一種解脲脲原體14種血清型熒光定量pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種解脲脲原體14種血清型熒光定量PCR檢測方法，該方法14種血清型均采用20微升反應(yīng)體系，其中引物和探針的終濃度均為0.2微摩爾每升（uM），鎂離子終濃度染料法為2毫摩爾每升（mM），探針法為3mM，染料法加10微升qPCRMasterMix，探針法加10微升定量PCRSuperMix-UDG。本發(fā)明首次實現(xiàn)了用分子生物學方法對解脲脲原體的14種血清型進行分型，解決了傳統(tǒng)分型方法靈敏度低、重復(fù)性差的缺點，為今后在血清型水平進一步研究解脲脲原體的致病性打下了方法學基礎(chǔ)，可廣泛應(yīng)用于臨床。
【專利說明】—種解脲脲原體14種血清型熒光定量PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因領(lǐng)域，尤其涉及一種解脲脲原體14種血清型熒光定量PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum, Uu)是人類泌尿生殖道中一種常見的共生型微生物，但同時也和各種疾病有關(guān)，如非淋球菌性尿道炎(宮頸炎)、子宮內(nèi)膜炎、絨毛膜羊膜炎、新生兒腦膜炎、肺炎等。
[0003]Uu目前已知的有14種血清型，最近14種血清型又根據(jù)各種標準被劃分為兩個生物群，即微小脲原體(Ureaplasma parvum, UPA)包括血清型I, 3, 6, 14和解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum, UUR)包括其余 10 種血清型。
[0004]多年來人們一直在猜測Uu的致病性是否和某一特定的生物群或血清型有關(guān)，盡管很多研究報道UUR比UPA更具有致病性，但也有學者并不同意此觀點。所以Uu不同的致病性很可能和不同血清型有關(guān)而不是生物群，推測某一類疾病和特定血清型之間的相關(guān)性就需要一種準確、可行的分型方法。
[0005]傳統(tǒng)的基于抗體為基礎(chǔ)的分型方法包括生長/代謝抑制試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫印跡法等，抗血清不僅制備繁瑣、難以商品化，并且敏感性和穩(wěn)定性不夠，特別是當同一標本中含有兩種或以上血清型的時候，分辨能力和重復(fù)性都較差。
[0006]近年來以基因為基礎(chǔ)的Uu分型方法中，引物和探針的設(shè)計大多是針對多條帶抗原(multiple-band antigen MBA)基因5’末端序列的差異來來設(shè)計的，結(jié)合直接測序或限制性內(nèi)切酶分析，這些試驗?zāi)馨裊PA的4個血清型型分開，但只能把UUR的10個血清型分成若干個組。最近 Xiao 等(Xiao L, Glass J I, Paralanov V, et al.Detection andcharacterization of human Ureaplasma species and serovars by real-time PCR[J].JClin Microbiol, 2010，48 (8): 2715-2723.)用突光定量 PCR (Fluorescence QuantitativePCR, FQ-PCR)建立了一套Uu分群和分型的方法，成功把14種血清型分開且沒有交叉反應(yīng)。與傳統(tǒng)PCR相比熒光定量PCR法具有能定量、更靈敏、快速并不容易被污染的特點，在基因表達水平分析、病原體的定性、定量檢測等方面得到了廣泛的應(yīng)用。但由于Xiao等建立的方法檢測14種血清型的PCR擴增條件各不相同，使得在實際操作中非常耗時與繁瑣，因此很難在臨床中廣泛開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種解脲脲原體14種血清型熒光定量PCR檢測方法，本發(fā)明在結(jié)合文獻的基礎(chǔ)上通過對Uul4種血清型基因組進行分析，重新設(shè)計部分引物和探針并優(yōu)化實驗條件，建立一套準確而又切實可行的Uul4種血清型熒光定量PCR檢 [0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:[0009]蛋白酶K裂解液:取5.0ml KC1( lmol/L)、0.25ml MgCl2( lmol/L)、1.5ml Tris-HCl(lmol/L, PH8.0),Tween-20 (20%)混合即為裂解液，裂解液和蛋白酶K (200 μ g/ml)以50:2的體積混合后，即為DNA模板提取所用的蛋白酶K裂解液。
[0010]熒光定量PCR在羅氏Light Cycler480儀器上完成。其中血清型1、3、6、14、2、7、
8、9、13共9種用的是SYBR染料法，其余5種用Taqman探針法。
[0011]SYBR染料法和探針法所用的試劑盒分別為Promega GoTaq qPCR Master Mix和Invitrogen 定量 PCR SuperMix-UDG0
[0012]14種血清型均采用20微升反應(yīng)體系，其中引物和探針的終濃度均為0.2微摩爾每升(uM)，鎂離子終濃度染料法為2毫摩爾每升(mM)，探針法為3mM，染料法加10微升Promega GoTaq qPCR Master Mix,探針法加 10 微升 Invitrogen 定量 PCR SuperMix-UDG0
[0013]染料法PCR的條件都包括95°C 5分鐘的預(yù)溫，接著40個循環(huán)擴增，熔解曲線的條件為:95°C 5 秒(速率為 4.4°C/s)，65°C I 分鐘(速率為 2.2°C/s)，97°C (速率為(X11°C/s)連續(xù)采集信號模式。最 后儀器冷卻程序40°C 30秒。探針法的條件包括預(yù)溫50°C和95°C各2分鐘，接著擴增程序。最后儀器冷卻程序40°C 30秒。其中血清型5、8為了提高特異性用了降落(Touch Down) PCR0詳細PCR條件見下表。
[0014]
【權(quán)利要求】
1.一種解脲脲原體14種血清型熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，該方法包括: (1)14種血清型均釆用20微升反應(yīng)體系，其中引物和探針的終濃度均為0.2微摩爾每升(uM)，鎂離子終濃度染料法為2毫摩爾每升(mM)，探針法為3mM，染料法加10微升qPCRMaster Mix,探針法加10微升定量PCR SuperMix-UDG ;引物和標記探針如下: 血清型引物、探針序列(5’ 一3’)
【文檔編號】C12Q1/04GK103966315SQ201410113941
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】謝鑫友, 張鈞, 宋鐵軍, 黃珺 申請人:浙江大學