一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素b的方法
【專利摘要】一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，經(jīng)過前期發(fā)酵得到種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液在發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵過程中利用分子印跡膜對發(fā)酵液進行過濾，對過濾得到的物質(zhì)進行洗脫，收集洗脫液，最后進行濃縮得到埃博霉素B。本發(fā)明利用發(fā)酵罐進行發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B，并將分子印跡膜特異性吸附分離和發(fā)酵過程耦合，即在發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B的同時，及時將代謝產(chǎn)物埃博霉素B分離出，使發(fā)酵罐中埃博霉素B的濃度維持在較低水平，從而減少反饋抑制和產(chǎn)物毒性，提高發(fā)酵產(chǎn)量；同時利用分子印跡膜專一性分離埃博霉素B，而不分離其它成分來降低下游分離純化成本，有利于發(fā)酵液的后處理與產(chǎn)物的精制，在工業(yè)界有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]埃博霉素(epothilones)是微生物粘細菌纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)產(chǎn)生的一類16元大環(huán)內(nèi)酯次級代謝產(chǎn)物，具有微管蛋白聚合和微管穩(wěn)定的作用，具體作用機制為促進GTP依賴性微管蛋白聚合形成微管和穩(wěn)定微管；通過穩(wěn)定微管組裝過程抑制微管解聚，導(dǎo)致微管束排列異常，形成星狀體，從而抑制細胞形成正常的紡綞體，干擾腫瘤細胞的生長，甚至誘導(dǎo)其死亡。最近研究表明，天然埃博霉素的活性比紫杉醇強10到1000多倍，對紫杉醇及其它抗癌藥物有耐藥性的癌細胞也具有非常高的活性；水溶性比紫杉醇更好，注射口服均可，結(jié)構(gòu)簡單，且具有較強的耐藥性便于配制和使用，因此埃博霉素作為極具潛力的抗癌新藥，引起了全世界的化學家，生物學家及藥學家的極大興趣和研究熱情。目前已有一個埃博霉素藥物(BMS-247550，Ixabepilone，用于卵巢癌的治療)投放市場，另外至少還有六個埃博霉素藥物(ABJ-879，Patupilone, BMS-310705, K0S-862, K0S-1584 和ΖΚ-ΕΡ0)在進行臨床研究。埃博霉素有望成為取代紫杉醇的更為有效的抗腫瘤藥物?，F(xiàn)在發(fā)酵埃博霉素大都依靠在發(fā)酵液中添加大孔吸附樹脂來進行提取分離，然而樹脂對營養(yǎng)物質(zhì)的非特異性吸附，給發(fā)酵過程中的優(yōu)化和控制帶來新的難題。
[0003]分子印跡膜(MM)的研究最早開始于20世紀90年代，有報道通過光聚合的方法在溶劑中將3’，5’ -環(huán)腺苷酸分子印跡膜接枝到聚偏氟乙烯超濾膜表面，制備出了對3’，5’-環(huán)腺苷酸分子具有識別特性的分子印跡復(fù)合膜。這種將MIPs對特定印跡分子的專一識別性與膜分離的操作簡單、易于連續(xù)化、條件溫和等特點結(jié)合起來，制備對特定印跡分子具有高選擇性、大通量的分子印跡復(fù)合膜。分子印跡膜兼具有分子印跡和膜的特點，不需要研磨等制備過程，克服了膜技術(shù)中無法實現(xiàn)特定物質(zhì)選擇性分離的特點，實現(xiàn)了特異地將目標分子從混合物中分離純化的目的。它將膜分離的可連續(xù)化操作特點與分子印跡技術(shù)進行了結(jié)合，是最有應(yīng)用前景的一種膜分離技術(shù)。
[0004]目前還沒有分子印跡膜應(yīng)用于埃博霉素B的原位分離的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，所制備的埃博霉素B提高發(fā)酵產(chǎn)量；同時利用分子印跡膜專一分離埃博霉素，而不分離其它成分來降低下游分離純化成本。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007](I)前期發(fā)酵
[0008]菌種活化:將一支纖維堆囊菌接種到CNST培養(yǎng)基上活化，在培養(yǎng)基上放置滅菌的濾紙片，然后將放置有濾紙片的CNST培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中于28~32°C下培養(yǎng)5~7d；
[0009]種子培養(yǎng):用接種環(huán)從CNST培養(yǎng)基上刮取降解了濾紙片的黃色菌落，接種到含有種子培養(yǎng)基的種子瓶中，置于巡回式搖床上，于28~32°C下培養(yǎng)2~3d，得到種子培養(yǎng)液；
[0010](2)發(fā)酵培養(yǎng):按每IOOmL接種5~IOmL的比例將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28~32°C，攪拌轉(zhuǎn)速為100~150r/min，通氣量為2.5~
4.5L/min ；
[0011](3)分子印跡膜過濾除去埃博霉素B:待纖維堆囊菌在發(fā)酵罐中發(fā)酵72~120h后，將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液持續(xù)通入到裝有分子印跡膜的第一過濾裝置中，進行過濾以分離出埃博霉素B，除去埃博霉素B的發(fā)酵液返回到發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵；
[0012](4)補料:在發(fā)酵過程中，將滅菌的新鮮培養(yǎng)基加入到發(fā)酵罐中；
[0013](5)埃博霉素B洗脫分離:發(fā)酵96~144h之后，對第一分離裝置中分離出的埃博霉素B進行洗脫，并收集洗脫液，同時將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液通入到裝有分子印跡膜的第二過濾裝置中，進行過濾以分離出埃博霉素B，除去埃博霉素B的發(fā)酵液返回到發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵；發(fā)酵120~168h后對第二分離裝置中分離出的埃博霉素B進行洗脫，并收集洗脫液；整個發(fā)酵過程將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液 交替通入到第一分離裝置和第二分離裝置中，待發(fā)酵罐中的發(fā)酵液發(fā)酵15d后，停止發(fā)酵，最后合并收集的洗脫液，濃縮得到埃博霉素B。
[0014]所述CNST培養(yǎng)基的pH值為7.2~7.5，并于121°C下滅菌30min ；CNST培養(yǎng)基中KNO3 為 0.3 ~0.5g/L, Na2HPO4 為 0.25 ~0.30g/L,MgSO4.7Η20 為 1.0 ~1.5g/L, EDTA-Fe3+溶液為I~1.5mL/L，微量元素液濃度為I~1.5mL/L，瓊脂為20~25g/L。
[0015]所述種子培養(yǎng)基的pH值為7.2~7.5,并于115°C下滅菌30min ;種子培養(yǎng)基中土豆淀粉為7~9g/L、豆蛋白胨為2~3g/L、葡萄糖為2~3g/L、酵母粉為2~3g/L、MgSO4為 2 ~5g/L、CaCl2 為 2 ~5g/L、EDTA-Fe3+ 溶液濃度為 I ~1.5mL/L。
[0016]所述分子印跡膜的制備方法如下:
[0017]以聚砜中空纖維超濾膜為基膜，埃博霉素為模板分子，甲基丙烯酸甲酯為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，甲醇為溶劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，采用表面熱聚合方法制備分子印跡膜。
[0018]分子印跡膜具體的制備過程為:
[0019]將IOmmol的埃博霉素溶解于50mL甲醇-水的混合溶液中靜置30min，加入40mmol α -甲基丙烯酰胺、200mmol季戍四醇三丙烯酸酯,振蕩溶解IOmin,再加入60mg偶氮二異丁腈，超聲脫氣，反復(fù)沖入高純氮氣脫氧，保持惰性環(huán)境，以聚砜中空纖維超濾膜為基膜，在65°C下表面聚合48h，得到含模板分子的印跡膜；利用乙酸-甲醇-水的混合溶液做洗脫液，抽提24h，然后用體積比為4:1的甲醇、水的混合溶液反復(fù)洗脫掉模板分子，60°C恒溫真空干燥24h，得到埃博霉素B的分子印跡膜；其中，甲醇與水的混合溶液中，甲醇與水的體積比為1:4 ;乙酸-甲醇-水的混合溶液中乙酸、甲醇、水的體積比為1:20:10。
[0020]所述發(fā)酵液與滅菌的新鮮培養(yǎng)基的pH值均為7.2~7.5，并于115°C下滅菌30min ;發(fā)酵液中含有酵母粉20~50g/L、玉米淀粉5~10g/L、磷酸二氫鈉I~2g/L、磷酸氫二鈉 I ~2g/L、MgSO4.7H202 ~5g/L、FeSO4.7Η200.I ~0.5g/L、CaCl22 ~5g/L、MnCl20.1 ~0.5g/L 和葡萄糖 10 ~15g/L。
[0021]所述步驟(1)中的纖維堆囊菌為ATCC25532或ATCC25569 ;巡回式搖床的轉(zhuǎn)速為180 ~200r/min。
[0022]所述步驟(2)發(fā)酵罐的裝液量為60-75%。
[0023]所述步驟(3)中除去埃博霉素B的發(fā)酵液返回到發(fā)酵罐中的流速為I~5mL/min ；在發(fā)酵過程中新鮮的滅菌培養(yǎng)基以1.0~5.0mL/min的速度泵入發(fā)酵罐內(nèi)。
[0024]所述步驟(4)中洗脫均是先采用體積比為7:3~9:1甲醇與乙酸的混合物進行洗脫，再采用蒸餾水進行洗脫。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果:本發(fā)明利用發(fā)酵罐進行發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B，并將分子印跡膜特異性吸附分離和發(fā)酵過程耦合，即在發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B的同時，及時將代謝產(chǎn)物埃博霉素B分離出，使發(fā)酵罐中埃博霉素B的濃度維持在較低水平，從而減少反饋抑制和產(chǎn)物毒性，提高發(fā)酵產(chǎn)量；同時利用分子印跡膜專一性分離埃博霉素B，而不分離其它成分來降低下游分離純化成本，有利于發(fā)酵液的后處理與產(chǎn)物的精制，在工業(yè)界有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】[0026]圖1為本發(fā)明的流程示意圖；
[0027]其中，I為補料罐，2為攪拌器，3為發(fā)酵罐，4為pH計，5-1為第一閥門，5-2為第二閥門，5-3為第三閥門,6為螺動泵,7為流量計,8-1為第一過濾裝置,8-2為第二過濾裝置，9為洗脫溶劑罐，10為水罐，11為緩沖罐，12為蒸發(fā)器。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合附圖結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0029]本發(fā)明中涉及到一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的裝置，包括補料罐1、發(fā)酵罐3、第一過濾裝置8-1、第二過濾裝置8-2、洗脫溶劑罐9、水罐10、緩沖罐11和蒸發(fā)器12 ;其中，發(fā)酵罐3內(nèi)設(shè)置有攪拌器2，發(fā)酵罐3的入口與補料罐I連通，發(fā)酵罐3的出口經(jīng)第一閥門5-1、蠕動泵6、流量計7分別與第一過濾裝置8-1、第二過濾裝置8-2的入口相連通，第一過濾裝置8-1的入口處設(shè)置有第三閥門5-2，第二過濾裝置8-2的入口處設(shè)置有閥門5-3，第一過濾裝置8-1、第二過濾裝置8-2的出口與緩沖罐11的入口相連通，第一過濾裝置8-1、第二過濾裝置8-2的出口還與發(fā)酵罐3的入口相連通，緩沖罐11的出口與蒸發(fā)器12相連通，經(jīng)過蒸發(fā)器12的固形物即為埃博霉素B，經(jīng)過蒸發(fā)器12的溶劑可以回收利用。
[0030]發(fā)酵罐3內(nèi)設(shè)置有用于測定發(fā)酵液pH值的pH計4，發(fā)酵過程中通過向發(fā)酵罐3中添加KOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵罐中發(fā)酵液的pH值為7.2-7.5，并隨時用pH計進行監(jiān)測。洗脫溶劑罐9內(nèi)為體積比為9:1的甲醇與乙酸的混合物，水罐10中為蒸餾水，洗脫溶劑罐9、水罐10均與第一過濾裝置8-1、第二過濾裝置8-2相連通；第一過濾裝置8-1、第二過濾裝置8-2中均裝有分子印跡膜和膜過濾組件，本發(fā)明中的過濾膜組件SF-SA購自杭州賽菲膜分離技術(shù)有限公司。
[0031]本發(fā)明中分子印跡膜的制備過程為:以聚砜中空纖維超濾膜為基膜，埃博霉素為模板分子，甲基丙烯酸甲酯為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，甲醇為溶劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，采用表面熱聚合方法制備了埃博霉素印跡中空纖維復(fù)合膜即分子印跡膜。
[0032]分子印跡膜具體的制備過程為:將IOmmol的埃博霉素溶解于50mL甲醇-水的混合溶液中靜置30min,加入40mmol α -甲基丙烯酰胺、200mmol季戍四醇三丙烯酸酯,振蕩溶解lOmin，再加入60mg偶氮二異丁腈，超聲脫氣，反復(fù)沖入高純氮氣脫氧，保持惰性環(huán)境，以聚砜中空纖維超濾膜為基膜，在65°C下表面聚合48h，得到含模板分子的印跡膜；利用乙酸-甲醇-水的混合溶液做洗脫液，抽提24h，然后用體積比為4:1的甲醇、水的混合溶液反復(fù)洗脫掉模板分子，60°C恒溫真空干燥24h，得到埃博霉素B分子印跡膜；其中，甲醇與水的混合溶液中，甲醇與水的體積比為1:4 ;乙酸-甲醇-水的混合溶液中乙酸、甲醇、水的體積比為1:20 =IO0
[0033]下面通過具體實施例進行說明。
[0034]實施例1
[0035]參見圖1，一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，包括以下步驟:
[0036](I)前期發(fā)酵
[0037]菌種活化:將一支保藏的纖維堆囊菌ATCC25532接種到CNST培養(yǎng)基上活化，并在培養(yǎng)基上放置滅菌的濾紙片，然后將放置有濾紙片的CNST培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中于30°C培養(yǎng)7d ;其中，CNST培養(yǎng)基的pH值為7.2，并于121°C下滅菌30min ；CNST培養(yǎng)基中KNO3 為 0.5g/L，Na2HPO4 為 0.25g/L，MgSO4.7H20 為 lg/L，EDTA-Fe3+ 溶液濃度為 lmL/L，微量元素液濃度為lmL/L,瓊脂為20g/L。
[0038]種子培養(yǎng):用接種環(huán)從CNST培養(yǎng)基上刮取降解了濾紙片的黃色菌落，接種到含有種子培養(yǎng)基的種子瓶中，置于巡回式搖床(200r/min)上，在30°C下培養(yǎng)3d，得到種子培養(yǎng)液；其中，種子培養(yǎng)基PH值為7.5，并于115°C滅菌30min ;種子培養(yǎng)基中土豆淀粉為9g/L、豆蛋白胨為2g/L、葡萄糖為3g/L、酵母粉為2g/L、MgSO4為2g/L、CaCl2為5g/L、EDTA-Fe3+的濃度為lmL/L。
[0039](2)發(fā)酵培養(yǎng):按每IOOmL接種5mL的比例將種子培養(yǎng)液接種于5升的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為60%，培養(yǎng)溫度28°C，攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min ;通氣量4.5L/min。
[0040](3)分子印跡膜過濾除去埃博霉素B:纖維堆囊菌在發(fā)酵罐3中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)72h后，開啟第一閥門5-1、第二閥門5-2，通過控制蠕動泵6和流量計7使發(fā)酵罐3中的發(fā)酵液進入第一過濾裝置8-1中，過濾除去埃博霉素B，被除去埃博霉素B的發(fā)酵液以ImL/min的流速再返回到發(fā)酵罐3中。其中，發(fā)酵液的pH值為7.2，并于115°C下滅菌30min ;發(fā)酵液中含有酵母粉20g/L、玉米淀粉8g/L、磷酸二氫鈉2g/L、磷酸氫二鈉lg/L、MgS04 *7H205g/UFeSO4.7Η200.5g/L、CaCl22g/L、MnCl20.5g/L 和葡萄糖 10g/L。
[0041](4)補料:補料罐I裝有滅菌的新鮮培養(yǎng)基通過泵以1.0mL/min的速度泵入發(fā)酵罐3內(nèi)，為細胞的生長和代謝提供必要的營養(yǎng)。新鮮培養(yǎng)基的pH值為7.2，并于115°C下滅菌30min ;新鮮培養(yǎng)基中酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氫鈉lg/L、磷酸氫二鈉lg/L、MgSO4.7H202g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CaCl22g/L、MnCl20.lg/L 和葡萄糖 10g/L。
[0042](5)埃博霉素B洗脫分離:發(fā)酵96h時，關(guān)閉第二閥門5-2，開啟第三閥門5-3，使發(fā)酵液持續(xù)的通入到第二過濾裝置8-2中，同時對第一過濾裝置8-1中的埃博霉素B進行洗脫，并收集洗脫液。發(fā)酵120h時，關(guān)閉第三閥門5-3，開啟第二閥門5-2是發(fā)酵液持續(xù)的通入到第一過濾裝置8-1中，同時對第二過濾裝置8-2中的埃博霉素B進行洗脫，并收集洗脫液；每隔24h交替開啟關(guān)閉第一閥門5-2和第二閥門5-3，當?shù)谝贿^濾裝置中進行過濾時，第二過濾裝置中進行洗脫，當?shù)诙^濾裝置中進行過濾時，第一過濾裝置中進行洗脫，第一過濾裝置8-1和第二過濾裝置8-2中的過濾、洗脫交替進行；洗脫時，先采用體積比為9:1甲醇與乙酸的混合物進行洗脫，再采用蒸餾水進行洗脫，待發(fā)酵15d時，停止發(fā)酵；將每次收集的洗脫液合并于緩沖罐11中，然后轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)器12中進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(轉(zhuǎn)速為IOOr/min，溫度為40°C )回收洗脫溶劑，洗脫溶劑可以重復(fù)利用，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到的固形物為埃博霉素B。本實施例的埃博霉素B的產(chǎn)量為3mg/L.d。
[0043]實施例2
[0044]一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，包括以下步驟:
[0045](I)前期發(fā)酵:同實施例1。[0046](2)發(fā)酵培養(yǎng):按每IOOmL接種8mL的比例將種子培養(yǎng)液接種于5升的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為70%，培養(yǎng)溫度為30°C，攪拌轉(zhuǎn)速為130r/min ;通氣量為
2.5L/min。
[0047](3)分子印跡膜過濾除去埃博霉素B:纖維堆囊菌在發(fā)酵罐3中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)96h后，開啟第一閥門5-1、第二閥門5-2，通過蠕動泵6和流量計7使發(fā)酵罐3中的發(fā)酵液持續(xù)的進入第一過濾裝置8-1中，過濾除去埃博霉素B，被除去埃博霉素B的發(fā)酵液以3mL/min的流速再返回到發(fā)酵罐3中。其中，發(fā)酵液的pH值為7.2，并于115°C下滅菌30min ;發(fā)酵液中含有酵母粉35g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氫鈉lg/L、磷酸氫二鈉lg/L、MgSO4.7H204g/L、FeSO4.7Η200.3g/L、CaCl23g/L、MnCl20.3g/L 和葡萄糖 15g/L。
[0048](4)補料:同實施例1。
[0049](5)埃博霉素B洗脫分離:發(fā)酵120h時，關(guān)閉第二閥門5_2，開啟第三閥門5_3，使發(fā)酵液持續(xù)的進入到第二過濾裝置8-2中，同時對第一過濾裝置8-1中的埃博霉素B進行洗脫，并收集洗脫液。發(fā)酵144h時，關(guān)閉第三閥門5-3，開啟第二閥門5-2，使發(fā)酵液持續(xù)的進入到第一過濾裝置8-1中，同時對第二過濾裝置8-2中的埃博霉素B進行洗脫，并收集洗脫液；每隔24h交替開啟關(guān)閉第一閥門5-2和第二閥門5-3，當?shù)谝贿^濾裝置中進行過濾時，第二過濾裝置中進行洗脫，當?shù)诙^濾裝置中進行過濾時，對第一過濾裝置中的分離出的埃博霉素B進行洗脫，第一過濾裝置8-1和第二過濾裝置8-2中的過濾交替進行；洗脫時，先用體積比為9:1甲醇與乙酸的混合物進行洗脫，再用蒸餾水洗脫，待發(fā)酵15d時停止發(fā)酵；將每次收集的洗脫液合并于緩沖罐11中，然后轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)器12中進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(轉(zhuǎn)速為lOOr/min，溫度為40°C )回收洗脫溶劑，洗脫溶劑可以重復(fù)利用，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到的固形物為埃博霉素B。本實施例的埃博霉素B的產(chǎn)量為3.53mg/L.d。
[0050]實施例3
[0051]一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，包括以下步驟:
[0052](I)前期發(fā)酵:同實施例1。
[0053](2)發(fā)酵培養(yǎng):按每IOOmL接種IOmL的比例將種子培養(yǎng)液接種于5升的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為75%，培養(yǎng)溫度32°C，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，通氣量為3.5L/min。[0054](3)分子印跡膜過濾除去埃博霉素B:纖維堆囊菌在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)120h后，開啟第一閥門5-1、第二閥門5-2.通過蠕動泵6和流量計7使發(fā)酵罐3中的發(fā)酵液持續(xù)的進入第一過濾裝置8-1中，過濾除去埃博霉素B，被除去埃博霉素B的發(fā)酵液以5mL/min的流速再返回到發(fā)酵罐3中。其中，發(fā)酵液的pH值為7.5，并于115°C下滅菌30min ;發(fā)酵液中含有酵母粉50g/L、玉米淀粉10g/L、磷酸二氫鈉lg/L、磷酸氫二鈉2g/L、MgSO4.7H202g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CaCl25g/L、MnCl20.lg/L 和葡萄糖 12g/L。
[0055](4)補料:同實施例1。
[0056](5)埃博霉素B洗脫分離:發(fā)酵144h時，關(guān)閉第二閥門5_2，開啟第三閥門5_3，使發(fā)酵液持續(xù)的進入到第二過濾裝置8-2中，同時對第一過濾裝置8-1中的埃博霉素B進行洗脫，并收集洗脫液，發(fā)酵168h時，關(guān)閉第三閥門5-3，開啟第二閥門5-2，使發(fā)酵液持續(xù)的進入到第一過濾裝置8-1中，同時對第二過濾裝置8-2中的埃博霉素B進行洗脫，并收集洗脫液；每隔24h交替開啟關(guān)閉第一閥門5-2和第二閥門5-3，當?shù)谝贿^濾裝置中進行過濾時，第二過濾裝置中進行洗脫，當?shù)诙^濾裝置中進行過濾時，對第一過濾裝置中的分離出的埃博霉素B進行洗脫，第一過濾裝置8-1和第二過濾裝置8-2中的過濾交替進行；洗脫時，先用體積比為9:1甲醇與乙酸的混合物進行洗脫，再用蒸餾水洗脫，待發(fā)酵15d時停止發(fā)酵；將每次收集的洗脫液合并于緩沖罐11中，然后轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)器12中進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(轉(zhuǎn)速為lOOr/min，溫度為40°C)回收洗脫溶劑，洗脫溶劑可以重復(fù)利用，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到的固形物為埃博霉素B。本實施例獲得埃博霉素B的產(chǎn)量為3.13mg/L.d。[0057]實施例4
[0058]一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，包括以下步驟:
[0059](I)前期發(fā)酵
[0060]菌種活化:將一支保藏的纖維堆囊菌ATCC25569接種到CNST培養(yǎng)基上活化，并在培養(yǎng)基上放置滅菌的濾紙片，然后將放置有濾紙片的CNST培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中于28°C培養(yǎng)5d以降解濾紙片；其中，CNST培養(yǎng)基的pH值為7.4，并于121°C下滅菌30min ；CNST 培養(yǎng)基中 KNO3 為 0.3g/L, Na2HPO4 為 0.25g/L, MgSO4.7H20 為 1.5g/L, EDTA-Fe3+ 溶液濃度為1.3mL/L，微量元素溶液濃度為1.5mL/L，瓊脂為22g/L。
[0061]種子培養(yǎng):用接種環(huán)從CNST培養(yǎng)基上刮取降解了濾紙片的黃色菌落，接種到含有種子培養(yǎng)基的種子瓶中，置于巡回式搖床(180r/min)上，在28°C下培養(yǎng)3d，得到種子培養(yǎng)液；其中，種子培養(yǎng)基PH值為7.3，并于115°C滅菌30min ;種子培養(yǎng)基中土豆淀粉為7g/L、豆蛋白胨為3g/L、葡萄糖為2g/L、酵母粉為2g/L、MgSO4為3g/L、CaCl2為2g/L、EDTA-Fe3+的濃度為1.5mL/L。
[0062](2)發(fā)酵培養(yǎng):同實施例2 ；
[0063](3)分子印跡膜過濾除去埃博霉素B:同實施例1 ;
[0064](4)補料:補料罐I裝有滅菌的新鮮培養(yǎng)基通過泵以3.0mL/min的速度泵入發(fā)酵罐3內(nèi)，為細胞的生長和代謝提供必要的營養(yǎng)。新鮮培養(yǎng)基的pH值為7.2，并于115°C下滅菌30min ;新鮮培養(yǎng)基中酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氫鈉lg/L、磷酸氫二鈉lg/L、MgSO4.7H202g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CaCl22g/L、MnCl20.lg/L 和葡萄糖 10g/L。
[0065](5)埃博霉素B洗脫分離:同實施例1。
[0066]本實施例獲得埃博霉素B的產(chǎn)量為3.2mg/L.d。[0067]實施例5
[0068]一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，包括以下步驟:
[0069](I)前期發(fā)酵
[0070]菌種活化:將一支保藏的纖維堆囊菌ATCC25569接種到CNST培養(yǎng)基上活化，并在培養(yǎng)基上放置滅菌的濾紙片，然后將放置有濾紙片的CNST培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中于32°C培養(yǎng)6d以降解濾紙片；其中，CNST培養(yǎng)基的pH值為7.5，并于121°C下滅菌30min ；CNST 培養(yǎng)基中 KNO3 為 0.4g/L, Na2HPO4 為 0.30g/L, MgSO4.7H20 為 1.0g/L, FeCl3 為 1.2mL/L，微量元素液濃度為1.2mL/L，瓊脂為25g/L。
[0071]種子培養(yǎng):用接種環(huán)從CNST培養(yǎng)基上刮取降解了濾紙片的黃色菌落，接種到含有種子培養(yǎng)基的種子瓶中，置于巡回式搖床(190r/min)上，在32°C下培養(yǎng)2d，得到種子培養(yǎng)液；其中，種子培養(yǎng) 基PH值為7.2，并于115°C滅菌30min ;種子培養(yǎng)基中土豆淀粉為8g/L、豆蛋白胨為2g/L、葡萄糖為3g/L、酵母粉為3g/L、MgSO4為5g/L、CaCl2為4g/L、EDTA-Fe3+的濃度為1.2mL/L。
[0072](2)發(fā)酵培養(yǎng):同實施例3 ；
[0073](3)分子印跡膜過濾除去埃博霉素B:同實施例2 ；
[0074](4)補料:補料罐I裝有滅菌的新鮮培養(yǎng)基通過泵以5.0mL/min的速度泵入發(fā)酵罐3內(nèi)，為細胞的生長和代謝提供必要的營養(yǎng)。新鮮培養(yǎng)基的pH值為7.2，并于115°C下滅菌30min ;新鮮培養(yǎng)基中酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氫鈉lg/L、磷酸氫二鈉lg/L、MgSO4.7H202g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CaCl22g/L、MnCl20.lg/L 和葡萄糖 10g/L。
[0075](5)埃博霉素B洗脫分離:同實施例2。
[0076]本實施例獲得埃博霉素B的產(chǎn)量為3.33mg/L.d。
[0077]本發(fā)明主要針對發(fā)酵過程中由于產(chǎn)物埃博霉素B的增加，會對細胞產(chǎn)生毒性和反饋抑制，影響發(fā)酵過程中的菌體生長，提出分離發(fā)酵耦合的方法；且發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物中存在大量埃博霉素同系物，導(dǎo)致目標產(chǎn)物埃博霉素B分離比較困難，提出利用分子印記膜專一性分離本發(fā)明采用分子印跡膜對埃博霉素進行專一性吸附分離，并把它和發(fā)酵過程相耦合，降低產(chǎn)物抑制作用及對菌株的毒性，提高埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量，降低其生產(chǎn)成本。
【權(quán)利要求】
1.一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)前期發(fā)酵 菌種活化:將一支纖維堆囊菌接種到CNST培養(yǎng)基上活化，在培養(yǎng)基上放置滅菌的濾紙片，然后將放置有濾紙片的CNST培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中于28~32°C下培養(yǎng)5~7d ; 種子培養(yǎng):用接種環(huán)從CNST培養(yǎng)基上刮取降解了濾紙片的黃色菌落，接種到含有種子培養(yǎng)基的種子瓶中，置于巡回式搖床上，于28~32°C下培養(yǎng)2~3d，得到種子培養(yǎng)液； (2)發(fā)酵培養(yǎng):按每IOOmL接種5~IOmL的比例將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28~32°C，攪拌轉(zhuǎn)速為100~150r/min，通氣量為2.5~4.5L/min ； (3)分子印跡膜過濾除去埃博霉素B:待纖維堆囊菌在發(fā)酵罐中發(fā)酵72~120h后，將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液持續(xù)通入到裝有分子印跡膜的第一過濾裝置中，進行過濾以分離出埃博霉素B，除去埃博霉素B的發(fā)酵液返回到發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵； (4)補料:在發(fā)酵過程中，將滅菌的新鮮培養(yǎng)基加入到發(fā)酵罐中； (5)埃博霉素B洗脫分離:發(fā)酵96~144h之后，對第一分離裝置中分離出的埃博霉素B進行洗脫，并收集洗脫液，同時將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液通入到裝有分子印跡膜的第二過濾裝置中，進行過濾以分離出埃博霉素B，除去埃博霉素B的發(fā)酵液返回到發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵；發(fā)酵120~168h后對第二分離裝置中分離出的埃博霉素B進行洗脫，并收集洗脫液；整個發(fā)酵過程將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液交替通入到第一分離裝置和第二分離裝置中，待發(fā)酵罐中的發(fā)酵液發(fā)酵15d后，停止發(fā)酵，最后合并收集的洗脫液，濃縮得到埃博霉素B。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，其特征在于，所述CNST培養(yǎng)基的pH值為7.2~7.5，并于121°C下滅菌30min ;CNST培養(yǎng)基中KNO3 為 0.3 ~0.5g/L, Na2HPO4 為 0.25 ~0.30g/L,MgSO4.7Η20 為 1.0 ~1.5g/L, EDTA-Fe3+溶液為I~1.5mL/L，微量元素液濃度為I~1.5mL/L，瓊脂為20~25g/L。
3.如權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基的pH值為7.2~7.5，并于115°C下滅菌30min ;種子培養(yǎng)基中土豆淀粉為7~9g/L、豆蛋白胨為2~3g/L、葡萄糖為2~3g/L、酵母粉為2~3g/L、MgSO4為 2 ~5g/L、CaCl2 為 2 ~5g/L、EDTA-Fe3+ 溶液濃度為 I ~1.5mL/L。
4.如權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，其特征在于，所述分子印跡膜的制備方法如下: 以聚砜中空纖維超濾膜為基膜，埃博霉素為模板分子，甲基丙烯酸甲酯為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，甲醇為溶劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，采用表面熱聚合方法制備分子印跡膜。
5.如權(quán)利要求4所述的一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，其特征在于，分子印跡膜具體的制備過程為: 將IOmmol的埃博霉素溶解于50mL甲醇-水的混合溶液中靜置30min，加入40mmol α -甲基丙烯酰胺、200mmol季戍四醇三丙烯酸酯,振蕩溶解IOmin,再加入60mg偶氮二異丁腈，超聲脫氣，反復(fù)沖入高純氮氣脫氧，保持惰性環(huán)境，以聚砜中空纖維超濾膜為基膜，在65°C下表面聚合48h，得到含模板分子的印跡膜；利用乙酸-甲醇-水的混合溶液做洗脫液，抽提24h，然后用體積比為4:1的甲醇、水的混合溶液反復(fù)洗脫掉模板分子，60°C恒溫真空干燥24h，得到埃博霉素B的分子印跡膜；其中，甲醇與水的混合溶液中，甲醇與水的體積比為1:4 ;乙酸-甲醇-水的混合溶液中乙酸、甲醇、水的體積比為1:20:10。
6.如權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，其特征在于，所述發(fā)酵液與滅菌的新鮮培養(yǎng)基的PH值均為7.2~7.5，并于115°C下滅菌30m1n ;發(fā)酵液中含有酵母粉20~50g/L、玉米淀粉5~10g/L、磷酸二氫鈉1~2g/L、磷酸氫二鈉 1 ~2g/L、MgSO4.7H202 ~5g/L、FeSO4.7Η200.1 ~0.5g/L、CaCl22 ~5g/L、MnCl20.1 ~0.5g/L 和葡萄糖 10 ~15g/L。
7.如權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的纖維堆囊菌為ATCC25532或ATCC25569 ;巡回式搖床的轉(zhuǎn)速為180 ~200r/m1n。
8.如權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，其特征在于，所述步驟(2)發(fā)酵罐的裝液量為60-75%。
9.如權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，其特征在于，所述步驟(3)中除去埃博霉素B的發(fā)酵液返回到發(fā)酵罐中的流速為1~5mL/m1n ;在發(fā)酵過程中新鮮的滅菌培養(yǎng)基以1.0~5.0mL/m1n的速度泵入發(fā)酵罐內(nèi)。
10.如權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜分離發(fā)酵耦合制備埃博霉素B的方法，其特征在于，所述步驟(4)中洗脫均是先采用體積比為7:3~9:1甲醇與乙酸的混合物進行洗脫，再采用蒸餾水進行洗脫。
【文檔編號】C12P17/18GK103937852SQ201410166056
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】龔國利, 馬利云 申請人:陜西科技大學