基于滾環(huán)擴增技術(shù)的檢測左旋色氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于滾環(huán)擴增（rollingcircleamplification,RCA）技術(shù)的檢測左旋色氨酸（L-Trp）的方法。該方法中，左旋色氨酸結(jié)合于色氨酸阻遏蛋白（trprepressor,trpR），導致trpR發(fā)生構(gòu)象變化，并能夠特異性地結(jié)合在DNA雙鏈的識別序列上，從而抑制RCA的發(fā)生。通過檢測RCA的擴增效率，進而計算出L-Trp的濃度。該方法為檢測L-Trp提供了快速、簡便、定量的測量技術(shù)，具有重要的科學價值和廣闊的應用前景。
【專利說明】基于滾環(huán)擴增技術(shù)的檢測左旋色氨酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物化學、分子生物學、氨基酸成分確認的檢測方法，具體涉及一種基 于滾環(huán)擴增技術(shù)的檢測左旋色氨酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 左旋色氨酸（L-Trp)是構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種天然氨基酸之一，是人體的8種必需氨 基酸之一。作為重要的營養(yǎng)物質(zhì)，許多的食物（原料、半成品、產(chǎn)品等）、飲料和調(diào)味品中都 含有色氨酸。如何方便、快捷和準確的對色氨酸進行定量分析在食品檢測中具有重要意義。
[0003] 色氨酸在生物體內(nèi)除了合成蛋白質(zhì)外，其很多代謝產(chǎn)物具有重要的生物學功能及 意義。人體內(nèi)的色氨酸主要通過兩種途徑代謝：血清素途徑和犬尿氨酸途徑。在血清素代 謝途徑即5-羥色胺途徑中，首先色氨酸羥化酶催化色氨酸生成5-羥色氨酸，然后在脫羧酶 作用下5-羥色氨酸生成5-羥色胺。在犬尿氨酸途徑中，吲哚胺2, 3雙加氧酶（ID0)和色 氨酸2, 3雙加氧酶（TD0)催化色氨酸生成N-甲酰犬尿氨酸。代謝過程中產(chǎn)生的5羥色胺 是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)系統(tǒng)的眾多生理功能的調(diào)節(jié)。犬尿喹啉酸是一種興奮性 氨基酸受體的拮抗劑。色氨酸代謝途徑的異?？梢砸痼w液中色氨酸濃度的變化。因此， 對色氨酸濃度進行定量檢測具有重要的醫(yī)學診斷和治療價值。
[0004] 目前，最常用的檢測色氨酸的方法有HPLC法、質(zhì)譜法、層析法、紫外吸收法、熒光 光譜法等。但是，這些檢測分析方法均需要大型專業(yè)分析儀器設(shè)備，不僅需要專業(yè)人員來 進行操作，而且對設(shè)備維護和標準化的要求也比較高。不能制備方便的小型化試劑盒。目 前，可用于試劑盒檢測色氨酸的僅有ELISA法，該方法利用色氨酸抗體與色氨酸的結(jié)合檢 測色氨酸，雖然降低了大型專業(yè)儀器設(shè)備的要求，但是該檢測方法需要包被、鋪板、加樣、力口 抗體、顯色以及每一步之間的多次洗滌步驟，操作繁瑣，易于出現(xiàn)人為誤差。因此，開發(fā)新的 檢測方法，實現(xiàn)簡便、快捷、特異性高、性價比高的色氨酸檢測具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題而提出一種基于滾環(huán)擴增技術(shù)的全新的檢 測左旋色氨酸的方法，該方法原理是利用色氨酸操縱子的阻遏蛋白以及滾環(huán)擴增，通過該 方法可以實現(xiàn)左旋色氨酸的簡便、快捷、可定量的檢測。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] -種基于滾環(huán)擴增技術(shù)的檢測左旋色氨酸的方法，其特征在于包括下述步驟：待 檢測的左旋色氨酸與色氨酸阻遏蛋白結(jié)合，結(jié)合了左旋色氨酸的色氨酸阻遏蛋白通過識別 由環(huán)形單鏈模板DNA與線性單鏈引物DNA形成的雙鏈上的特異性識別序列，進而抑制DNA 聚合酶對線性單鏈引物DNA的延伸和擴增，滾環(huán)擴增反應的抑制程度與左旋色氨酸的濃度 成正比，通過制備左旋色氨酸濃度與滾環(huán)擴增抑制率的標準曲線，檢測待測樣品對滾環(huán)擴 增的抑制率，確定出待測樣品中的左旋色氨酸含量。
[0008] 所述的待檢測的左旋色氨酸可以是配制的L-Trp溶液，或是各種提取或制備的生 物樣本。
[0009]所述的色氨酸阻遏蛋白是細菌中調(diào)控色氨酸操縱子表達的阻遏蛋白（trpR)，該蛋 白能夠特異性地結(jié)合L-Trp，并發(fā)生構(gòu)象變化，提高了結(jié)合色氨酸操縱子識別序列的親和 力。
[0010] 所述的環(huán)形單鏈模板DNA，是作為擴增模板用于滾環(huán)擴增的單鏈DNA，并含有trpR 的識別序列。
[0011] 所述的線性單鏈引物DNA，是作為擴增引物用于滾環(huán)擴增的線性單鏈DNA，并含有 trpR的識別序列，該線性單鏈引物DNA序列與環(huán)形單鏈模板DNA的序列堿基具有序列互補 性。
[0012] 所述的DNA聚合酶是用于滾環(huán)擴增的DNA聚合酶，包括但不限于phi29DNA聚合 酶。
[0013] 與傳統(tǒng)的HPLC、質(zhì)譜、ELISA方法相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0014] 1、操作簡單、步驟簡便；
[0015] 2、不需專業(yè)的大型儀器設(shè)備。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是本發(fā)明的流程圖。
[0017] 圖2是本發(fā)明檢測L-Trp的原理示意圖。
[0018] 圖中，1、含有trpR識別序列的單鏈模板DNA :"(^-(^";2、含有七印1?識別序列的單 鏈引物DNA :"0N-P";3、DNA聚合酶；4、未結(jié)合L-Trp的trpR蛋白；5、結(jié)合L-Trp的trpR蛋 白；6、L_Trp〇
[0019] 圖3是本發(fā)明定量測定不同濃度L-Trp的實驗結(jié)果。（A)L-Trp不同濃度 時的RCA反應的熒光時間曲線；(B)L-Trp濃度和IRR的線性關(guān)系。Fluorescence intensity (FI):突光強度；Time :時間；Inhibited RCA rate (IRR) :RCA速率抑制率；L-Trp Concentration (ii M):左旋色氨酸濃度（微摩爾每升）。
[0020] 圖4是本發(fā)明特異性檢測L-Trp和其他19種氨基酸的實驗結(jié)果。該柱狀圖表示 相對抑制效率。Relative inhibited RCA rate (RIRR):相對RCA速率抑制率；L-Trp:左 旋色氨酸；L-Phe :左旋苯丙氨酸；L-Tyr :左旋酪氨酸；L-Ser :左旋絲氨酸；L-Thr :左旋蘇 氨酸；L-Met :左旋甲硫氨酸；L-Cys :左旋半胱氨酸；L-Gln :左旋谷氨酰胺；L-Asn :左旋天 冬酰胺；L-Pro :左旋脯氨酸；Gly :甘氨酸；L-Ala :左旋丙氨酸；L-Leu :左旋亮氨酸；L-Ile : 左旋異亮氨酸；L-Val :左旋纈氨酸；L-Glu :左旋谷氨酸；L-Asp :左旋天冬氨酸；L-Lys :左 旋賴氨酸；L-Arg :左旋精氨酸；L-His :左旋組氨酸。
[0021] 圖5是本發(fā)明定性鑒別L-Trp和六種L-Trp類似物的實驗結(jié)果。Relative inhibited RCA rate (RIRR):相對RCA速率抑制率；L-Trp:左旋色氨酸；D-Trp:右旋色氨 酸；L-Kynurenine :左旋犬尿氨酸；IAA :卩引哚乙酸；Melatonin :褪黑素；Tryptamine :色胺； 5-HT :5_羥色胺。
[0022] 圖6是本發(fā)明定量檢測LB培養(yǎng)液中的L-Trp含量的實驗結(jié)果。Inhibited RCA rate(IRR) :RCA速率抑制率。L-Trp Concentration (mM):左旋色氨酸濃度（毫摩爾每升）。 表示的各數(shù)據(jù)點構(gòu)建了標準曲線，▲表示的是待測樣品中的IRR值。

【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和實施例詳細描述本發(fā)明。
[0024] 本發(fā)明基于滾環(huán)擴增的左旋色氨酸檢測方法包括下述步驟：待檢測的左旋色氨酸 與色氨酸阻遏蛋白結(jié)合，增加色氨酸阻遏蛋白對環(huán)形模板中識別序列的親和力，結(jié)合在環(huán) 形單鏈模板DNA與線性單鏈引物DNA形成的DNA雙鏈上，進而抑制DNA聚合酶對環(huán)形單鏈 模板DNA和線性單鏈引物DNA的擴增。滾環(huán)擴增的抑制程度與左旋色氨酸的濃度成正比。 通過制備一系列左旋色氨酸濃度與滾環(huán)擴增抑制率的標準曲線，以及測定待測樣品對滾環(huán) 擴增的抑制率，可以分析出待測樣品中的左旋色氨酸濃度。該方法包括待檢測的左旋色氨 酸、色氨酸阻遏蛋白、環(huán)形單鏈模板DNA、線性單鏈引物DNA、DNA聚合酶以及滾環(huán)擴增所需 的酶反應體系。其中，待檢測的左旋色氨酸可以是配制的L-Trp溶液，或是提取或制備的生 物樣本。色氨酸阻遏蛋白是細菌中調(diào)控色氨酸操縱子表達的阻遏蛋白（trpR)。該蛋白可 以特異的結(jié)合L-Trp，進而發(fā)生變構(gòu)，增加對色氨酸操縱子中識別序列的親和力。環(huán)形單鏈 模板DNA，是作為擴增模板用于滾環(huán)擴增的環(huán)形單鏈DNA，并含有trpR的特異識別序列。線 性單鏈引物DNA，是作為擴增引物用于滾環(huán)擴增的線性單鏈DNA，并含有trpR的特異識別序 列，并且與環(huán)形單鏈模板DNA的序列堿基互補配對。DNA聚合酶是用于滾環(huán)擴增的DNA聚合 酶，包括但不限于phi29DNA聚合酶。
[0025] 實施例1
[0026] 本發(fā)明定量測定L-Trp濃度與RCA抑制率之間的關(guān)系（圖3)。具體步驟如下：
[0027] (1)環(huán)形模板的制備：
[0028] 配制 lOiil 的連接反應體系緩沖液（50mM Tris pH 8. 0, 10mM MgCl2, 5mM DIT 和 0? ImM ATP)，加入lOpmol線性單鏈模板DNA "0N-CT"、10pmol線性單鏈引物DNA "ON-P"和 175U T4DNA連接酶，16°C孵育1小時。DNA序列見表1。
[0029] (2)制備樣品：
[0030] 配制摩爾濃度為0、5、10、20、40、60和80iiM的左旋色氨酸水溶液。
[0031] (3)滾環(huán)擴增檢測：
[0032] 配制 100iil 的聚合反應體系緩沖液（50mM Tris pH 7. 5、10mM MgCl2、 10mM(NH4)2S04、4mM DTT、SYB Green II (1:10000)、3U phi29DNA 聚合酶、0.5pmol 連接反應 產(chǎn)物和trpR2. 5iiM)，分別加入不同量的L-Trp，使其終濃度為0、0.5、1、2、4、6、811|1，并進 行滾環(huán)擴增反應。
[0033] 利用多功能酶標儀（Microplate Reader，Infinite M200, Tecan, USA)檢測滾環(huán)擴 增反應的熒光信號。實驗溫度為37°C,激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長524nm。信號采集時間為 20微秒，每60秒采集一次信號，檢測時間為30分鐘。
[0034] (4)數(shù)據(jù)分析：
[0035] RCA的熒光時間曲線的斜率作為滾環(huán)擴增效率RR，滾環(huán)擴增抑制率IRR = RRQ-RRT,P?？瞻讓φ眨床缓彼釙r）的RR為R&，含有色氨酸的RR為RR T,P。滾環(huán)擴增 抑制率IRR與色氨酸濃度呈線性相關(guān)（圖3)。
[0036] 實施例2
[0037] 本發(fā)明特異性鑒別L-Trp和其他19種氨基酸（圖4)的具體步驟如下：
[0038] (1)環(huán)形模板的制備：
[0039] 配制 lOiil 的連接反應體系緩沖液（50mM Tris pH 8. 0, 10mM MgCl2, 5mM DIT 和 0? ImM ATP)，加入lOpmol線性單鏈模板DNA "0N-CT"、10pmol線性單鏈引物DNA "ON-P"和 175U T4DNA連接酶，16°C孵育1小時。DNA序列見表1。
[0040] (2)制備樣品：
[0041] 配制摩爾濃度為80 iiM的左旋色氨酸的水溶液，配制摩爾濃度為10mM的甘氨 酸（Gly)、左旋丙氨酸（L-Ala)、左旋異亮氨酸（L-Ile)、左旋亮氨酸（L-Leu)、左旋甲硫氨 酸（L-Met)、左旋纈氨酸（L-Val)、左旋精氨酸（L-Arg)、左旋組氨酸（L-His)、左旋賴氨酸 (L-Lys)、左旋天冬氨酸（L-Asp)、左旋谷氨酸（L-Glu)、左旋天冬酰胺（L-Asn)、左旋谷氨酰 胺（L-Gln)、左旋絲氨酸（L-Ser)、左旋蘇氨酸（L-Thr)、左旋苯丙氨酸（L-Phe)、左旋酪氨酸 (L-Tyr)、左旋半胱氨酸（L-Cys)、左旋脯氨酸（L-Pro)的水溶液。
[0042] (3)滾環(huán)擴增檢測：
[0043] 配制 lOOiil 的聚合反應體系緩沖液（50mM Tris pH 7. 5、10mM MgCl2、 10mM(NH4)2S04、4mM DTT、SYB Green II(1:10000)、3U phi29DNA 聚合酶、0.5pmol 連接反 應產(chǎn)物和trpR2. 5 ii M)，分別加入一種氨基酸進行滾環(huán)擴增反應。氨基酸的終濃度分別是 8iiM(L-Trp)和 1. OmM(其他氨基酸：Gly、L-Ala、L-Ile、L-Leu、L-Met、L-Val、L-Arg、L-His、 L_Lys、L_Asp、L_Asn、L_Glu、L_Gln、L_Ser、L_Thr、L_Phe、L_Tyr、L_Cys 和 L_Pro) 〇
[0044] 用多功能酶標儀（Microplate Reader，Infinite M200, Tecan, USA)檢測滾環(huán)擴增 反應的熒光信號。實驗溫度為37°C，激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長524nm。信號采集時間為20 微秒，每60秒采集一次信號，檢測時間為30分鐘。
[0045] (4)數(shù)據(jù)分析：
[0046] RCA的熒光時間曲線的斜率作為滾環(huán)擴增效率RR，滾環(huán)擴增抑制率IRR = RRQ-RRT,P，空白對照（即不含色氨酸時）的RR為R&，含有不同氨基酸的RR為RR aa。滾環(huán)擴 增相對抑制率 RIRR = (RRQ-RRaa) ARRQ-RRTrp)。（圖 4)。
[0047] 實施例3
[0048] 本發(fā)明定性鑒別L-Trp和六種L-Trp類似物（圖5)。具體步驟如下：
[0049] (1)環(huán)形模板的制備：
[0050] 配制 10ii 1 連接反應體系緩沖液（50mM Tris pH 8. 0, 10mM MgCl2, 5mM DIT 和 0? ImM ATP)，加入lOpmol線性單鏈模板DNA "0N-CT"、lOpmol線性單鏈引物DNA "0N-P"和 175U T4DNA連接酶，16°C孵育1小時。DNA序列見表1。
[0051] ⑵制備樣品：
[0052] 配制摩爾濃度為80 ii M的左旋色氨酸的水溶液，配制摩爾濃度為10mM的左旋犬尿 氨酸（L-Kynurenine)、卩引哚乙酸（IAA)、褪黑素（Melatonin)、5_輕色胺（5-HT)的水溶液， 和摩爾濃度為400iiM的色胺（Trytamine)和右旋色氨酸（D-Trp)的水溶液。
[0053] (3)滾環(huán)擴增檢測：
[0054] 配制 100iil 的聚合反應體系緩沖液（50mM Tris pH 7. 5、10mM MgCl2、 10mM(NH4)2S04、4mM DTT、SYB Green II(1:10000)、3U phi29DNA 聚合酶、0.5pmol 連接反 應產(chǎn)物和 trpR 2. 5 u M)，分別加入 L_Trp (終濃度 8 u M), L-Kynurenine、IAA、Melatonin、 5_HT (終濃度ImM)，Trytamine、D_Trp (終濃度40 u M)。進行滾環(huán)擴增。
[0055]利用多功能酶標儀（Microplate Reader，Infinite M200, Tecan, USA)檢測滾環(huán)擴 增反應的熒光信號。實驗溫度為37°C,激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長524nm。信號采集時間為 20微秒，每60秒采集一次信號，檢測時間為30分鐘。
[0056] (4)數(shù)據(jù)分析：
[0057] RCA的熒光時間曲線的斜率作為滾環(huán)擴增效率RR，滾環(huán)擴增抑制率IRR = RRcrRR#，空白對照（即不含色氨酸及類似物時）的RR為R&，含有不同氨基酸及類似物的 RR 為 RRaa。滾環(huán)擴增相對抑制率 RIRR= (RRQ-RRaaV(RRQ-RRTrp)。（圖 5)。
[0058] 實施例4
[0059] 本發(fā)明定量測定LB培養(yǎng)液中的L-Trp (圖6)。具體步驟如下：
[0060] (1)環(huán)形模板的制備：
[0061] 配制 lOiil 的連接反應體系緩沖液（50mM Tris pH 8. 0、10mM MgCl2、5mM DIT 和 0? ImM ATP)，加入lOpmol線性單鏈模板DNA "0N-CT"、10pmol線性單鏈引物DNA "ON-P"和 175U T4DNA連接酶，16°C孵育1小時。DNA序列見表1。
[0062] (2)制備樣品：
[0063] 配制摩爾濃度為0、0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8mM的左旋色氨酸的LB溶液。
[0064] (3)滾環(huán)擴增檢測：
[0065] 配制 100iil 的聚合反應體系緩沖液（50mM Tris pH 7. 5、10mM MgCl2、 10mM(NH4)2S04、4mM DTT、SYB Green II (1:10000)、3U phi29DNA 聚合酶、0.5pmol 連接反應 產(chǎn)物和trpR2. 5 y M)，分別加入含有不同濃度L-Trp的LB溶液（終濃度0、l、2、4、6、8iiM) 進行滾環(huán)擴增。
[0066] 用多功能酶標儀（Microplate Reader，Infinite M200, Tecan, USA)檢測滾環(huán)擴增 反應的熒光信號。實驗溫度為37°C，激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長524nm。信號采集時間為20 微秒，每60秒采集一次信號，檢測時間為30分鐘。
[0067] (4)數(shù)據(jù)分析：
[0068] RCA的熒光時間曲線的斜率作為滾環(huán)擴增效率RR，滾環(huán)擴增抑制率IRR= RRQ-RRT,P，空白對照（即不含色氨酸時）的RR為R&，含有不同濃度色氨酸的RR為RRT,P。利 用在不同濃度時滾環(huán)擴增抑制率IRR建立標準曲線。測量待測樣品的IRR值，利用標準曲 線推算出待測樣品中的L-Trp濃度為0. 59mM，與理論值0. 6mM高度一致（圖6)。
[0069] 表1.實施例中所用DNA序列
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于滾環(huán)擴增技術(shù)的檢測左旋色氨酸的方法，其特征在于包括下述步驟：待檢 測的左旋色氨酸與色氨酸阻遏蛋白結(jié)合，結(jié)合了左旋色氨酸的色氨酸阻遏蛋白通過識別并 結(jié)合由環(huán)形單鏈模板DNA與線性單鏈引物DNA形成的雙鏈上的特異性識別序列，進而抑制 DNA聚合酶對單鏈引物DNA的延伸和擴增，滾環(huán)擴增反應的抑制程度與左旋色氨酸的濃度 成正比，通過制備左旋色氨酸濃度與滾環(huán)擴增抑制率的標準曲線，檢測待測樣品對滾環(huán)擴 增的抑制率，從而確定出待測樣品中的左旋色氨酸含量。
2. 按照權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增技術(shù)的檢測左旋色氨酸的方法，其特征在于：所述的待檢測的左旋色氨酸是配制的左旋色氨酸溶液，或是各種提取或制備的生物樣本。
3. 按照權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增技術(shù)的檢測左旋色氨酸的方法，其特征在于：所述的色氨酸阻遏蛋白是細菌中調(diào)控色氨酸操縱子表達的阻遏蛋白trpR，該蛋白能夠特異 性地結(jié)合左旋色氨酸，并發(fā)生構(gòu)象變化，提高了結(jié)合色氨酸操縱子識別序列的親和力。
4. 按照權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增技術(shù)的檢測左旋色氨酸的方法，其特征在于：所述的環(huán)形單鏈模板DNA，是作為擴增模板用于滾環(huán)擴增的單鏈DNA，并含有色氨酸阻遏蛋 白的識別序列。
5. 按照權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增技術(shù)的檢測左旋色氨酸的方法，其特征在于：所述的線性單鏈引物DNA，是作為擴增引物用于滾環(huán)擴增的線性單鏈DNA，并含有色氨酸阻 遏蛋白的識別序列，該線性單鏈引物DNA序列與環(huán)形單鏈模板DNA的序列堿基具有序列互 補性。
6. 按照權(quán)利要求1所述的基于滾環(huán)擴增技術(shù)的檢測左旋色氨酸的方法，其特征在于：所述的DNA聚合酶是用于滾環(huán)擴增的DNA聚合酶,包括但不限于phi29 DNA聚合酶。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450926SQ201410789100
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月17日
【發(fā)明者】趙國杰, 關(guān)一夫 申請人:中國醫(yī)科大學