南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法。該方法包括以下步驟：（1）南美白對蝦肝胰腺樣品總RNA的提?。唬?）以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；（3）熒光定量PCR擴增SOD和PO特異性序列：選用特異性引物，PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s、60℃退火15s、72℃延伸30s；（4）根據(jù)測得的SOD、PO及內(nèi)參基因β-actin的ct值，計算出SOD和PO的相對含量。本發(fā)明不僅可以同時測定多個免疫相關(guān)因子，而且引物特異性好，擴增效率高，提高了檢測的準確性。
【專利說明】南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水生動物免疫學(xué)分子檢測技術(shù)，具體涉及采用熒光定量PCR相對定量技術(shù)實時檢測南美白對奸超氧岐化酶(superoxide dismutase, SOD)和酹氧化酶(phenoloxidase, PO)基因的表達，為評估免疫增強劑、不同養(yǎng)殖條件對蝦免疫狀態(tài)的影響提供參考依據(jù)。
【背景技術(shù)】
[0002]南美白對蝦屬甲殼類動物，其免疫主要為非特異性免疫，包括體液免疫中的一些非特異性的酶或因子來進行的?？寡趸甘菬o脊椎動物機體非特異性免疫的一個重要方面，其中SOD是一種能夠催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為O2和H2O2的酶。SOD是抗氧化系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的酶，不僅具有清除體內(nèi)自由基的作用，而且在機體免疫調(diào)節(jié)中具有重要的作用。PO又被稱為酪氨酸酶，是一種含銅的氧化還原酶，在對蝦血細胞內(nèi)以酚氧化物酶原(Prophenoloxidase,proPO)的形式存在,是一條單一的多肽鏈，可被激活為60kD和62kD具PO活性的酶分子。PO能夠催化單酚羥化成二酚，再把二酚氧化成醌，醌在非酶促條件下形成反應(yīng)終產(chǎn)物黑色素。但反應(yīng)鏈的短暫中間產(chǎn)物擁有很高生物毒性，能夠抑制病原體胞外蛋白酶以及幾丁質(zhì)酶的活性，屬于一種酶級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，在南美白對蝦抵抗病原菌侵襲過程中具有重要作用。
[0003]目前大多檢測南美白對蝦免疫活性因子是通過采集血清，采用生化反應(yīng)方法檢測免疫相關(guān)酶。由于采集過程及檢測過程，酶活性極易受外界環(huán)境的影響，常導(dǎo)致檢測結(jié)果波動性很大，檢測的可 靠性受影響。酶的產(chǎn)生是通過基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯及后加工形成的，其轉(zhuǎn)錄水平的高低也可反映機體的免疫狀態(tài)。蝦肝胰腺是其血細胞產(chǎn)生的主要場所，肝胰腺組織免疫因子的轉(zhuǎn)錄表達也可作為評價機體免疫能力的指標之一。熒光定量PCR檢測技術(shù)已經(jīng)成為國際上檢測基因表達通用的方法，能對低豐度mRNA水平進行定量分析。設(shè)計特異性強的引物以及合適的反應(yīng)條件是利用熒光定量PCR檢測南美白對蝦免疫相關(guān)因子的關(guān)鍵。本發(fā)明設(shè)計的引物及反應(yīng)條件可同時用于檢測南美白對蝦肝胰腺SOD和PO的轉(zhuǎn)錄相對定量表達檢測，為今后準確分析其南美白對蝦免疫狀態(tài)提供了新的方法。該技術(shù)未見相關(guān)的專利報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，建立一種南美白對蝦肝胰腺免疫相關(guān)因子S0D、PO的熒光定量檢測方法，該方法特異性強，敏感性高，克服酶法測定易波動的問題，適合南美白對蝦免疫活力的評估。
[0005]本發(fā)明解決所述技術(shù)問題的方案為:一種南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟，
[0006](I)南美白對蝦肝胰腺樣品總RNA的提取:取南美白對蝦肝胰腺組織，用Trizol裂解液裂解，加入氯仿，離心得到總RNA，用DEPC水溶解RNA后測定RNA濃度和純度；
[0007](2)以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；
[0008](3)熒光定量PCR擴增SOD和PO特異性序列:PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s、60°C退火15s、72°C延伸30s ;所用特異性引物序列為:
【權(quán)利要求】
1.一種南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:包括以下步驟， (O南美白對蝦肝胰腺樣品總RNA的提取:取南美白對蝦肝胰腺組織，用Trizol裂解液裂解，加入氯仿，離心得到總RNA，用DEPC水溶解RNA后測定RNA濃度和純度； (2)以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA； (3)熒光定量PCR擴增SOD和PO特異性序列:PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s、60°C退火15s、72°C延伸30s ;所用特異性引物序列為:
2.如權(quán)利要求1所述的南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述南美白對蝦肝胰腺樣品總RNA提取的具體步驟為: 取南美白對蝦完整肝胰腺組織，加入500 μ L Trizol裂解液，研磨、勻漿后，取50 μ L勻漿液加入ImL Trizol繼續(xù)裂解，其余勻漿液置-80°C保存?zhèn)溆?；或?qū)⑼暾我认僭谝旱兴賰龊?，置于_80°C保存，使用時，將組織全部碾磨后，取IOOmg加入ImL Trizol裂解，其余組織粉末置_80°C保存?zhèn)溆茫? 取出的50 μ L勻漿液或IOOmg組織粉末裂解后，離心、吸取上清至新的離心管，加入.200yL氯仿后混勻；再次離心、吸取上清至新的離心管，加入等體積異丙醇后混勻、靜置；離心后棄上清，用500 μ LDEPC水配制的70%乙醇洗滌沉淀，棄去上清；用100 μ LDEPC水溶解RNA后測定RNA濃度和純度。
3.如權(quán)利要求1所述的南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的具體步驟為:
取 1μ g 總 RNA 為模板，加入 IOmM dNTPl μ L, 50mM Oligo (dT) 151 μ L，加 DEPC 水至總體積6.25 μ L, 65°C變性5min,冰上驟冷2min ； 上述反應(yīng)液加入5 XMMLV Buffer2 μ L，RNA酶抑制劑0.25 μ L7MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μ L，.1OmM 二硫蘇糖醇(DTT) I μ L，使最終反應(yīng)總體積達10 μ L ; 42°C反應(yīng)Ih后，65°C孵育lOmin，cDNA合成完畢，合成后的cDNA加入90 μ L無菌雙蒸水稀釋10倍，可立即用于后續(xù)PCR擴增，也可儲于-20°C備用。
4.如權(quán)利要求1所述的南美白對蝦肝胰腺超氧歧化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述熒光定量PCR擴增SOD和PO特異性序列的步驟為: 取合成的cDNA稀釋液5 μ L作為擴增模板，分別加入2 X sybgreen反應(yīng)預(yù)混液.12.5 μ L，5 μ M相應(yīng)的特異性上游和下游引物各0.5 μ L，加無菌雙蒸水6.5 μ L，使反應(yīng)總體系達25 μ L，置于熒光定 量PCR儀上進行PCR反應(yīng)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898224SQ201410141366
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】劉莉, 林鋒, 曹錚, 藺凌云, 葉雪平, 沈錦玉 申請人:劉莉