重組依賴的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種依賴DNA重組的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法，整個(gè)擴(kuò)增過程包括：1）設(shè)計(jì)4個(gè)可與靶序列結(jié)合的引物；2）通過具有鏈置換功能的DNA聚合酶的作用，產(chǎn)生單鏈DNA，該單鏈DNA的一端或兩端含有拓?fù)洚悩?gòu)酶或者位點(diǎn)特異性重組酶特異識(shí)別位點(diǎn)；3）由拓?fù)洚悩?gòu)酶或位點(diǎn)特異性重組酶介導(dǎo)該單鏈DNA的環(huán)化；4）環(huán)狀單鏈DNA的滾環(huán)擴(kuò)增。本發(fā)明具有許多優(yōu)點(diǎn)：比如可以簡化等溫?cái)U(kuò)增引物的設(shè)計(jì)、進(jìn)行大片段核酸的擴(kuò)增、可以在多個(gè)不同溫度下實(shí)現(xiàn)等溫核酸擴(kuò)增等。
【專利說明】重組依賴的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法，即重組依賴的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法(Recombination-Dependent Rolling Circle Amplification, RD-RCA)。
[0002]具體來說，重組依賴的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法(RD-RCA)又可以分成兩種，分別是:拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)環(huán)化的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法(Topoisomerase-mediated RollingCircle Amplification, Top-RCA)和位點(diǎn)特異性重組酶介導(dǎo)環(huán)化的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法(Site-Specific Recombinase mediated Rolling Circle Amplification, SSR-RCA)。這是因?yàn)門op-RCA和SSR-RCA在核酸環(huán)化的過程中，都需要進(jìn)行DNA的切割和重新連接，即都需要進(jìn)行DNA的重組，所以將Top-RCA和SSR-RCA統(tǒng)稱為重組依賴的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法(RD-RCA)0
【背景技術(shù)】
[0003]核酸的大量擴(kuò)增對(duì)于現(xiàn)代分子生物學(xué)具有重要的意義。目前使用最多核酸擴(kuò)增技術(shù)是1985年發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),即所謂的PCR技術(shù)【Science, 230，1350 - 1354，1985LPCR通過指數(shù)擴(kuò)增方式可以達(dá)到高靈敏檢測(cè)核酸的目的。另外，由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以回收，使 該技術(shù)在分子克隆中具有廣闊的用途。雖然PCR技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的核心之一，但是其也有明顯的缺點(diǎn):(I)由于PCR整個(gè)過程分成變性、退火和延伸三個(gè)步驟，而且三個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)，整個(gè)過程必須要有精確控制溫度的熱循環(huán)儀；(2)由于PCR擴(kuò)增過程只使用2個(gè)引物，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增等問題。
[0004]為了克服PCR的上述缺點(diǎn)，后來又開發(fā)了許多新的核酸擴(kuò)增技術(shù):比如整個(gè)擴(kuò)增過程只需使用一個(gè)溫度的各種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。由于整個(gè)擴(kuò)增過程只需一個(gè)溫度，這樣就無需使用精確控制溫度的熱循環(huán)儀，只需一個(gè)水浴鍋即可完成。甚至，有些方法由于可以在室溫進(jìn)行擴(kuò)增，這樣甚至連水浴鍋都不需要，就可以完成核酸的大量擴(kuò)增。此外，其中有些等溫?cái)U(kuò)增方法由于使用了多個(gè)引物或者通過連接酶共價(jià)連接等技術(shù)，使得擴(kuò)增的特異性大大提聞。
[0005]目前，主要的核酸擴(kuò)增技術(shù)主要如下幾種。
[0006]LCR (Ligase Chain Reaction,連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))【Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1991,88, 189-193】。LCR使用兩個(gè)靠近的寡核苷酸探針與同一DNA鏈雜交，而后通過連接酶將二者共價(jià)鏈接。由于只要一個(gè)核苷酸不同，兩個(gè)寡核苷酸探針就無法共價(jià)鏈接，該方法與PCR相比，其特異性非常高。但是該方法與PCR類似，需要在變性(如94°C )和鏈接(如65°C)兩個(gè)溫度之間反復(fù)循環(huán)，仍然需要使用精確控溫的熱循環(huán)儀。
[0007]SDA (Strand Displacement Amplification,鏈置換擴(kuò)增)【Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1992, 89,392-396】。SDA通過在引物中引入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，以及使用dNTP類似物的情況下，在雙鏈DNA的一條鏈上產(chǎn)生缺口(nick)，缺口產(chǎn)生的3’ -OH可以作為引物，在DNA聚合酶的作用下開始延伸，而將下游的舊鏈作為單鏈置換出來。因鏈延伸而合成的新鏈又可以在限制性內(nèi)切酶的作用下產(chǎn)生新的缺口，如此反復(fù)，就可以指數(shù)擴(kuò)增目的核酸。該方法一個(gè)重要的缺點(diǎn)是:在加入各種酶之前，必須對(duì)模板進(jìn)行熱變性，使得整個(gè)擴(kuò)增過程仍然需要兩個(gè)溫度，非真正意義的等溫基因擴(kuò)增。
[0008]NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, 核酸序列依賴的擴(kuò)增)或 TMA (Transcription Mediated Amplification,轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)【Nature, 1991，350，91-92】。NASBA在逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H、DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶的幫助下，通過一系列的反轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄的往復(fù)循環(huán)，達(dá)到擴(kuò)增核酸的目的。由于該方法必須在同一個(gè)系統(tǒng)中使用多種酶，反應(yīng)的體系和條件較難控制，成本也較高。而且，NASBA只能用于擴(kuò)增單鏈RNA。
[0009]SMART (Signal Mediated Amplification of RNA Technology,型號(hào)介導(dǎo)的 RNA擴(kuò)增技術(shù))【Nucleic Acids Res.，2001, 29，e54】。SMART通過兩個(gè)單鏈探針與目的核酸之間形成一個(gè)所謂的Three-Way Junction (3WJ)結(jié)構(gòu)，然后在DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶的作用下，可以產(chǎn)生大量的非目的核酸序列的RNA信號(hào)。由于該方法也必須有個(gè)熱變性的步驟，也非真正意義的等溫基因擴(kuò)增。而且SMART產(chǎn)生的RNA信號(hào)只能通過Enzyme LinkedOligosorbent Assay (ELOSA)或通過設(shè)計(jì)分子信標(biāo)時(shí)實(shí)進(jìn)行,相對(duì)比較麻煩或檢測(cè)費(fèi)用較
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[0010]RCA (Rolling Circle Amplification,滾環(huán)擴(kuò)增)【Nat.Genet.1998，19,225-232】。RCA借鑒了自然界中環(huán)狀DNA分子的復(fù)制過程。簡單的RCA使用一個(gè)引物與單鏈環(huán)狀DNA分子結(jié)合，而后用具有鏈置換活性的DNA聚合酶進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，這樣將使得環(huán)狀DNA分子得到線性的擴(kuò)增。復(fù)雜的RCA (Hyperbranched-RCA, HRCA)使用一對(duì)甚至多對(duì)引物進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，結(jié)果將使得環(huán)狀DNA分子得到指數(shù)式的擴(kuò)增，而且使用的引物對(duì)數(shù)越多，環(huán)狀DNA分子擴(kuò)增的就越快。RCA的關(guān)鍵是如何獲得單鏈環(huán)狀DNA分子，傳統(tǒng)的方法有:(I)利用長鏈Padlock探針，然后通過連接酶進(jìn)行鏈接環(huán)化【Nat.Genet.1998，19，225-232】;(2)利用單鏈DNA連接酶環(huán)化；(3)利用短核苷酸作為媒介介導(dǎo)環(huán)化【見中國專利申請(qǐng)CN201310211443.0】。
[0011]LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification,環(huán)介導(dǎo)的等溫基因擴(kuò)增)[Nucleic Acids Res.，2000，28，e63】。LAMP主要利用4個(gè)(甚至6個(gè))獨(dú)特設(shè)立的引物，通過產(chǎn)生大量的Stem-1oop結(jié)構(gòu)進(jìn)行核酸的擴(kuò)增。該方法也是一種高效快速的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。但是，該方法也有自己的缺點(diǎn):(1)引物設(shè)計(jì)較復(fù)雜；(2)該方法無法進(jìn)行長鏈DNA的擴(kuò)增；(3)該方法目前只能在60-65度的溫度進(jìn)行。
[0012]HDA (Helicase-Dependent Amplification,解旋酶依賴的擴(kuò)增)【ΕΜΒ0 reports,2004，5，795-800】。HDA使用解旋酶代替熱變性將雙鏈DNA轉(zhuǎn)變成單鏈DNA，產(chǎn)生的單鏈DNA可以與引物結(jié)合，在DNA聚合酶作用下又產(chǎn)生雙鏈DNA，如此往復(fù)，就可達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增核酸的目的。該方法徹底擺脫了核酸擴(kuò)增對(duì)精確控溫?zé)嵫h(huán)儀的依賴。HDA主要缺點(diǎn)是:擴(kuò)增效率不是特別的高。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的是引入兩種新的獲得單鏈環(huán)狀DNA的方法，而后利用可與該環(huán)狀DNA結(jié)合的引物進(jìn)行超分支滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，最終達(dá)到大量擴(kuò)增核酸的目的。該兩種方法分別命名為=Top-RCA和SSR-RCA，統(tǒng)稱為RD-RCA。下面分別介紹著兩種方法。[0014]方法一:Top-RCA。
[0015]Top-RCA通過將拓?fù)洚悩?gòu)酶技術(shù)引入到DNA的環(huán)化過程，具體來說是利用拓?fù)洚悩?gòu)酶同時(shí)具有的類似限制性內(nèi)切酶和連接酶的功能，完成單鏈DNA的環(huán)化，而后對(duì)環(huán)化的DNA進(jìn)行RCA擴(kuò)增。
[0016]Top-RCA整體來說可以分成以下四個(gè)步驟:第一步，設(shè)計(jì)4個(gè)與靶序列互補(bǔ)的引物，兩個(gè)為內(nèi)引物，兩個(gè)為外引物，其中一個(gè)內(nèi)引物的5’端含有拓?fù)洚悩?gòu)酶特異識(shí)別位點(diǎn)；第二步，通過具有鏈置換功能的DNA聚合酶的作用，產(chǎn)生單鏈DNA，該單鏈DNA的5’端含有拓?fù)洚悩?gòu)酶特異識(shí)別位點(diǎn)；第三步，由拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)該單鏈DNA的環(huán)化；第四步，環(huán)狀單鏈DNA的滾環(huán)擴(kuò)增。
[0017]拓?fù)洚悩?gòu)酶可以是牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I以及其他一切具有位點(diǎn)特異性識(shí)別功能的拓?fù)洚悩?gòu)酶。
[0018]下面以牛痕病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I (Vaccinia virus topoisomerase I)為例，說明如下四個(gè)關(guān)鍵步驟:引物的設(shè)計(jì)、單鏈DNA的產(chǎn)生、拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)該單鏈DNA的環(huán)化、環(huán)狀單鏈DNA的滾環(huán)擴(kuò)增。
[0019]第一步:引物的設(shè)計(jì):靶序列如果是5’到3’的方向，則從5’到3’分別設(shè)計(jì)F2, Fl, BI, B2共4條引物，其中F2, Fl與靶序列相同，而BI, B2與靶序列互補(bǔ)。BI引物的5，端添加有:(I)牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I特異識(shí)別的序列5’ -AAGG(G/A)-3’ ；(2) 5’ _AAGG(G/A)-3’序列的5’外側(cè)再添加一段短核苷酸序列(如選擇4個(gè)堿基)。而Fl引物的5’端則含有與BI引物的5’ -AAGG(G/A)-3,序列的5’外側(cè)再添加的短核苷酸序列互補(bǔ)的序列(如圖1所示)。 [0020]第二步:單鏈DNA的產(chǎn)生:首先，BI引物與靶序列互補(bǔ)，在DNA聚合酶的作用下延伸，而后由于外側(cè)B2弓丨物的延伸，產(chǎn)生初始單鏈DNA ;其次，F(xiàn)l弓丨物與該初始單鏈DNA結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下延伸，而后由于外側(cè)F2引物的延伸，產(chǎn)生次級(jí)單鏈DNA。該次級(jí)單鏈DNA具有如下特征:(1)3’端含有牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I特異識(shí)別的序列5’-(C/T)CCTT-3’以及其3’外側(cè)的短核苷酸序列；(2) 5’端含有與3’端最外側(cè)序列完全相同的序列(如圖1所示)。
[0021]第三步:拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)該單鏈DNA的環(huán)化:上述次級(jí)單鏈DNA在與BI引物結(jié)合后，其3’端會(huì)產(chǎn)生牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I特異識(shí)別的雙鏈5’ _(C/T)CCTT-3’位點(diǎn)，該牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I可在含有5’ -(C/T) CCTT-3’序列的DNA鏈上切割該單鏈DNA，然后該單鏈DNA的5’末端依賴與BI引物5’端互補(bǔ)的序列，與3’端靠近,最后再牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I的作用下，該單鏈DNA的5’末端與3’末端共價(jià)鏈接，從而獲得環(huán)狀單鏈DNA (如圖1所示)。
[0022]第四步:環(huán)狀單鏈DNA的滾環(huán)擴(kuò)增:已經(jīng)結(jié)合在該環(huán)狀單鏈DNA的BI引物，在DNA聚合酶的作用下，滾環(huán)產(chǎn)生串聯(lián)的線狀互補(bǔ)鏈，F(xiàn)l引物又可與該串聯(lián)互補(bǔ)鏈的多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，進(jìn)行超分支滾環(huán)擴(kuò)增。該過程又可產(chǎn)生與第二步產(chǎn)物相同的單鏈DNA，該單鏈DNA又可環(huán)化，該環(huán)化單鏈的DNA，又可進(jìn)行超分支滾環(huán)擴(kuò)增。如此往復(fù)，可大量擴(kuò)增靶序列(如圖2所示)。
[0023]方法二: SSR-RCA。
[0024]SSR-RCA通過將位點(diǎn)特異性重組技術(shù)引入到DNA的環(huán)化過程，位點(diǎn)特異性重組酶介導(dǎo)的DNA環(huán)化過程與拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的DNA環(huán)化過程非常相似。與Top-RCA不同的是，SSR-RCA在兩個(gè)內(nèi)引物(Fl引物和BI引物)的5’端都必須帶有可被位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別的特定位點(diǎn)，在獲得次級(jí)單鏈DNA后，由于該單鏈DNA的兩端都含有可被位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別的特定位點(diǎn)，該DNA可在位點(diǎn)特異性重組酶的介導(dǎo)下發(fā)生環(huán)化。其他過程與Top-RCA非常相似，不再贅述。
[0025]特異性重組酶可以是:(I)Tyr-Recombninase,如 Cre、Dre; Flp、KD、B2、B3 等；
(2)Tyr-1ntegrase,如 λ、HK022、HP1、SSV1 等；(3) Ser-Resolvase or Ser-1nvertase,如Tn3、y δ、ParA> Gin 等；(4) Ser-1ntegrase,如 PhiC31、Bxbl、R4 等；(5)其他一切具有位點(diǎn)特異性重組功能的酶。
[0026]RD-RCA 的優(yōu)點(diǎn)。
[0027]RD-RCA與傳統(tǒng)的RCA具有許多優(yōu)點(diǎn):(I)無需合成高成本長鏈Padlock探針；(2)無需另外加入單核苷酸片段作為媒介介導(dǎo)環(huán)化；(3)拓?fù)洚悩?gòu)酶的連接速度比普通的連接酶快得多，可以縮短單鏈DNA環(huán)化的時(shí)間，從而提高核酸的擴(kuò)增速度和效率，用于檢測(cè)靶核酸時(shí)可以提高檢測(cè)的靈敏度。
[0028]RD-RCA與LAMP相比也有自己的優(yōu)點(diǎn):(1)引物設(shè)計(jì)相對(duì)容易，無需設(shè)計(jì)復(fù)雜的LAMP特異引物；(2)環(huán)狀DNA單鏈的滾環(huán)擴(kuò)增，可以設(shè)計(jì)多對(duì)引物同時(shí)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，可以進(jìn)一步提高擴(kuò)增效率；(3)滾環(huán)擴(kuò)增可以擴(kuò)增相對(duì)大的靶核酸(可以達(dá)到10 kb)，而LAMP一般只能擴(kuò)增300 bp以下的靶核酸；(4)使用不同耐熱性的拓?fù)洚悩?gòu)酶或者位點(diǎn)特異重組酶，RD-RCA可以實(shí)現(xiàn)在不同溫度下的等溫?cái)U(kuò)增，比如25度，37度，60-65度。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1.拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)環(huán)化的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法(Top-RCA)的示意圖(1-6步): 第I步:BI引物與靶序列的結(jié)合；
第2步:BI引物在DNA聚合酶的作用下延伸；
第3步:B2引物在DNA聚合酶的作用下延伸，同時(shí)將BI引物延伸的鏈置換出來，產(chǎn)生初始單鏈DNA ；
第4步:Fl引物在DNA聚合酶的作用下延伸；
第5步:F2引物在DNA聚合酶的作用下延伸，同時(shí)將Fl引物延伸的鏈置換出來，產(chǎn)生次級(jí)單鏈DNA ；
第6步:次級(jí)單鏈DNA在拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用下，發(fā)生環(huán)化，從而獲得環(huán)狀單鏈DNA ；
圖2.拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)環(huán)化的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法(Top-RCA)的示意圖(7-10步):
第7步:BI引物與環(huán)狀單鏈DNA結(jié)合，同時(shí)在DNA聚合酶的作用下發(fā)生滾環(huán)擴(kuò)增；
第8步:滾環(huán)擴(kuò)增的繼續(xù)進(jìn)行；
第9步:滾環(huán)擴(kuò)增到一定階段，又會(huì)產(chǎn)生與第5步相同的次級(jí)單鏈DNA，該單鏈DNA再次發(fā)生環(huán)化以及進(jìn)行新一輪的滾環(huán)擴(kuò)增；
第10步:環(huán)狀單鏈DNA在BI引物和Fl引物以及DNA聚合酶的作用下進(jìn)行超分支滾環(huán)擴(kuò)增。
[0030]圖3.小鼠NQOl基因的Top-RCA擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M:DNA marker ；泳道1:小鼠NQOl基因的Top-RCA擴(kuò)增產(chǎn)物。【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1、下面小鼠 NQOl (NAD(P)H:quinone oxidoreductase I)基因作為祀核酸序列為例，說明拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)環(huán)化的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法(Top-RCA)的【具體實(shí)施方式】。
[0032]1.1小鼠NQOl基因部分序列如下(5，_3，): TCCAGAATAAGAAGACCTTGCTTTCTATCACCACTGGGGGTAGCGGCTCCATGTACTCTCTTCAGGGTGTCC
ACGGGGACATGAACGTCATTCTCTGGCCGATTCAGAGTGGCATCCTGCGTTTCTGTGGCTTCCAGGTCTTAGAACCTCAACTGGTTTACAGCATTGGCCACACTCCACCAGATGCCCGCATGCAGATCCTGGAAG (SEQ ID NO:1)。
[0033]1.2根據(jù)上述序列:設(shè)計(jì)如下4條Top-RCA引物，委托相關(guān)公司合成，引物序列如下(5，-3’):(1)引物 F2: CTTTCTATCACCACTGGGGG (SEQ ID NO: 2)；(2)引物 Fl: GGTGAAGGGTAGCGGCTCCATGTACTCTC (SEQ ID NO: 3) ；(3)引物 B1:ggrgGGAGTGTGGCCAATGCTG (SEQ ID NO: 4) ;(4)引物 B2: CTTCCAGGATCTGCATGCG (SEQ IDNO: 5)。
[0034]1.3具體的Top-RCA反應(yīng)體系:在25微升的反應(yīng)體系中，含有如下組分:50 mMTris-HCl, pH 7.5; 10 mM (NH4) 2S04; 10 mM MgCl2; 4mM DTT;引物 F2 和引物 B2 各 0.2μ M ;引物Fl和引物BI各1.6μ M ;牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I 400 fM;phi29 DNA聚合酶IUnit; dNTP I mM; Betaine I Μ;含小鼠 NQOl 基因的質(zhì)粒 I ng。
[0035]1.4反應(yīng)條件:37 °C，I小時(shí)。
[0036]1.5結(jié)果:將上述反 應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，可見階梯狀條帶(如圖3)。說明:使用Top-RCA方法，經(jīng)I小時(shí)反應(yīng)，可成功擴(kuò)增出靶核酸。
[0037]實(shí)施例2、下面以小鼠NQOl基因作為靶核酸序列為例，說明位點(diǎn)特異性重組酶介導(dǎo)環(huán)化的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法(SSR-RCA)的【具體實(shí)施方式】。
[0038]2.1小鼠NQOl基因的序列同實(shí)施例1。
[0039]2.2本實(shí)施例所用4條SSR-RCA引物與實(shí)施例1中的Top-RCA引物基本相同，只是Fl引物和BI引物的5’端各代有SSVl病毒整合酶的特異識(shí)別位點(diǎn)。引物序列如下(5，-3，):(1)引物 F2: 5’ -CTTTCTATCACCACTGGGGG-3’ (SEQ ID NO: 6) ;(2)引物 Fl: GGATGAGCACTGGCCTCCGGAGCCGGAGGTCTAGCGGCTCCATGTACTCTC (SEQ ID NO: 7) ;(3)引物 B1:TTCCGACCTCCGGCTCCGGAGGCGGAAAAGAGGAGT
GTGGCCAATGCTG (SEQ ID NO: 8) ;(4)引物 B2: CTTCCAGGATCTGCATGCG (SEQ ID NO:9)。
[0040]2.3 具體的 SSR-RCA 反應(yīng)體系:20 mM Tris-HCl pH8.8; 10 mM (NH4) 2S04; 10 mMKCl; 2 mM MgS04; 0.1% Triton? X-1OO;引物 F2 和引物 B2 各 0.2 μ M ;引物 Fl 和引物BI 各1.6μΜ ;SSV1 整合酶 600 fM; Bst DNA 聚合酶大片段 8 Unit; dNTP I mM; Betaine
IΜ;含小鼠NQOl基因的質(zhì)粒I ng。
[0041]2.4反應(yīng)條件:65 °C，I小時(shí)。
[0042]2.5結(jié)果:將上述反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，可見階梯狀條帶(與圖3相似，此處省略)。說明:使用SSR-RCA方法，經(jīng)I小時(shí)反應(yīng)，可成功擴(kuò)增出靶核酸。
【權(quán)利要求】
1.一種拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)環(huán)化的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法，其特征在于，整個(gè)擴(kuò)增過程包括以下步驟: (1)設(shè)計(jì)4個(gè)可與靶序列結(jié)合的引物，兩個(gè)為內(nèi)引物(BI和F1)，兩個(gè)為外引物(B2和F2)，其中一個(gè)內(nèi)引物的5’端含有拓?fù)洚悩?gòu)酶特異識(shí)別位點(diǎn)； (2)通過具有鏈置換功能的DNA聚合酶的作用，產(chǎn)生單鏈DNA，該單鏈DNA的一端含有拓?fù)洚悩?gòu)酶特異識(shí)別位點(diǎn)； (3)由拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)該單鏈DNA的環(huán)化； (4)環(huán)狀單鏈DNA的滾環(huán)擴(kuò)增。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的拓?fù)洚悩?gòu)酶為具有位點(diǎn)特異識(shí)別功能的拓?fù)洚悩?gòu)酶。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的拓?fù)洚悩?gòu)酶為牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶1
4.一種位點(diǎn)特異性重組酶介導(dǎo)環(huán)化的核酸滾環(huán)擴(kuò)增方法，其特征在于，整個(gè)擴(kuò)增過程包括以下步驟: (1)設(shè)計(jì)4個(gè)可與靶序列結(jié)合的引物，兩個(gè)為內(nèi)引物(BI和F1)，兩個(gè)為外引物(B2和F2)，其中兩個(gè)內(nèi)引物的5’端均含有位點(diǎn)特異性重組酶特異識(shí)別位點(diǎn)； (2)通過具有鏈置換功能的DNA聚合酶的作用，產(chǎn)生單鏈DNA，該單鏈DNA的兩端含有位點(diǎn)特異性重組酶特異識(shí)別位點(diǎn)； (3)由位點(diǎn)特異性重組酶介導(dǎo)該單鏈DNA的環(huán)化； (4)環(huán)狀單鏈DNA的滾環(huán)擴(kuò)增。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述的位點(diǎn)特異性重組酶可以是酪氨酸型重組酶、酪氨酸型整合酶、絲氨酸型反轉(zhuǎn)酶、絲氨酸型整合酶以及其他一切具有位點(diǎn)特異性重組功能的酶。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103966197SQ201410168939
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】俞國華 申請(qǐng)人:俞國華