復(fù)合菌劑及其應(yīng)用以及利用其制備有機(jī)肥的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌。相應(yīng)地，本發(fā)明還公開(kāi)了一種復(fù)合菌劑制備有機(jī)肥的方法，包括以下步驟：a.將復(fù)合菌劑與植物類纖維原料混合均勻，得到發(fā)酵原料；b.將發(fā)酵原料進(jìn)行堆肥發(fā)酵；c.將堆肥后的發(fā)酵原料干燥得到有機(jī)肥。復(fù)合菌劑所包含的微生物之間不產(chǎn)生拮抗作用，能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過(guò)程中有效地合作，充分利用生產(chǎn)原料的各化學(xué)組分，最終生產(chǎn)出高品質(zhì)的有機(jī)肥。得到的有機(jī)肥符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(NY884-2012)的參數(shù)指標(biāo)，能夠改善土壤種植性狀，有利于土壤微生物菌群組成的優(yōu)化，提供全方面的植物根系營(yíng)養(yǎng)。
【專利說(shuō)明】復(fù)合菌劑及其應(yīng)用以及利用其制備有機(jī)肥的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及復(fù)合菌劑及其應(yīng)用以及利用其制備有機(jī)肥的方法，復(fù)合菌劑可以應(yīng)用于植物纖維類廢棄物快速資源化處理，尤其是木薯酒糟的快速資源化處理。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)業(yè)廢棄物是指在整個(gè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中被丟棄的有機(jī)類物質(zhì)，目前我國(guó)每年產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)廢棄物以幾十億噸計(jì)。其中農(nóng)林生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的植物類殘余廢棄物占據(jù)了很大的一部分比重，而且是所有農(nóng)業(yè)廢棄物中最難被利用的一種。
[0003]作為農(nóng)業(yè)廢棄物中比重較高的植物纖維類廢棄物，其來(lái)源廣泛，比如在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中殘留的作物秸桿、園林廢棄物、樹皮、果殼、蔗渣和酒糟渣等。這一大類農(nóng)業(yè)廢棄物的化學(xué)組成主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，具有產(chǎn)量大、可再生、再生周期短和環(huán)境友好等特點(diǎn)。將植物纖維類廢棄物進(jìn)行堆肥化處置回歸到農(nóng)業(yè)再利用是一種重要的農(nóng)業(yè)廢棄物資源化處理手段。其通過(guò)高溫好氧堆肥發(fā)酵、厭氧發(fā)酵和好氧厭氧結(jié)合的多種發(fā)酵方式，將植物纖維類廢棄物進(jìn)行快速腐熟、穩(wěn)定和干燥，制備成能夠改良土壤性狀、提高土壤耕地性能和提升農(nóng)產(chǎn)品作物品質(zhì)的有機(jī)肥。
[0004]植物纖維類廢棄物的有機(jī)肥化隨著技術(shù)手段的提升和產(chǎn)品利用價(jià)值的提升，越來(lái)越受到各行業(yè)的關(guān)注，其生產(chǎn)工藝也在不斷地優(yōu)化和改進(jìn)之中。而高效的堆肥菌劑又是植物纖維類廢棄物堆肥生產(chǎn)有機(jī)肥技術(shù)的關(guān)鍵與核心。高效的堆肥發(fā)酵菌劑包含能夠快速有效降解纖維類廢棄物中難 以被利用的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)，使其能夠更好地改良土壤、培肥地力。與此同時(shí)降解的纖維類物質(zhì)為菌劑中其他菌種提供能量來(lái)源，產(chǎn)生對(duì)作物有利的氣基酸和糖類等有益物質(zhì)。聞效菌劑所制備的有機(jī)肥，其活菌數(shù)聞，施用該有機(jī)肥能夠促進(jìn)土壤微生物的活動(dòng)，促進(jìn)作物根系對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)的吸收，最終達(dá)到增產(chǎn)增質(zhì)的效果。
[0005]目前，已有專利涉及植物纖維類廢棄物發(fā)酵有機(jī)肥菌劑獲得授權(quán)。ZL200910233577.6公開(kāi)了一種農(nóng)業(yè)廢棄物快速堆肥菌劑及其生產(chǎn)有機(jī)肥的方法，通過(guò)一株能在50°C下快速分解各種富含纖維素廢棄物的菌株NJZS對(duì)纖維類廢棄物進(jìn)行堆肥發(fā)酵得到有機(jī)肥。ZL200810224244.2公開(kāi)了一種用于降解秸桿的菌劑，其活性成分主要包括綠色木霉 CICC40502 (Trichodermaviride)、黃綠木霉(Trichodermaaureoviride)和飼料類芽孢桿菌(Paenibacilluspabuli)三種菌種，能夠快速腐熟稻桿制備有機(jī)肥。ZL00121101.3公開(kāi)了一種有機(jī)物快速腐熟菌劑，其由7株纖維素分解菌和載體組成，適用于肥的快速腐熟生產(chǎn)。
[0006]以上公開(kāi)的有機(jī)肥菌劑相關(guān)方面的專利均能夠提供快速腐熟有機(jī)肥生產(chǎn)原料的特性，達(dá)到縮短有機(jī)肥發(fā)酵周期的目的。但是在實(shí)際生產(chǎn)中，由于有機(jī)肥的生產(chǎn)原料來(lái)源不同，每批次的碳氮比、PH值和物理性狀組成等重要發(fā)酵條件都不同，僅僅依賴單一或少量的菌株組成的發(fā)酵菌劑，很難保證每批次產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定，難以實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)的有機(jī)肥大規(guī)模化生產(chǎn)。有鑒于此，有必要提供一種復(fù)合菌劑，能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過(guò)程中有效地合作，將不同來(lái)源的原料統(tǒng)一發(fā)酵成高品質(zhì)的有機(jī)肥產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過(guò)程中有效地合作，將不同來(lái)源的原料統(tǒng)一發(fā)酵成高品質(zhì)的有機(jī)肥產(chǎn)品的復(fù)合菌劑及其應(yīng)用以及利用其制備有機(jī)肥的方法。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽抱桿菌(BaciIIusmegaterium)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、米曲霉(AspergillusOryzae)、綠色木霉(Trichodermaviride)、白地霉(Geotrichumcandidum)、黑曲霉(AspergiIIusniger)、少抱根霉(Rhizopusoligosporus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)。其中，枯草芽孢桿菌能夠在高溫堆肥階段繼續(xù)存活,并且產(chǎn)生大量的蛋白酶、纖維素酶、糖酶等水解酶系對(duì)原料進(jìn)行充分水解，同時(shí)枯草芽孢桿菌還能對(duì)主要的土傳病原菌通過(guò)拮抗作用進(jìn)行有效抑制。巨大芽孢桿菌能夠在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，可將土壤中的難容的含磷物質(zhì)分解或溶解，轉(zhuǎn)化成容易被植物吸收的磷元素，提高磷的利用率。同時(shí)巨大芽孢桿菌在增殖過(guò)程中能夠釋放出高活性的分解酵素及多種促進(jìn)因子，促進(jìn)植物養(yǎng)分的吸收，提高肥效。圓褐固氮菌作為一種自生固氮菌，具有將強(qiáng)的固氮能力，同時(shí)也可以分泌生長(zhǎng)素，促進(jìn)植株的生長(zhǎng)和果實(shí)的發(fā)育?？祵幠久埂⒚浊?、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉能夠產(chǎn)生高活力的纖維素酶、糖化酶和蛋白酶，可以降解堆肥原料中的纖維素、半纖維素和蛋白質(zhì)等主要組分。
[0009]本發(fā)明的復(fù)合菌劑由多種微生物組成，包含了好氧和厭氧，細(xì)菌和真菌，纖維降解菌、固氮菌和產(chǎn)益生元菌等多種有效微生物，能夠?qū)⒉煌瑏?lái)源的原料統(tǒng)一發(fā)酵成高品質(zhì)的有機(jī)肥產(chǎn)品。本發(fā)明所提出的復(fù)合菌劑經(jīng)過(guò)多次篩選得到，所包含的微生物之間不產(chǎn)生拮抗作用，能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過(guò)程中有效地合作，充分利用生產(chǎn)原料的各化學(xué)組分，最終生廣出聞品質(zhì)的有機(jī)肥。
[0010]需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的實(shí)施例采用的菌種來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，其編號(hào)為:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉 CICC2148、綠色木霉 CICC40502、白地霉 CICC3152、黑曲霉 CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0011]在一些實(shí)施方式中，復(fù)合菌劑的制備方法包括以下步驟:
[0012]i活化培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌和圓褐固氮菌分別取I~2環(huán)菌種接種至對(duì)應(yīng)的活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液；
[0013]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按1% (V/V)的接種量分別接種到對(duì)應(yīng)的擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液；
[0014]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種到固體培養(yǎng)基中，在28~30°C下培養(yǎng)2~3天，然后在37~40°C下培養(yǎng)2~3天，得到固體種子；
[0015] iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)3~5天，然后在37~40°C下培養(yǎng)3~5天，最后在50~55°C下干燥至含水量低于20%,得到復(fù)合菌劑。
[0016]本發(fā)明的復(fù)合菌劑通過(guò)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)、固體培養(yǎng)和固體擴(kuò)大培養(yǎng)多個(gè)步驟制備而成，制備方法簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)，多級(jí)活化和擴(kuò)大培養(yǎng)使得復(fù)合菌劑的活菌含量高，最終得到的固體復(fù)合菌劑能夠維持長(zhǎng)時(shí)間的高活菌率，非常適合大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。
[0017]在一些實(shí)施方式中，在步驟i中，各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0018]枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5 %、余量為去離子水、pH7.4~7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150-200r/min、35-37°C、15 ~18h ；
[0019]康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速100 ~150r/min、28-30°c、24 ~28h ；
[0020]植物乳桿菌進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5 %、檸檬酸氫二銨0.2 %、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.2~6.6，培養(yǎng)條件:35-37°C>24~28h、靜置培養(yǎng)；
[0021]圓褐固氮菌進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1%、磷酸二氫鉀0.2%。、氯化鈉0.2%。、硫酸鎂0.2%。、硫酸鈣0.2%。、碳酸鈣0.5%、余量為去離子水、pH7.0~
7.2，轉(zhuǎn)速 150-200r/min、35-37°C、15 ~18h。
[0022]上述各菌種分開(kāi)進(jìn)行活化培養(yǎng)，每個(gè)菌種的活化培養(yǎng)都具有對(duì)應(yīng)的活化培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，能夠使各菌種快速活化。其中，吐溫為聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，簡(jiǎn)稱聚山梨酯(Polysorbate)。
[0023]在一些實(shí)施方式中，在步驟ii中，各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0024]枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.4~7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150~200r/min、35-37°C、15 ~18h ；
[0025]康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速100 ~150r/min、28 ~30°C、24 ~28h ；
[0026]植物乳桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5 %、檸檬酸氫二銨0.2 %、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2 %、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水，pH6.2~6.6，培養(yǎng)條件為:35-37 0C >24~28h、靜置培養(yǎng)；
[0027]圓褐固氮菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1%、磷酸二氫鉀
0.2%。、氯化鈉0.2%。、硫酸鎂0.2%。、硫酸鈣0.2%。、碳酸鈣0.5%、余量為去離子水，pH7.0~
7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 150 ~200r/min、35-37°C、15 ~18h。
[0028]上述各菌種分開(kāi)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每個(gè)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)都具有對(duì)應(yīng)的擴(kuò)大培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，能夠使各菌種快速增殖，縮短擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)間。其中，吐溫為聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，簡(jiǎn)稱聚山梨酯(Polysorbate)。
[0029]在一些實(shí)施方式中，在步驟iii中:固體培養(yǎng)基為木薯酒糟或木薯酒糟與豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸桿按5~8:1:1 (W/W)混合。
[0030]在一些實(shí)施方式中，在步驟iv中:固體擴(kuò)大培養(yǎng)基為木薯酒糟或木薯酒糟與豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸桿按5~8:1:1 (W/W)混合。
[0031]在一些實(shí)施方式中，豆柏的粗蛋白含量>43%，從而使固體培養(yǎng)基或固體擴(kuò)大培養(yǎng)基具有充分的蛋白含量。
[0032]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種利用上述復(fù)合菌劑制備有機(jī)肥的方法，包括以下步驟:[0033]a按添加比例I~5 % (W/W)，將復(fù)合菌劑與植物類纖維原料混合均勻，得到發(fā)酵原料，其中，發(fā)酵原料的水分含量為50~60%、pH6.0~8.5，復(fù)合菌劑的活性成分包含枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌和圓褐固氮菌；
[0034]b將發(fā)酵原料進(jìn)行堆肥發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵環(huán)境的溫度在30°C以下時(shí)，堆肥的時(shí)間為20~25天，當(dāng)發(fā)酵環(huán)境在溫度在30°C以上時(shí)，堆肥的時(shí)間為15~20天。在發(fā)酵過(guò)程中，每隔3~4天翻料一次；
[0035]c將堆肥后的發(fā)酵原料于50°C下干燥至水分含量低于30%，即得到有機(jī)肥。
[0036]上述制備有機(jī)肥的方法，利用復(fù)合菌劑對(duì)植物類纖維原料進(jìn)行堆肥發(fā)酵，發(fā)酵周期短，條件溫和，易于實(shí)現(xiàn)。復(fù)合菌劑中的多種活性菌能夠?qū)Σ煌瑏?lái)源的植物纖維類原料進(jìn)行高效快速分解，使得自身得到快速增殖，因此在生產(chǎn)有機(jī)肥的發(fā)酵過(guò)程中需要調(diào)控的步驟較為簡(jiǎn)單，操作方便。得到的有機(jī)肥中的有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以烘干基計(jì))大于45%，總養(yǎng)分(氮+五氧化二磷+氧化鉀)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以烘干基計(jì))大于5%，水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于30%，PH值:5.5~8.5，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(NY884-2012)的參數(shù)指標(biāo)。得到的有機(jī)肥能夠改善土壤種植性狀，有利于土壤微生物菌群組成的優(yōu)化，提供全方面的植物根系營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提升作物產(chǎn)量。
[0037]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述復(fù)合菌劑在制備有機(jī)肥的應(yīng)用。復(fù)合菌劑所包含的微生物之間不產(chǎn)生拮抗作用，能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過(guò)程中有效地合作，充分利用生產(chǎn)原料的各化學(xué)組分，最終生產(chǎn)出高品質(zhì)的有機(jī)肥。
[0038]本發(fā)明的有益效果為:復(fù)合菌劑由多種微生物組成，包含了好氧和厭氧，細(xì)菌和真菌，纖維降解菌、固氮菌和產(chǎn)益生元菌等多種有效微生物，能夠?qū)⒉煌瑏?lái)源的原料統(tǒng)一發(fā)酵成高品質(zhì)的有機(jī)肥產(chǎn)品。本發(fā)明所提出的復(fù)合菌劑所包含的微生物之間不產(chǎn)生拮抗作用，能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過(guò)程中有效地合作，充分利用生產(chǎn)原料的各化學(xué)組分，最終生產(chǎn)出高品質(zhì)的有機(jī)肥。利用復(fù)合菌劑制備有機(jī)肥可以實(shí)現(xiàn)植物纖維類廢棄物資源化處理，得到的有機(jī)肥中的有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以烘干基計(jì))大于45%，總養(yǎng)分(氮+五氧化二磷+氧化鉀)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以烘干基計(jì))大于5%，水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于30%，？!1值:5.5~8.5，完全達(dá)到有機(jī)肥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求。且生產(chǎn)周期短、工藝穩(wěn)定。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。[0040]實(shí)施例1
[0041]復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0042]復(fù)合菌劑的制備:
[0043]i活化培養(yǎng):將儲(chǔ)存于4°C冰箱的斜面菌種:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分別取I環(huán)菌種接種至對(duì)應(yīng)的500ml活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液。其中，活化培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0044]各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0045]枯草芽孢桿菌CICC21082和巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量為去離子水、pH7.4，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 150r/min、35°C、15h ；
[0046]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速100r/min、28°C、24h ；
[0047]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.2，培養(yǎng)條件:35°C、24h、靜置培養(yǎng)；
[0048]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水、ρΗ7.0，轉(zhuǎn)速 150r/min、35°C、15h。
[0049]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量接種到對(duì)應(yīng)的IL液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液。其中，擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0050]各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0051]枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.4，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 150r/min、35°C、15h ；
[0052]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速100r/min、28°C、24h ;
[0053]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水、pH6.2，培養(yǎng)條件為:35°C、24h、靜置培養(yǎng)；
[0054]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氫鉀0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水，ρΗ7.0，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 150r/min、35°C、15h。
[0055]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種到5Kg木薯酒糟固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在28°C下培養(yǎng)2天，然后在37°C下培養(yǎng)2天，得到固體種子。
[0056]iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到50Kg木薯酒糟固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)3天，然后在37°C下培養(yǎng)3天，最后在50°C下干燥至含水量低于20%,得到復(fù)合菌劑。
[0057]對(duì)本實(shí)施例所制備的復(fù)合菌劑進(jìn)行活菌數(shù)的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。從表1的結(jié)果中可以得出微生物菌劑的有效菌種活菌數(shù)大都能達(dá)到IO5個(gè)/克(三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均值)以上，能夠得到一種高活性的復(fù)合菌劑。
[0058]實(shí)施例2
[0059]復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0060]復(fù)合菌劑的制備:
[0061]i活化培養(yǎng):將儲(chǔ)存于4°C冰箱的斜面菌種:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分別取2環(huán)菌種接種至對(duì)應(yīng)的50ml活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液。其中，活化培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0062]各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0063]枯草芽孢桿菌CICC21082和巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h ；
[0064]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150r/min、30°C、28h ；
[0065]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.6，培養(yǎng)條件:37°C、28h、靜置培養(yǎng)；
[0066]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氫鉀0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水、ρΗ7.2，轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h。
[0067]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量接種到對(duì)應(yīng)的IL液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液。其中，擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0068]各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:[0069]枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h ；
[0070]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150r/min、30°C、28h ;
[0071]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水、pH6.6，培養(yǎng)條件為:37°C、28h、靜置培養(yǎng)；
[0072]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水，pH7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h。
[0073]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種至lj5Kg木薯酒糟、豆柏和秸桿按8:1:1 (W/W)混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)3天，然后在40°C下培養(yǎng)3天，得到固體種子。
[0074]iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏和秸桿按8:1:1 (W/W)混合的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)5天，然后在40°C下培養(yǎng)5天，最后在55°C下干燥至含水量低于20%，得到復(fù)合菌劑。
[0075]對(duì)本實(shí)施例所制備的復(fù)合菌劑進(jìn)行活菌數(shù)的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。從表1的結(jié)果中可以得出復(fù)合菌劑的各菌種的有效菌種活菌數(shù)大都能達(dá)到IO6個(gè)/克(三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均值)以上，能夠得到一種高活性的復(fù)合菌劑。
[0076]實(shí)施例3
[0077]復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0078]復(fù)合菌劑的制備:
[0079]i活化培養(yǎng):將儲(chǔ)存于4°C冰箱的斜面菌種:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分別取I環(huán)菌種接種至對(duì)應(yīng)的500ml活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液。其中，活化培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0080]各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0081]枯草芽孢桿菌CICC21082和巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、37°C、17h ；
[0082]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速130r/min、29°C、26h ；[0083]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.3，培養(yǎng)條件:36°C、26h、
靜置培養(yǎng)；
[0084]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水、ρΗ7.2，轉(zhuǎn)速 180r/min、37°C、17h。
[0085]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量接種到對(duì)應(yīng)的IL液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液。其中，擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0086]各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0087]枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.4，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、36°C、17h ；
[0088]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速130r/min、30°C、26h ;
[0089]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水、PH6.3，培養(yǎng)條件為:37°C、26h、靜置培養(yǎng)；
[0090]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水，pH7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、36°C、17h。
[0091]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種至lj5Kg木薯酒糟、豆柏和秸桿按5:1:1 (W/W)混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)3天，然后在40°C下培養(yǎng)3天，得到固體種子。
[0092]iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏和秸桿按5:1:1 (W/W)混合的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)5天，然后在40°C下培養(yǎng)5天，最后在50°C下干燥至含水量低于20%，得到復(fù)合菌劑。
[0093]對(duì)本實(shí)施例所制備的復(fù)合菌劑進(jìn)行活菌數(shù)的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。從表1的結(jié)果中可以得出復(fù)合菌劑的各菌種的有效菌種活菌數(shù)大都能達(dá)到IO5個(gè)/克(三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均值)以上，能夠得到一種高活性的復(fù)合菌劑。
[0094]實(shí)施例4
[0095]復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0096]復(fù)合菌劑的制備:
[0097]i活化培養(yǎng):將儲(chǔ)存于4°C冰箱的斜面菌種:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分別取I環(huán)菌種接種至對(duì)應(yīng)的500ml活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液。其中，活化培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0098]各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0099]枯草芽孢桿菌CICC21082和巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、37°C、17h ；
[0100]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速130r/min、29°C、26h ；
[0101]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.3，培養(yǎng)條件:36°C、26h、靜置培養(yǎng)；
[0102]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水、ρΗ7.2，轉(zhuǎn)速 180r/min、37°C、17h。
[0103]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量接種到對(duì)應(yīng)的IL液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液。其中，擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0104]各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0105]枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.4，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、36°C、17h ；
[0106]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速130r/min、30°C、26h ;
[0107]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5 %、檸檬酸氫二銨0.2 %、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水、pH6.3，培養(yǎng)條件為:37°C、26h、靜置培養(yǎng)；
[0108]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水，pH7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、36°C、17h。
[0109]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種到 5Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量≥43%)按5:1(W/W)混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)3天，然后在40°C下培養(yǎng)3天，得到固體種子。
[0110]iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量> 43% )按5:1(W/W)混合的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)5天，然后在40°C下培養(yǎng)5天，最后在50°C下干燥至含水量低于20%，得到復(fù)合菌劑。
[0111]對(duì)本實(shí)施例所制備的復(fù)合菌劑進(jìn)行活菌數(shù)的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。從表1的結(jié)果中可以得出復(fù)合菌劑的各菌種的有效菌種活菌數(shù)大都能達(dá)到IO5個(gè)/克(三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均值)以上，能夠得到一種高活性的復(fù)合菌劑。
[0112]實(shí)施例5
[0113]復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0114]復(fù)合菌劑的制備:[0115]i活化培養(yǎng):將儲(chǔ)存于4°C冰箱的斜面菌種:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分別取2環(huán)菌種接種至對(duì)應(yīng)的50ml活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液。其中，活化培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0116]各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:枯草芽孢桿菌CICC21082和巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3 %、蛋白胨1 %、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速200r/min、37°C>18h ；
[0117]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150r/min、30°C、28h ；
[0118]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.6，培養(yǎng)條件:37°C、28h、靜置培養(yǎng)；
[0119]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氫鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水、ρΗ7.2，轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h。
[0120]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量接種到對(duì)應(yīng)的IL液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液。其中，擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0121]各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏
0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速200r/min、37°C、18h ；
[0122]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150r/min、30°C、28h ;[0123]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水、pH6.6，培養(yǎng)條件為:37°C、28h、靜置培養(yǎng)；
[0124]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水，pH7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h。
[0125]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種到5Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量大于或等于43% )按8:1 (W/W)混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)3天，然后在40°C下培養(yǎng)3天，得到固體種子。
[0126]iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量大于或等于43% )按8:1(W/W)混合的固體培擴(kuò)大養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)5天，然后在40°C下培養(yǎng)5天，最后在55°C下干燥至含水量低于20%，得到復(fù)合菌劑。
[0127]對(duì)本實(shí)施例所制備的復(fù)合菌劑進(jìn)行活菌數(shù)的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。從表1的結(jié)果中可以得出復(fù)合菌劑的各菌種的有效菌種活菌數(shù)大都能達(dá)到IO5個(gè)/克(三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均值)以上，能夠得到一種高活性的復(fù)合菌劑。
[0128]表1不同實(shí)例中各菌劑中有效菌種活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.復(fù)合菌劑，其特征在于，其活性成分包含枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌和圓褐固氮菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，所述復(fù)合菌劑的制備方法包括以下步驟: i活化培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌和圓褐固氮菌分別取I~2環(huán)菌種接種至對(duì)應(yīng)的活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液； ?擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量分別接種到對(duì)應(yīng)的擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液； iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種到固體培養(yǎng)基中，在28~30°C下培養(yǎng)2~3天，然后在37~40°C下培養(yǎng)2~3天，得到固體種子; iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)3~5天，然后在37~40°C下培養(yǎng)3~5天，最后在50~55°C下干燥至含水量低于20%，得到復(fù)合菌劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，在步驟i中，各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下: 枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏.0.3%、蛋白胨l%、NaC1 0.5%、余量為去離子水、pH7.4~7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150_200r/min、35-37°C、15 ~18h ； 康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速.100 ~150r/min、28-30°c、24 ~28h ； 植物乳桿菌進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏.0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、吐溫0.1%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.2~6.6，培養(yǎng)條件:35_37°C、24~28h、靜置培養(yǎng)； 圓褐固氮菌進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1%、磷酸二氫鉀0.2%。、氯化鈉0.2%。、硫酸鎂0.2%。、硫酸鈣0.2%。、碳酸鈣0.5%、余量為去離子水、pH7.0~7.2，轉(zhuǎn)速 150-200r/min、35-37°C、15 ~18h。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，在步驟ii中，各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下: 枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏.0.3%、蛋白胨I %、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.4~7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150~.200r/min、35-37°C、15 ~18h ； 康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速100~.150r/min、28 ~30 °C >24 ~28h ； 植物乳桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏.0.5%,檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2 %、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水，pH6.2~6.6，培養(yǎng)條件為:35_37°C、24~28h、靜置培養(yǎng)； 圓褐固氮菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1%、磷酸二氫鉀0.2%。、氯化鈉0.2%。、硫酸鎂0.2%。、硫酸鈣0.2%。、碳酸鈣0.5%、余量為去離子水、pH7.0~7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150~200r/min、35-37°C、15~18h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，在步驟iii中:固體培養(yǎng)基為木薯酒糟或木薯酒糟與豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸桿按5~8:1:1 (W/W)混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，在步驟iv中:固體擴(kuò)大培養(yǎng)基為木薯酒糟或木薯酒糟與豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸桿按5~8:1:1 (W/W)混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，所述豆柏的粗蛋白含量>43%。
8.權(quán)利要求1所述的復(fù)合菌劑制備有機(jī)肥的方法，其特征在于，包括以下步驟: a按添加比例1~5% (W/W)，將復(fù)合菌劑與植物類纖維原料混合均勻，得到發(fā)酵原料，其中，發(fā)酵原料的水分含量為50~60%、pH6.0~8.5，復(fù)合菌劑的活性成分包含枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌和圓褐固氮菌； b將發(fā)酵原料進(jìn)行堆肥發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵環(huán)境的溫度在30°C以下時(shí)，堆肥的時(shí)間為20~25天，當(dāng)發(fā)酵環(huán)境在溫度在30°C以上時(shí)，堆肥的時(shí)間為15~20天。在發(fā)酵過(guò)程中，每隔3~4天翻料一次； c將堆肥后的發(fā)酵原料于50°C下干燥至 水分含量低于30%，即得到有機(jī)肥。
9.權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述的復(fù)合菌劑在制備有機(jī)肥的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/065GK103898032SQ201410173158
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】唐波, 李舒宇, 仝志勇, 陳玉和 申請(qǐng)人:江蘇聯(lián)海生物科技有限公司