一種基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法
【專利摘要】本發(fā)明適用于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法。該方法包括以下步驟：分別設(shè)計大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物，除不具內(nèi)含子的基因外，其他所述各基因的qPCR引物中的至少一條為跨內(nèi)含子基因的qPCR引物；提取、純化大鼠總RNA，并以此為模板合成cDNA，得到qPCR模板；將上述qPCR模板進行qPCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行qPCR分析，計算擴增效率。該方法不僅操作簡單快捷，而且定量準(zhǔn)確，可對硒蛋白基因組表達譜實現(xiàn)高效、準(zhǔn)確的分析。
【專利說明】—種基于qPCR分析大鼠砸蛋白基因表達譜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]硒蛋白是一組含有微量元素硒的特殊蛋白質(zhì)，硒蛋白大都是以硒代半胱氨酸為活性中心、具有氧化還原酶特性的蛋白質(zhì)，是微量元素硒在哺乳動物和人體內(nèi)發(fā)揮生理功能的主要載體。這些蛋白質(zhì)參與體內(nèi)自由基清除，維持氧化-還原穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)甲狀腺素合成，構(gòu)成精子結(jié)構(gòu)等。目如發(fā)現(xiàn)人體有25種砸蛋白基因，大鼠或小鼠體內(nèi)有24種砸蛋白基因。硒蛋白基因轉(zhuǎn)錄時，可因不同剪接方式生成更多的mRNA(轉(zhuǎn)錄變異體)和蛋白質(zhì)，個別基因有多個轉(zhuǎn)錄變異體(mRNA)。mRNA的多少反映著基因表達水平的高低。因此，分析硒蛋白基因組表達譜是研究硒生物學(xué)功能的重要內(nèi)容之一，而大鼠是一種良好的動物模型。
[0003]檢測基因mRNA豐度的方法在早期有Northern blot技術(shù)、核糖核酸酶保護實驗(Ribonuclease Protection Assay, RPA)和反轉(zhuǎn)錄 PCR(reversetranscription-PCR, RT-PCR)技術(shù)。以下將對3項技術(shù)作一介紹。
[0004]1.Northern blot:該方法的原理是通過檢測與目的基因mRNA特異結(jié)合的核酸探針信號強度來推算目的基因mRNA豐度。主要步驟概括為:RNA提取-凝膠電泳分離-轉(zhuǎn)印-探針雜交-顯影 ，實驗流程為:
[0005](I)從組織或細(xì)胞中提取總RNA(可選步驟:再經(jīng)過寡聚(dT)純化柱進行分離純化得到mRNA)；
[0006](2) RNA樣本經(jīng)過變性電泳(用含有甲醛的瓊脂糖凝膠，減少RNA的二級結(jié)構(gòu))后按分子量大小而被分離，對小分子的RNA或者microRNA —般采用聚丙烯酰胺變性膠電泳，電泳完成后的膠可經(jīng)過溴化乙錠(Ethidium bromide, EB)染色后在紫外下檢測RNA的質(zhì)量;
[0007](3)用轉(zhuǎn)印設(shè)備將凝膠上帶負(fù)電荷的RNA轉(zhuǎn)移到帶有正電荷的硝酸纖維膜或PVDF膜上(轉(zhuǎn)膜的緩沖液含甲酰胺，降低RNA樣本與后續(xù)探針雜交的退火溫度，減少因高溫條件降解RNA的風(fēng)險)；
[0008](4)帶有RNA分子的膜經(jīng)烘烤或紫外交聯(lián)加以固定；
[0009](5)將帶有放射性或特殊發(fā)光物標(biāo)記的探針與轉(zhuǎn)印膜雜交孵育；
[0010](6)可采用X膠片顯色或熒光成像儀檢測探針信號強度，以確定目的基因mRNA的豐都水平。
[0011]Northern blot的優(yōu)勢在于它可檢測目的片段的大小、是否具有可變剪切出現(xiàn)、可允許探針的部分不配對性，雜交過后的膜經(jīng)過一定的處理除去探針后還可保存很長時間再次雜交使用；但是，其同時存在以下不足:操作過程繁瑣、容易出現(xiàn)RNA降解、不太適合較多樣本的檢測。此外，該實驗中很多實驗用品如甲醛、EB、紫外燈等等對人體都有一定的傷害；Northern blot還存在靈敏度不高的缺點。[0012]2.RPA實驗:其原理類似于Northern blot。方法是:將標(biāo)記的特異RNA探針(32P或生物素)與待測的RNA樣品液相雜交，使RNA探針與目的基因mRNA發(fā)生特異性的堿基互補配對結(jié)合，形成雙鏈RNA ;用RNA酶(A或Tl)消化那些未與探針結(jié)合的單鏈RNA (即非目的基因RNA)形成寡核糖核酸，而待測目的基因與探針結(jié)合成的雙鏈RNA則免受RNA酶的消化；對放射性同位素32P標(biāo)記的探針，雜交雙鏈經(jīng)變性聚丙酰胺凝膠電泳后，用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測被保護的探針的信號；而對生物素標(biāo)記的探針，電泳后需類似Northern blot 一樣轉(zhuǎn)移至尼龍膜，再用鏈霉親和素_辣根過氧化物酶和化學(xué)發(fā)光底物與膜上探針?biāo)鶐У纳锼亟Y(jié)合，最后以X射線膠片或化學(xué)發(fā)光圖像分析儀檢測雜交信號。但是，RPA實驗具有上述Northern blot實驗類似的缺點.[0013]3.RT-PCR:該方法的原理是通過檢測PCR擴增目的產(chǎn)物的量反推PCR初始cDNA模板量(亦即mRNA豐度)。方法步驟為:提取樣本RNA(或進一步提取mRNA)后，用通用引物將全部RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，或用特異性引物將目的基因反轉(zhuǎn)錄成目的基因的cDNA。再用特異性引物對目的基因的cDNA進行適當(dāng)循環(huán)次數(shù)的PCR擴增。同時，需選擇在不同樣本中均穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因(看家基因)，如編碼肌動蛋白(beta-actin)的基因(Actb)、編碼甘油醒 _3_憐酸脫氧酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的基因(Gapdh)等，做同樣的RT-PCR實驗。將PCR擴增的產(chǎn)物通過凝膠電泳染色后，對目的基因的擴增產(chǎn)物進行光強度比較，參考內(nèi)參基因的對應(yīng)數(shù)據(jù)，從而比較不同樣本中目的基因初始PCR模板cDNA的量，亦即據(jù)此推斷目的基因mRNA的豐度。由于達不到準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)，RT-PCR檢測mRNA豐度只能達到半定量的程度。
[0014]RT-PCR實驗相對上述兩種方法而言，手工操作有所減少，但操作過程仍較麻煩、不太適合較多樣 本的檢測。同樣面臨著核酸染色劑(特別是EB)和紫外燈等對人體潛在的危害。此外，該方法需控制好適當(dāng)?shù)腜CR循環(huán)次數(shù)，以避免循環(huán)次數(shù)過多而掩蓋了初始cDNA模板量的差異。由于達不到準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)，RT-PCR檢測mRNA豐度的結(jié)果只能從趨勢上為研究者提供參考。
[0015]在此前采用qPCR檢測硒蛋白基因mRNA豐度的實驗中，往往只分析了部分硒蛋白基因，引物多采用軟件默認(rèn)參數(shù)設(shè)計，而未充分考慮引物跨內(nèi)含子的高要求，PCR擴增產(chǎn)物較長而影響反應(yīng)效率，且通常未能測試引物擴增效率。針對這些問題，我們以大鼠為動物模型，研制一種高效、安全分析全部硒蛋白基因mRNA豐度的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明的目的在于提供基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，旨在提供一種高效、準(zhǔn)確的大鼠硒蛋白基因表達譜的分析方法。
[0017]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，包括以下步驟:
[0018]分別設(shè)計大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物，除不具內(nèi)含子的基因外，其他所述各基因的qPCR引物中的至少一條為跨內(nèi)含子基因的qPCR引物；
[0019]提取、純化大鼠總RNA，并以此為模板合成cDNA，得到qPCR模板；
[0020]將上述qPCR模板進行qPCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行qPCR分析，計算擴增效率。[0021]本發(fā)明提供的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，通過設(shè)計特異的大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh的mRNA跨內(nèi)含子qPCR引物，縮短了 qPCR擴增產(chǎn)物的長度，不僅提高了鼠硒蛋白基因表達譜的分析效率，更重要的是降低了引物與非目的核酸序列配對的非特異性擴增，從而提高了硒蛋白基因表達譜分析的準(zhǔn)確度。此外，本發(fā)明提供的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，具有操作便捷，防污染能力高、毒害性風(fēng)險低的優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明實施例提供的qPCR引物跨內(nèi)含子基因的示意圖；[0023]圖2 是本發(fā)明實施例提供的 Gpxl、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx4_vl、Gpx4_v2 基因的 qPCR擴增曲線圖；
[0024]圖3是本發(fā)明實施例提供的Gpxl、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx4_vl、Gpx4_v2基因的熔解曲線圖；
[0025]圖4 是本發(fā)明實施例提供的 Txnrdl、Txnrd2、Txnrd3、Dio1、Dio2、Dio3 基因的 qPCR擴增曲線圖；
[0026]圖5是本發(fā)明實施例提供的Txnrdl、Txnrd2、Txnrd3、Diol> Dio2、Dio3基因的熔解曲線圖；
[0027]圖6 是本發(fā)明實施例提供的 Selh、Seim、Selo、Selt、Selv、Sepwl> Sepl5 基因的qPCR擴增曲線圖；
[0028]圖7是本發(fā)明實施例提供的Selh、Selm、Selo、Selt、Selv、S印wl、S印15基因的熔解曲線圖；
[0029]圖8 是本發(fā)明實施例提供的 Sel1、Selk、Sepnl> SeppU Selr、SepsU Sephs2 基因的qPCR擴增曲線圖；
[0030]圖9 是本發(fā)明實施例提供的 Sel1、Selk、Sepnl> SeppU Selr、SepsU Sephs2 基因的熔解曲線圖；
[0031]圖10是本發(fā)明實施例提供的2個內(nèi)參基因Actb、Gapdh的qPCR擴增曲線圖；
[0032]圖11是本發(fā)明實施例提供的2個內(nèi)參基因Actb、Gapdh的熔解曲線圖；
[0033]圖12是本發(fā)明實施例提供的內(nèi)參基因Gapdh、Actb在5組大鼠睪丸組織的qPCR擴增曲線圖；
[0034]圖13是本發(fā)明實施例提供的內(nèi)參基因Gapdh、Actb在5組大鼠睪丸組織的熔解曲線圖；
[0035]圖14是本發(fā)明實施例提供的五組大鼠睪丸組織中硒蛋白基因表達譜變化圖?！揪唧w實施方式】
[0036]為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0037]本發(fā)明實施例提供給了一種基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，包括以下步驟:[0038]SO1.分別設(shè)計大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物，除不具內(nèi)含子的基因外，其他所述各基因的qPCR引物中的至少一條為跨內(nèi)含子基因的qPCR引物；
[0039]S02.提取、純化大鼠總RNA，并以此為模板合成cDNA，得到qPCR模板；
[0040]S03.將上述qPCR模板進行qPCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行qPCR分析，計算擴增效率。
[0041]具體地，上述步驟SOl中，先對大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh共計28個基因的mRNA序列信息進行分析，并標(biāo)記mRNA序列各自的外顯子連接點，其中，大鼠全部硒蛋白基因包括24個硒蛋白基因和2個硒蛋白基因的轉(zhuǎn)錄變異體。本發(fā)明實施例中大鼠全部硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh的mRNA序列信息均可通過從美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)或其他在線生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫獲取。
[0042]大鼠全部硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh的DNA序列中，除基因Dio3和Sephs2不含內(nèi)含子片段外，其他各基因均含有不同的內(nèi)含子片段。為了避免內(nèi)含子序列的引入造成擴增DNA序列的情況發(fā)生，以及引物因擴增含有內(nèi)含子的DNA片段而被耗費降低效率的情況發(fā)生，提高qPCR擴增的準(zhǔn)確性，同時縮短qPCR擴增產(chǎn)物的長度從而提高qPCR擴增效率，本發(fā)明實施例中，除不具內(nèi)含子的基因外，其他所述大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh的qPCR引物中的至少一條設(shè)計為跨內(nèi)含子基因的qPCR引物，即所述qPCR引物的序列由某內(nèi)含子兩側(cè)的兩個外顯子部分序列連接構(gòu)成，所述qPCR引物跨內(nèi)含子基因的示意圖如附圖1所示。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，所述qPCR引物可根據(jù)實際設(shè)計和實驗效果的需要，其兩條qPCR引物-即上下游引物均為跨內(nèi)含子基因的引物。
[0043]為了最大程度地降低qPCR引物3’端與非目的核酸序列配對的非特異性擴增，所述跨內(nèi)含子基因的qPCR引物的跨越部位位于引物3’端(但不是最后一個堿基)。當(dāng)使用3’端通用引物進行mRNA反轉(zhuǎn)錄時，5’端可能不全，作為進一步優(yōu)選實施例，所述qPCR引物靠近各基因mRNA的3’端設(shè)計，即最好擴增最后兩個外顯子。
[0044]作為優(yōu)選實施例，本發(fā)明基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法中，所述大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物分別如SED ID NO:1至SED ID N0:56所示。所述qPCR引物的退火溫度60_65°C，長度約18_27bp，擴增片段長度80_200bp。設(shè)計得到的大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物，跨越硒蛋白基因內(nèi)含子，其長度長度和擴增片段均較短，有效提高了擴增效率，降低了引物與非目的核酸序列配對的非特異性擴增。大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh，共28個基因的名稱、qPCR引物、PCR產(chǎn)物長度及后續(xù)測試引物擴增效率的情況見下表1所示。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例也可采用其他跨內(nèi)含子設(shè)計的大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因 Actb、Gapdh 的 mRNA 的 qPCR 引物。
[0045]表1
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，包括以下步驟: 分別設(shè)計大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物，除不具內(nèi)含子的基因外，其他所述各基因的qPCR引物中的至少一條為跨內(nèi)含子基因的qPCR引物； 提取、純化大鼠總RNA，并以此為模板合成cDNA，得到qPCR模板； 將上述qPCR模板進行qPCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行qPCR分析，計算擴增效率。
2.如權(quán)利要求1所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，其特征在于，所述大鼠各硒蛋白基因以及內(nèi)參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物分別如SED ID NO:1至 SED ID NO:56 所示。
3.如權(quán)利要求1所述 的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，其特征在于，在所述設(shè)計大鼠各硒蛋白基因和內(nèi)參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物的步驟中，所述跨內(nèi)含子基因的qPCR引物的跨越部位位于引物3’端。
4.如權(quán)利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，其特征在于，在所述設(shè)計大鼠各硒蛋白基因和內(nèi)參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物的步驟中，所述qPCR引物靠近各基因mRNA的3’端。
5.如權(quán)利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，其特征在于，所述qPCR擴增產(chǎn)物長度為80~200bp。
6.如權(quán)利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，其特征在于，所述qPCR引物的長度為18_27bp。
7.如權(quán)利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，其特征在于，在所述純化大鼠總RNA的步驟中，采用加入DNase I酶去除殘留在RNA中的DNA。
8.如權(quán)利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，其特征在于，在所述提取、純化大鼠總RNA、并以此為模板合成cDNA的步驟中，還包括對提取的RNA進行純度測量處理，所述純度測量處理的要求為A26tZA28tl的比值> 1.9。
9.如權(quán)利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，其特征在于，在所述將qPCR模板進行qPCR擴增的步驟中，PCR擴增反應(yīng)體系為:
10.如權(quán)利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法，其特征在于，所述對擴增產(chǎn)物進行qPCR分析、計算擴增效率的方法為:將所述qPCR擴增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后做為標(biāo)準(zhǔn)品，以ddH20稀釋約10000倍后，再以10倍為倍數(shù)進行稀釋，最終選取稀釋倍數(shù)為IO4-1O8之間的5個稀釋度進行qPCR檢測，以定量循環(huán)數(shù)值為縱坐標(biāo)，稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，做擴增效率標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算擴增效率，其中，擴增效率計算公式為:E = ΙΟ—1/斜率。
【文檔編號】C12Q1/68GK103952484SQ201410165791
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】周繼昌, 劉小立, 朱玉梅, 鄭世杰, 龔春梅, 莫俊鑾, 許佳章 申請人:深圳市慢性病防治中心