一段重組基因及提高黑曲霉表達(dá)糖化酶的方法【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一段重組基因及提高黑曲霉表達(dá)糖化酶的方法。一種提高黑曲霉表達(dá)糖化酶的方法，通過同源重組的方法，將糖化酶表達(dá)盒和選擇標(biāo)記基因定點整合到黑曲霉An12g08830基因座，再通過常規(guī)的抗性篩選和發(fā)酵培養(yǎng)重組黑曲霉獲得糖化酶。本發(fā)明將糖化酶表達(dá)盒通過改進(jìn)的同源重組方法定點整合到黑曲霉基因座An12g08830處后，不僅其轉(zhuǎn)化效率和表達(dá)糖化酶活力顯著升高，且省去了大量篩選轉(zhuǎn)化子的過程?！緦＠f明】一段重組基因及提高黑曲霉表達(dá)糖化酶的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一段重組基因及提高黑曲霉表達(dá)糖化酶的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]糖化酶(1，4-a-D-萄聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化淀粉或寡糖等多糖分子的非還原端釋放出D-葡萄糖的酶。在商業(yè)上，糖化酶是由包括黑曲霉和米曲霉在內(nèi)的幾種絲狀真菌和酵母生產(chǎn)的。絲狀真菌作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)有價值的產(chǎn)品(如酶)為人們熟知，其中尤以黑曲霉和米曲霉由于被國際普遍認(rèn)定為安全菌(GenerallyRecognizedAsSafe,GRAS)的特征而被廣泛用于表達(dá)宿主，從而用于生產(chǎn)食品添加劑。[0003]最初，科學(xué)家及商業(yè)公司通過傳統(tǒng)的菌種選育方法進(jìn)行育種，從而提高某種目的產(chǎn)物(如糖化酶)的表達(dá)量或產(chǎn)量。例如，利用紫外照射或者化學(xué)誘變劑處理曲霉后，針對特定產(chǎn)物對其進(jìn)行篩選，從而獲得高產(chǎn)菌株。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們開始利用基因工程方法進(jìn)行微生物育種。要獲得高產(chǎn)量(或高表達(dá)量)菌株，例如提高酶的表達(dá)量，首先需要選擇特定的啟動子(誘導(dǎo)型或組成型)，隨后對要表達(dá)的基因進(jìn)行優(yōu)化。除此之外，還需要適合的終止子序列。這樣由啟動子，編碼序列及終止子序列進(jìn)行串聯(lián)即可得到表達(dá)盒。將目的表達(dá)盒與特定的選擇標(biāo)記連接后，可轉(zhuǎn)入到微生物體內(nèi)。這些表達(dá)盒可以定點插入到基因座中，也可以隨機(jī)插入到基因座中。曲霉轉(zhuǎn)化技術(shù)原理遵循非同源斷裂修復(fù)機(jī)理，造成利用同源重組進(jìn)行定點插入到基因座中比較困難，因此現(xiàn)有曲霉育種方法大都使用隨機(jī)插入到基因座中，隨后再根據(jù)需要對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行大規(guī)模篩選，以獲得目的菌株。這樣的方法費時費力，且結(jié)果不可預(yù)見。理論上講，篩選越多轉(zhuǎn)化子，獲得優(yōu)勢菌株的可能性越大。[0004]曲霉如黑曲霉的DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)主要有聚乙二醇介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。無論上述何種方法，他們的共同特點都是轉(zhuǎn)化效率極其低下，每微克DNA的轉(zhuǎn)化效率只有幾個到幾百個轉(zhuǎn)化子，要比細(xì)菌(如大腸桿菌)及酵母(如釀酒酵母)轉(zhuǎn)化效率低幾個數(shù)量級。再加上曲霉的篩選費時費力，因此與傳統(tǒng)誘變-篩選育種一樣，隨機(jī)整合DNA育種過程也需要耗費大量時間和勞動成本，且結(jié)果不可預(yù)見?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一個定點整合糖化酶基因到黑曲霉菌種染色體中，實現(xiàn)對糖化酶高表達(dá)的技術(shù)方案。[0006]本發(fā)明的另一目的是提供一段重組基因。[0007]一種提高黑曲霉表達(dá)糖化酶的方法，通過同源重組的方法，將糖化酶表達(dá)盒和選擇標(biāo)記基因定點整合到黑曲霉Anl2g08830基因座，再通過常規(guī)的抗性篩選和發(fā)酵培養(yǎng)重組黑曲霉獲得糖化酶。[0008]具體地，定點整合基因座被確定為An12g08830(參照黑曲霉CBS513.88基因組)，首先選取基因座側(cè)翼5’及3’序列作為同源側(cè)翼序列，同源側(cè)翼序列片段大小優(yōu)選100-5000bp，優(yōu)選1000-3000bp，更優(yōu)選2000bp。選取側(cè)翼序列是為了實現(xiàn)定點糖化酶表達(dá)盒的敲入。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，同源序列越長，越容易發(fā)生同源重組，但是長序列的體外操作可能存在一定困難。同源序列越短，體外操作越容易，但是定點整合的幾率也會降低。通常是在整合幾率與操作難易之間選擇一個均衡的長度。[0009]為了構(gòu)建糖化酶表達(dá)盒，首先需要選擇必須的啟動子。啟動子可以是黑曲霉內(nèi)源啟動子，如黑曲霉糖化酶啟動子，中性淀粉酶啟動子，酸性淀粉酶啟動子，α-葡萄糖苷酶啟動子等。也可以是外源啟動子。如米曲霉中性淀粉酶啟動子，米根酶糖化酶啟動子。也可以是啟動子變體，如黑曲霉中性淀粉酶變體。與啟動子3’末端連接的可以是調(diào)控序列，如合適的前導(dǎo)序列，即對于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。如米曲霉中性淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶前導(dǎo)序列。[0010]糖化酶基因可以選擇黑曲霉內(nèi)源基因，也可以來自其他種如米曲霉，米根酶，踝節(jié)菌屬，青霉屬。本發(fā)明優(yōu)選黑曲霉糖化酶(AnGA)和埃莫森踝節(jié)菌糖化酶(TeGA)。[0011]優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。[0012]本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個(幾個)選擇性標(biāo)記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hyg(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5’-磷酸脫羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺昔酸轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氛基苯甲酸合酶(anthraniIatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)或米曲霉的amdS和hyg。[0013]為了實現(xiàn)糖化酶表達(dá)盒基因敲入到Anl2g08830基因座中，優(yōu)選的方法是使用同源重組方法，即糖化酶表達(dá)盒與選擇標(biāo)記的5’及3’端具有Anl2g08830基因座同源側(cè)翼序列。通過轉(zhuǎn)化及標(biāo)記物篩選獲得敲入轉(zhuǎn)化子。曲霉轉(zhuǎn)化技術(shù)原理遵循非同源斷裂修復(fù)機(jī)理，造成利用同源重組進(jìn)行定點插入到基因座中比例很低，成功率低下。更優(yōu)選的方案是改進(jìn)后的同源重組方法，即Kim(Kimetal.,Biochem.Biophys.Res.Commun390(3):983-988,2009)等人描述的方法(Double-JointPCRwithSplitDominantSelectableMarkers)。具體地，為完成同源重組，需兩段序列共同轉(zhuǎn)化。第一段序列由Anl2g08830基因座5’側(cè)翼序列與第一段選擇標(biāo)記基因鏈接，第二段序列由Anl2g08830基因座3’側(cè)翼序列與糖化酶表達(dá)盒及第二段選擇標(biāo)記基因順序鏈接。第一段與第二段在選擇標(biāo)記部分具有至少IOObp的同源序列，優(yōu)選IOO-1OOObp。將兩段序列共同轉(zhuǎn)化，只有側(cè)翼序列及選擇標(biāo)記三段同源序列同時發(fā)生重組，才會出現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)化子。大大提高了同源重組的轉(zhuǎn)化率。[0014]一段重組基因，該基因為通過同源重組的方法，將糖化酶表達(dá)盒和選擇標(biāo)記基因定點整合到黑曲霉Anl2g08830基因座所得。[0015]其中，選取黑曲霉Anl2g08830基因座側(cè)翼5’及3’100_5000bp序列作為同源側(cè)翼序列，優(yōu)選選取黑曲霉Anl2g08830基因座側(cè)翼5’及3’1000-3000bp序列作為同源側(cè)翼序列，進(jìn)一步優(yōu)選選取黑曲霉Anl2g08830基因座側(cè)翼5’及3’2000bp序列作為同源側(cè)翼序列。[0016]所述的同源重組，需兩段序列共同轉(zhuǎn)化黑曲霉，第一段序列由Anl2g08830基因座5’側(cè)翼序列與第一段選擇標(biāo)記基因鏈接，第二段序列由Anl2g08830基因座3’側(cè)翼序列與糖化酶表達(dá)盒及第二段選擇標(biāo)記基因順序鏈接，第一段序列與第二段序列在選擇標(biāo)記基因部分具有同源序列。[0017]所述的第一段序列與第二段序列在選擇標(biāo)記部分優(yōu)選具有至少IOObp的同源序列，進(jìn)一步優(yōu)選具有100~1000bp的同源序列。[0018]所述的糖化酶表達(dá)盒主要由啟動子、糖化酶基因及終止子組成；優(yōu)選由啟動子、調(diào)控序列、糖化酶基因及終止子組成。啟動子、調(diào)控序列、糖化酶基因及終止子的選擇范圍同上所述。[0019]所述的同源重組方法包括兩段同源側(cè)翼序列的克隆，以及原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明中原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化為本領(lǐng)域常規(guī)方法。[0020]包含上述重組基因的重組菌株；優(yōu)選含有上述重組基因的黑曲霉。[0021]所述的重組黑曲霉優(yōu)選含有SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示片段。[0022]一種鑒定本發(fā)明所述的重組菌株的方法，通過PCR擴(kuò)增或其他基因鑒定方法，如果能夠獲得或鑒定含有SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示片段，則表明為本發(fā)明所述的重組菌株。[0023]所述的方法優(yōu)選以08830test_Fl與08830test_Rl、08830test_F2與08830test_R2為引物，PCR擴(kuò)增待檢基因、含有待檢基因的質(zhì)?；蛑亟M細(xì)胞，如果能夠獲得SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示片段，則表明為重組菌株；其中所述的08830test_Fl序列如SEQIDN0.9所示，08830test_Rl序列如SEQIDN0.10所示，所述的08830test_F2序列如SEQIDN0.11所示，08830test_R2序列如SEQIDN0.12所示。[0024]本發(fā)明所述的重組基因、所述的重組菌株在提高黑曲霉發(fā)酵表達(dá)糖化酶中的應(yīng)用。[0025]有益效果:[0026]本發(fā)明將糖化酶表達(dá)盒通過改進(jìn)的同源重組方法定點整合到黑曲霉基因座Anl2g08830處后，不僅其轉(zhuǎn)化效率和表達(dá)糖化酶活力顯著升高，而且省去了大量篩選轉(zhuǎn)化子的過程?！緦＠綀D】【附圖說明】[0027]圖1:pGAHyg質(zhì)粒圖譜。[0028]圖2:糖化酶表達(dá)盒定點整合到基因座Anl2g08830的PCR驗證結(jié)果。[0029]泳道M:DNAMarkerIII(廠家:TIANGEN)；[0030]泳道1:對照以08830test_Fl與08830test_Rl為引物得到的PCR產(chǎn)物；[0031]泳道2-7:依次為1-6號轉(zhuǎn)化子以08830test_Fl與08830test_Rl為引物得到的PCR產(chǎn)物；[0032]泳道8:對照以08830test_F2與08830test_R2為引物得到的PCR產(chǎn)物；[0033]泳道9-14:依次為1-6號轉(zhuǎn)化子以08830test_F2與08830test_R2為引物得到的PCR產(chǎn)物。[0034]圖3:定點整合轉(zhuǎn)化子整合到Anl2g08830基因座的圖譜?！揪唧w實施方式】[0035]下面結(jié)合實例對本發(fā)明的構(gòu)建過程做進(jìn)一步闡釋，下述說明中相關(guān)實例是說明性質(zhì)的，不能限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0036]按步驟詳細(xì)寫明實驗方案，包括實驗材料、方法、條件、結(jié)果等。[0037]實施例1隨機(jī)整合GA表達(dá)盒構(gòu)建[0038]為了與定點整合結(jié)果作對比，構(gòu)建了隨機(jī)整合質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含以下幾個部分:[0039](l)pUC57質(zhì)粒經(jīng)EcoR1-HindIII雙酶切后得到的片段；[0040](2)糖化酶(TeGA)表達(dá)盒,其中糖化酶是踝節(jié)菌屬變體，由GenScript公司合成，序列如SEQIDN0.1所示；[0041](3)選擇標(biāo)記Hyg表達(dá)盒，由GenScript公司合成,序列見SEQIDN0.2；[0042]首先分別用引物GA_F與GA_R、hyg_F0與hyg_R0通過PCR擴(kuò)出帶有重組臂的GA基因和hyg基因，然后利用PCR通過GA_F與hyg_R0引物兩端的重疊序列將GA基因和hyg基因拼成一條直鏈長片段，再通過ClonEZ(購自GenScript公司)方法與具有末端互補序列的pUC57Ec0R1-HindIII酶切線性回收片段進(jìn)行重組，得到pGAHyg質(zhì)粒，構(gòu)建好的質(zhì)粒圖譜見圖1。該質(zhì)粒在GA表達(dá)盒上游和Hyg表達(dá)盒下游分別加上了HindIII位點，以便線性化后用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。[0043]相關(guān)引物序列如下:[0044]【權(quán)利要求】1.一種提高黑曲霉表達(dá)糖化酶的方法，其特征在于通過同源重組的方法，將糖化酶表達(dá)盒和選擇標(biāo)記基因定點整合到黑曲霉Anl2g08830基因座，再通過常規(guī)的抗性篩選和發(fā)酵培養(yǎng)重組黑曲霉獲得糖化酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選取黑曲霉Anl2g08830基因座側(cè)翼5‘及3’100-5000bp序列作為同源側(cè)翼序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于選取黑曲霉Anl2g08830基因座側(cè)翼5‘及3’500bp-5000bp序列作為同源側(cè)翼序列，優(yōu)選選取黑曲霉Anl2g08830基因座側(cè)翼5‘及3’1000-3000bp序列作為同源側(cè)翼序列，進(jìn)一步優(yōu)選選取黑曲霉Anl2g08830基因座側(cè)翼5‘及3’2000bp序列作為同源側(cè)翼序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項所述的方法，其特征在于所述的同源重組，需兩段序列共同轉(zhuǎn)化黑曲霉，第一段序列由Anl2g08830基因座5‘側(cè)翼序列與第一段選擇標(biāo)記基因鏈接，第二段序列由Anl2g08830基因座3‘側(cè)翼序列與糖化酶表達(dá)盒及第二段選擇標(biāo)記基因順序鏈接，第一段序列與第二段序列在選擇標(biāo)記基因部分具有同源序列。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的第一段序列與第二段序列在選擇標(biāo)記部分具有至少IOObp的同源序列。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的糖化酶表達(dá)盒主要由啟動子、糖化酶基因及終止子組成。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的啟動子選自黑曲霉內(nèi)源啟動子、外源啟動子或啟動子變體。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的黑曲霉內(nèi)源啟動子選自黑曲霉糖化酶啟動子、中性淀粉酶啟動子、酸性淀粉酶啟動子或α-葡萄糖苷酶啟動子；所述的外源啟動子選自米曲霉中性淀粉酶啟動子、米根酶糖化酶啟動子；所述的啟動子變體選自黑曲霉中性淀粉酶變體。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的糖化酶表達(dá)盒還可以包括調(diào)控序列，調(diào)控序列為對于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)，優(yōu)選米曲霉中性淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶前導(dǎo)序列。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的糖化酶基因選自黑曲霉內(nèi)源基因，或來自其他種屬的糖化酶基因。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述的其他種屬的糖化酶基因選自米曲霉，米根酶，踝節(jié)菌屬或青霉屬的糖化酶基因及突變體，優(yōu)選黑曲霉糖化酶和埃莫森踝節(jié)菌糖化酶及突變體。12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的終止子從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶基因、黑曲霉α-葡糖苷酶基因或尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因。13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的選擇標(biāo)記基因數(shù)量為一個或多個，其表達(dá)產(chǎn)物提供抗生素抗性、殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述的選擇標(biāo)記基因選自乙酰胺酶基因、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因、草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、硝酸還原酶基因、乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶基因、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因、鄰氨基苯甲酸合酶基因或它們的等同物，優(yōu)選構(gòu)巢曲霉或米曲霉的乙酰胺酶基因或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。15.一段用于提高黑曲霉表達(dá)糖化酶的重組基因，其特征在于該基因為通過同源重組的方法，將糖化酶表達(dá)盒和選擇標(biāo)記基因定點整合到黑曲霉Anl2g08830基因座所得。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的重組基因，其特征在于選取黑曲霉Anl2g08830基因座側(cè)翼5‘及3’100-5000bp序列作為同源側(cè)翼序列，優(yōu)選選取黑曲霉Anl2g08830基因座側(cè)翼5‘及3’1000-3000bp序列作為同源側(cè)翼序列，進(jìn)一步優(yōu)選選取黑曲霉Anl2g08830基因座側(cè)翼5‘及3’2000bp序列作為同源側(cè)翼序列。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的重組基因，其特征在于所述的同源重組，需兩段序列共同轉(zhuǎn)化黑曲霉，第一段序列由Anl2g08830基因座5‘側(cè)翼序列與第一段選擇標(biāo)記基因鏈接，第二段序列由Anl2g08830基因座3‘側(cè)翼序列與糖化酶表達(dá)盒及第二段選擇標(biāo)記基因順序鏈接，第一段序列與第二段序列在選擇標(biāo)記基因部分具有同源序列。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的重組基因，其特征在于所述的第一段序列與第二段序列在選擇標(biāo)記部分具有至少IOObp的同源序列。19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的重組基因，其特征在于所述的糖化酶表達(dá)盒主要由啟動子、糖化酶基因及終止子組成；優(yōu)選由啟動子、調(diào)控序列、糖化酶基因及終止子組成。20.包含權(quán)利要求15~19中任一項所述的重組基因的重組菌株，所述的菌株優(yōu)選黑曲霉O21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的重組菌株，其特征在于所述的菌株含有SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示片段。22.—種鑒定權(quán)利要求20~21中任一項所述的重組菌株的方法，其特征在于通過PCR擴(kuò)增方法，如果能夠獲得含有SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示序列的基因片段，則表明為重組菌株。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于以08830test_Fl與08830test_RU08830test_F2與08830test_R2為引物，PCR擴(kuò)增，如果能夠獲得含有SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示序列的基因片段，則表明為重組菌株；其中所述的08830test_Fl序列如SEQIDN0.9所示，08830test_Rl序列如SEQIDN0.10所示，所述的08830test_F2序列如SEQIDN0.11所示，08830test_R2序列如SEQIDN0.12所示。24.權(quán)利要求15~19中任一項所述的重組基因、權(quán)利要求20或21所述的菌株在提高黑曲霉發(fā)酵表達(dá)糖化酶中的應(yīng)用?！疚臋n編號】C12N1/15GK103937766SQ201410173213【公開日】2014年7月23日申請日期:2014年4月25日優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日【發(fā)明者】白挨璽,孫健,卞芙蓉,張垠,李峰,徐鳳,徐紅,潘金龍,章方良申請人:南京百斯杰生物工程有限公司