養(yǎng)板上挑取54個單集落轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)擴(kuò)增。
(2)、常規(guī)方法提取酵母細(xì)胞總DNA。
(3)、以hGHcDNA為模板，制備放射性標(biāo)記的cDNA探針，標(biāo)記使用[α-32P]dATP。
(4)對于每一個樣品，滴加2μl酵母總DNA于硝酸纖維素膜上，然后做DNA斑點印跡雜交分析。雜交溫度為32℃，過夜。洗滌溫度為65℃，分別用2XSSC和0.1XSSC洗滌一次，然后根據(jù)放射性信號強(qiáng)度決定再洗滌的溫度和次數(shù)。
(5)、放置X線底片曝光，沖洗底片，分析信號強(qiáng)度。
(6)在54株轉(zhuǎn)化酵母中，斑點印跡放射性的強(qiáng)弱代表了染色體中插(7)入hGHcDNA拷貝數(shù)的多少。從每一種酵母細(xì)胞株的轉(zhuǎn)化體中選(8)取8個含hGH基因不同拷貝數(shù)的酵母，用YPD培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)48小時，然后把培養(yǎng)液換成YPM，繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)72小時。
(9)收獲酵母細(xì)胞，重懸于裂解緩沖液內(nèi)，加入細(xì)胞璃珠，用機(jī)械震蕩的方法破碎細(xì)胞。
(10)用免疫印染法(Western-Blot)檢測上述破菌上清掖，陽性對照為大腸桿菌表達(dá)的hGH。所用第一抗體為兔抗hGH(Sigma公司產(chǎn)品G2894)，第二抗體為酶標(biāo)記羊抗兔lgG抗體。對于4種酵母的8種轉(zhuǎn)化體中，在各自的8個受檢轉(zhuǎn)化菌中，選取表達(dá)水平最高的一株作為這個酵母菌株的hGH酵母。檢測結(jié)果顯示，畢赤酵母的4個菌株，即GS115株、SMD1163株、SMD1165株、SMD1168株的2種整合方式(即His+Mut+和His+Mut-)對hGH的最高表達(dá)水平相同，都為250mg/100g濕重酵母。
(四)重組人生長激素的純化勻漿破碎酵母，用小鼠抗hGH單抗親和層析柱提取勻漿上清液內(nèi)的hGH，得到純化的重組人生長激素。
(五)重組人生長激素的活性考核1去垂體大鼠增重試驗體重80～100克的雄性Sprague-Dawley大鼠做腦垂體切除手術(shù)，2周后開始實驗。
第1天，每個大鼠皮下注射40μg醋酸可的松。
第2天和第3天，重復(fù)注射醋酸可的松。
第4天和第5天，腹腔內(nèi)注射L-甲狀腺素。
第6～15天每天接受2次生長激素皮下注射(按照注射劑量分成2組，6μg/天和60μg/天)，陰性對照使用空白酵母提取純化品，陽性對照使用從人腦垂體提取的生長激素(Sigma公司)。
第16天，試驗結(jié)束，動物稱取最終體重。
去垂體大鼠增重試驗結(jié)果動物個數(shù)體重變化(克)第8天 第10天 第13天 第16天酵母hGH6μg/ 107.6±1.1 16.8±0.5 23.8±1.0 27.9±1.2天
60μg 1011.3±0.723.6±1.138.1±1.4 48.2±1.6天陰性對照 103.4±0.5 7.2±0.4 9.8±0.7 12.3±0.9陰性對照6μg 107.2±0.8 17.1±0.424.1±0.9 26.9±0.8天60μg 1012.1±0.322.9±0.839.2±0.9 47.9±1.2天2 大鼠淋巴瘤細(xì)胞增殖試驗大鼠淋巴瘤細(xì)胞Nb2的培養(yǎng)按常規(guī)，培養(yǎng)液含10％胎牛血清/10％馬血清。
第一天，培養(yǎng)液改用1％胎牛血清/10％馬血清；第二天，培養(yǎng)液改用10％馬血清，并且加入生和激素做檢測，陰性對照使用空白酵母提取純化品，陰性對照使用從人腦垂體提取的生長激素(Singma公司)。
3 大鼠淋巴瘤細(xì)胞增殖試驗大鼠淋巴瘤細(xì)胞Nb2的培養(yǎng)按常規(guī)，培養(yǎng)液含10％胎牛血清/10％馬血清第一天，培養(yǎng)液改用1％胎牛血清/10％馬血清；
第二天，培養(yǎng)液改用10％馬血清，并且加入生和激素做檢測，陰性對照使用空白酵母提取純化品，陰性對照使用從人腦垂體提取的生長激素(Singma公司)。
第5天，計數(shù)細(xì)胞。
大鼠淋巴瘤細(xì)胞增殖試驗結(jié)果實驗組1含10％馬血清的培養(yǎng)液；實驗組2含10％胎牛血清的培養(yǎng)液；實驗組3酵母rhGH；實驗組4空白對照；實驗組5陰性對照；實驗組6陰性對照。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素的方法，其特征在于它由以下步驟組成(一)、獲取192肽人生長激素基因以Phil-D2質(zhì)粒作為穿梭質(zhì)粒，將生長激素cDNA轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，通過與酵母細(xì)胞染色體上的基因之間的同源重組，構(gòu)建了基因工程hGH酵母；(二)、表達(dá)系統(tǒng)用畢赤酵母的菌株作為表達(dá)宿主、以細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式進(jìn)行192肽人生長激素表達(dá)；(三)、誘導(dǎo)hGH酵母表達(dá)生產(chǎn)人生長激素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素的方法，獲取192肽人生長激素基因的方法如下把人生長激素cDNA克隆進(jìn)pHil-D2質(zhì)粒中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pHil-D2/hGH，此重組質(zhì)粒包含一個HGH基本表達(dá)單元，此表達(dá)單元由三部分組成畢赤酵母酒精氧化酶(AOX)啟動子、192肽人生長激素cDNA序列、畢赤酵母酒精氧化酶(AOX)轉(zhuǎn)錄終止序列。然后將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞內(nèi)，通過與酵母細(xì)胞染色體上的基因之間的同源重組，使得人生長激素的基因整合進(jìn)酵母染色體中特定的基因位點之一，構(gòu)建了基因工程HGH酵母。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素的方法，其中步驟一中所使用的酵母菌株為畢赤酵母，包括GS115、SMD1163、SMD1165、SMD1168或其他經(jīng)過基因修飾的合適的畢赤酵母菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素的方法，其中步驟一中所使用酵母染色體上的基因為HIS4基因或AOX1基因，相應(yīng)地，所構(gòu)建成的基因工程HGH酵母菌株的表型分別為Mut+和Mut-。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素的方法，其中步驟一中所構(gòu)建的HGH酵母含單拷貝或者多拷貝的HGH基本表達(dá)單元，其中多拷貝表達(dá)單元以頭尾相連的方式排列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素的方法，其中步驟三中所使用的誘導(dǎo)物為甲醇，通過誘導(dǎo)AOX啟動子，啟始hGH基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，完成hGH蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素的方法，人生長激素蛋白的表達(dá)水平因HGH酵母所含表達(dá)單元拷貝數(shù)的不同而有顯著差異，本專利中HGH酵母的最高表達(dá)水平是250mg/100g濕重酵母。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素的方法，其中步驟一中所使用酵母染色體上的基因為HIS4基因或AOX1基因。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種生產(chǎn)基因工程重組192肽人生長激素的方法。其技術(shù)方案為(一)、獲取192肽人生長激素基因以Phil－D2質(zhì)粒作為穿梭質(zhì)粒，將生長激素cDNA轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，通過與酵母細(xì)胞染色體上的基因之間的同源重組，構(gòu)建了基因工程hGH酵母；(二)、表達(dá)系統(tǒng)用畢赤酵母的菌株作為表達(dá)宿主、以細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式進(jìn)行192肽人生長激素表達(dá)；(三)、誘導(dǎo)hGH酵母表達(dá)生產(chǎn)人生長激素。
文檔編號C12N1/19GK1524959SQ03146818
公開日2004年9月1日 申請日期2003年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月16日
發(fā)明者周琪, 肖可見, 彭立云, 葉健華, 周 琪 申請人:周琪, 周 琪