制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法、核酸擴(kuò)增方法及固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑和微芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法包括：將至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑的固相試劑溶解于含有核酸的液體中的步驟。
【專利說明】制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法、核酸擴(kuò)增方法及固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑和微芯片
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2013年3月29日提交的日本在先專利申請(qǐng)JP2013-075428的優(yōu)先權(quán)，將其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法、核酸擴(kuò)增方法、以及固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑和微芯片。更具體地，本發(fā)明涉及制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品所使用的固相試劑等。

【背景技術(shù)】
[0004]核酸擴(kuò)增反應(yīng)是重新合成與作為模板的核酸互補(bǔ)的核酸的反應(yīng)。為進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，除用作模板的核酸外，還需要多種試劑(例如，稱為引物的寡核苷酸、或酶)。為進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過將試劑和用作模板的核酸混合，來制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品。
[0005]在相關(guān)領(lǐng)域中，通過如下程序進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng):將上述試劑和模板核酸加入微管等并將它們混合在一起，然后將獲得的用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品轉(zhuǎn)移至合適的容器。此外，近年來開發(fā)了以例如微芯片的狀態(tài)存儲(chǔ)的試劑，其中，預(yù)先將核酸擴(kuò)增反應(yīng)所需的多種試劑混合。在一些情況下，將此類混合試劑收容于用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的基底材料中。
[0006]日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_N0.2011-160728公開了 “一種用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的微芯片，該微芯片包含:入口，液體通過該入口從外部進(jìn)入；多個(gè)孔，所述多個(gè)孔被設(shè)置成用作核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)位點(diǎn)；以及流道，從入口進(jìn)入的液體通過該流道供給至每個(gè)孔，其中，使反應(yīng)所需的多種試劑以指定順序?qū)盈B并固定于每個(gè)孔中”。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]在上述日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_N0.2011-160728中所公開的微芯片中，能夠通過將反應(yīng)所需的多種試劑固定于孔中，將含有模板核酸的樣品引入所述微芯片，從而簡(jiǎn)便地進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。此外，為更簡(jiǎn)便地進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，期望在制備樣品上作出進(jìn)一步改進(jìn)。
[0008]本發(fā)明中，有利地提供了制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法能夠簡(jiǎn)單且精確地進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，提供了制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法包括將至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑(binder)的固相試劑溶解于含有核酸的液體中的步驟。
[0010]在實(shí)施方式中，所述方法可包括在所述固相試劑的溶解步驟前，用含有離子表面活性劑的溶液對(duì)所述液體進(jìn)行稀釋的步驟。
[0011]在實(shí)施方式中，所述離子表面活性劑可為陰離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑可為十二烷基硫酸鈉。
[0012]在實(shí)施方式中，所述環(huán)糊精的濃度可高于或等于所述十二烷基硫酸鈉濃度的8倍。
[0013]在實(shí)施方式中，所述方法可包括在所述固相試劑的溶解步驟前，對(duì)所述液體的稀釋液進(jìn)行超聲處理的步驟；并可包括在所述固相試劑的溶解步驟前，對(duì)所述液體的稀釋液進(jìn)行加熱的步驟。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，提供了核酸擴(kuò)增方法，所述方法包括如下步驟:將至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑的固相試劑溶解于含有核酸的液體中的步驟；以及擴(kuò)增所述核酸的步驟。
[0015]在實(shí)施方式中，所述核酸的擴(kuò)增可在等溫下進(jìn)行。此外，所述核酸可以是核糖核酸，并且所述核酸擴(kuò)增方法可進(jìn)一步包括在擴(kuò)增所述核酸的步驟前，使用所述核糖核酸作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，提供了固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑。
[0017]在實(shí)施方式中，所述環(huán)糊精可包含羥丙基基團(tuán)。
[0018]在實(shí)施方式中，可將所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑混合于含有模板核酸鏈和離子表面活性劑的液體中。
[0019]在實(shí)施方式中，所述環(huán)糊精的濃度可高于或等于所述離子表面活性劑濃度的8倍。
[0020]在實(shí)施方式中，所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑可進(jìn)一步含有核糖核酸酶H。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，提供了包含固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑的微芯片，所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑。
[0022]在實(shí)施方式中，可在所述微芯片中設(shè)置的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)的每一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)中提供所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑；并且，所述反應(yīng)位點(diǎn)可通過流道與入口連通，液體通過所述入口進(jìn)入所述微芯片。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，提供了制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法能夠簡(jiǎn)單且精確地進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法的流程圖；
[0025]圖2A和圖2B是示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的微芯片結(jié)構(gòu)實(shí)例的示意圖。圖2A是俯視圖，圖2B是沿圖2A的IIB-1IB箭頭線的剖視圖；
[0026]圖3是替代附圖(drawing)的坐標(biāo)圖(graph),闡述了 SDS濃度與RNase A活性間的關(guān)系(實(shí)施例3)；
[0027]圖4是替代附圖的坐標(biāo)圖，闡述了 SDS濃度與血漿中含有的RNase A的活性間的關(guān)系(實(shí)施例4)；
[0028]圖5是替代附圖的坐標(biāo)圖，闡述了 SDS濃度與血漿中含有的RNase A的活性間的關(guān)系(實(shí)施例4)；
[0029]圖6是替代附圖的坐標(biāo)圖，闡述了在將細(xì)菌基因組用作模板核酸的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，SDS濃度與Tt值間的關(guān)系(實(shí)施例5)；
[0030]圖7是替代附圖的坐標(biāo)圖，闡述了核酸擴(kuò)增反應(yīng)中SDS濃度與環(huán)糊精濃度間的關(guān)系(實(shí)施例6);以及
[0031]圖8是替代附圖的坐標(biāo)圖，闡述了在伴有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，RNase H濃度與Tt值間的關(guān)系(實(shí)施例10)。

【具體實(shí)施方式】
[0032]以下描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。以下描述的實(shí)施方式僅用于闡述本發(fā)明的典型實(shí)施方式，它們并不限定本發(fā)明的范圍。
[0033]1.根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑
[0034]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑(以下也簡(jiǎn)稱為“固相試劑”)至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑。將按上述順序?qū)λ龉滔嘣噭┲邪拿糠N成分進(jìn)行描述。
[0035](I) DNA 聚合酶
[0036]固相試劑中所含的DNA聚合酶是在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中用于合成與模板核酸互補(bǔ)的核酸鏈的成分。可基于任意的核酸擴(kuò)增方法，適當(dāng)選擇DNA聚合酶。DNA聚合酶的實(shí)例包括Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。此外，其中可包括鏈置換型 DNA 聚合酶(chain substitut1n type DNA polymerase)。
[0037](2)環(huán)糊精
[0038]固相試劑中所含的環(huán)糊精是用于抑制所述固相試劑中所含的酶(例如DNA聚合酶)的活性降低的成分(參見實(shí)施例1)。將試劑制成預(yù)定的成分，隨后將預(yù)定的成分干燥或凍干，從而制得固相試劑。存在固相試劑中所含的酶失活的擔(dān)心，這依賴于此類制備過程或制備過程后的干燥狀態(tài)。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的固相試劑中，使用含有環(huán)糊精的試劑能夠抑制酶活性降低(參見實(shí)施例1)。
[0039]此外，環(huán)糊精還具有如下效果:抑制將要描述的含有核酸的液體中所含的離子表面活性劑對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的抑制作用(參見實(shí)施例2)。在含有核酸的液體含有離子表面活性劑的情況下，為獲得抑制效果，優(yōu)選固相試劑中環(huán)糊精的濃度高于或等于所述離子表面活性劑濃度的8倍(參見實(shí)施例6)。
[0040]環(huán)糊精的實(shí)例包括:α-環(huán)糊精(葡萄糖數(shù)目:6)、環(huán)糊精(葡萄糖數(shù)目:7)、Y-環(huán)糊精(葡萄糖數(shù)目:8)，及它們的衍生物。環(huán)糊精的衍生物是部分羥基基團(tuán)被OR基團(tuán)取代的分子。R的實(shí)例包括烴基基團(tuán)(如甲基和乙基)以及羥烷基基團(tuán)(如羥乙基基團(tuán)和羥丙基基團(tuán))。
[0041]在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的固相試劑中，優(yōu)選環(huán)糊精具有羥丙基基團(tuán)，例如羥丙基-β-環(huán)糊精(ΗΡβ⑶)。由于與β-環(huán)糊精相比，HP β⑶具有較高的水溶性，這易于將足夠量的環(huán)糊精加至固相試劑，以獲得關(guān)于將要描述的離子表面活性劑的效果。
[0042](3)粘合劑
[0043]固相試劑中所含的粘合劑是用于增強(qiáng)所述固相試劑的形狀穩(wěn)定性的成分。特別是在固相試劑中含有具有高吸濕性(hygroscopicity)的環(huán)糊精(如上述HP β⑶)的情況下，難以維持固相試劑的形狀。因此，可通過加入粘合劑維持根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的固相試劑的形狀。
[0044]只要所述成分不抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)，任何成分都可用作粘合劑。粘合劑的實(shí)例包括碳水化合物，如蔗糖、葡聚糖、海藻糖和FICOLL ;蛋白或肽，如膠原肽、明膠和BSA ；以及聚合化合物，如聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮。可這樣來制備含有粘合劑的固相試劑:將含有上述成分的粘合劑溶解液與含有DNA聚合酶等的液體型或凝膠型試劑混合，隨后將混合物干燥或凍干。
[0045](4)核糖核酸酶H
[0046]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的固相試劑可含有核糖核酸酶H (RNase H)。RNase H是特異性水解RNA/DNA雜合鏈中的RNA鏈的酶。含有核糖核酸酶H (RNase H)的固相試劑適用于伴有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，并適用于等溫核酸擴(kuò)增方法。與分兩步獨(dú)立進(jìn)行反應(yīng)的情況相比，伴有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)是可通過連續(xù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和核酸擴(kuò)增反應(yīng)的迅速檢測(cè)RNA的技術(shù)。
[0047]在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，使用RNA作為模板合成DNA，但合成的DNA處在與用作模板的RNA雜交的狀態(tài)。在等溫核酸擴(kuò)增方法中，由于沒有反應(yīng)溫度升高而使處在RNA/DNA雜合鏈狀態(tài)的核酸變性從而形成單鏈的過程，存在如下?lián)?使用合成的DNA作為模板的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的效率降低。通過將RNase H納入固相試劑，使與所述DNA雜交的RNA降解以使所述DNA成為單鏈，從而可更有效地進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。也存在逆轉(zhuǎn)錄酶具有RNase H活性的情況。然而，與僅使用逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性的情況相比，如果試劑含有RNase H，能夠更有效地進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)(參見實(shí)施例10)。
[0048]除上述成分外，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的固相試劑可含有核酸擴(kuò)增反應(yīng)所需的成分。固相試劑中含有的此類成分的實(shí)例包括dNTP或引物，以及用于穩(wěn)定核酸擴(kuò)增反應(yīng)的緩沖溶液中含有的成分。為了在完成RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的冋時(shí)抑制降解,可在固相試劑中納入針對(duì)RNase A的抑制劑。此外，上述RNase H的活性不受RNase A抑制劑干擾。因此，在使用用于伴有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的固相試劑的情況下，所述固相試劑優(yōu)選含有RNase A抑制劑和RNase H (參見實(shí)施例11)。
[0049]2.根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法
[0050]上述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑可適用于根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法(以下也簡(jiǎn)稱為“樣品制備方法”)。圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法的流程圖。所述樣品制備方法包括將固相試劑(固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑)溶解于含有核酸的液體中的步驟(溶解步驟Si)。此外，所述樣品制備方法可包括在所述固相試劑的溶解步驟(溶解步驟Si)前，用含有離子表面活性劑的溶液對(duì)所述液體進(jìn)行稀釋的步驟(稀釋步驟SO)。此外，除所述步驟外，本發(fā)明實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增方法可包括擴(kuò)增核酸的步驟(擴(kuò)增步驟S2)。對(duì)圖1中示出的各步驟進(jìn)行描述。
[0051](I)溶解步驟
[0052]在溶解步驟SI中，將上述固相試劑溶解于含有核酸的液體中，所述核酸用作核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的模板核酸。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的樣品制備方法中，所述核酸是來源于動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌、病毒等的核酸。所述核酸可以是任何單鏈核酸和雙鏈核酸，并可以是任何DNA和RNA。此外，對(duì)所述核酸的分子量也沒有特別的限定。樣品中含有的核酸可以是處于被細(xì)胞膜包圍的狀態(tài)，或是處于存在于顆粒中的狀態(tài)(如細(xì)菌細(xì)胞中存在的細(xì)菌基因組)，而非直接分散在所述樣品中。
[0053]在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的樣品制備方法中，可使用任何含有核酸的液體，只要所述液體含有上述核酸。然而，優(yōu)選核酸包含于此類溶劑中:所述液體中的核酸在該溶劑中幾乎不降解、并且該溶劑不含有抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)的成分。溶劑的實(shí)例包括多種緩沖溶液(如Tris緩沖溶液)和水。含有核酸的液體可以是生物體來源的樣品或其稀釋液。生物體來源的樣品的實(shí)例包括全血、血漿、血清、腦脊液、尿、精液、拭樣(swab)(具有鼻和喉的擦拭液(swabbed liquid)、鼻粘液、痰等的拭樣)、唾液等。此外,含有核酸的液體可以是凝膠型液體。
[0054]在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的樣品制備方法中，由于固相試劑含有DNA聚合酶，能夠通過將固相試劑溶解于含有核酸的液體中，來容易地制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品。此外，由于所述固相試劑中含有環(huán)糊精，抑制了固相試劑中含有的DNA聚合酶的活性降低。據(jù)此，在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的使用固相試劑的樣品制備方法中，能夠簡(jiǎn)單地制備樣品并精確地實(shí)施核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
[0055](2)稀釋步驟
[0056]在圖1示出的稀釋步驟SO中，將上述含有核酸的液體用含有離子表面活性劑的溶液稀釋。所述離子表面活性劑的實(shí)例包括陽離子表面活性劑(如十六烷基三甲基溴化銨和十四烷基三甲基溴化銨)和陰離子表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉(SDS)和脫氧膽酸鈉)。作為離子表面活性劑，優(yōu)選陰離子表面活性劑，更優(yōu)選SDS。
[0057]通過用含有離子表面活性劑的溶液稀釋含有核酸的液體，能夠抑制所述液體中含有的核酸降解酶的活性。特別是，在液體中含有的核酸是RNA的情況下，存在如下?lián)?RNA被RNase A降解，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)不能進(jìn)行。由于這一原因，優(yōu)選樣品制備方法在溶解步驟SI前包括稀釋步驟S0。此外，甚至在所述液體中含有的核酸是細(xì)菌基因組等的情況下，也優(yōu)選樣品制備方法包括稀釋步驟S0。這是由于在將要描述的加熱步驟中，可簡(jiǎn)單地進(jìn)行溶菌。
[0058]通過在含有核酸的液體中加入離子表面活性劑(如SDS)，能夠表現(xiàn)出上述效果。另一方面，存在如下?lián)?核酸擴(kuò)增反應(yīng)中離子表面活性劑抑制DNA聚合酶活性并使得核酸擴(kuò)增反應(yīng)的效率降低。由于根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的固相試劑中含有環(huán)糊精，因此即使在所述液體中含有離子表面活性劑的情況下，也能夠包合離子表面活性劑。據(jù)此，即使在所述液體含有離子表面活性劑的情況下，也難以抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)。為表現(xiàn)出通過環(huán)糊精而帶來的包合離子表面活性劑的效果，例如，優(yōu)選環(huán)糊精的濃度高于或等于十二烷基硫酸鈉濃度的8倍(參見實(shí)施例6)。
[0059]在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的樣品制備方法中，能夠使用離子表面活性劑以降低核酸降解或從細(xì)胞中提取出基因組(如細(xì)菌基因組)。此外，使用包含于固相試劑中的環(huán)糊精，即使在使用離子表面活性劑的情況下，也能夠有保證地進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。據(jù)此，使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的樣品制備方法，能夠簡(jiǎn)單并有保證地進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
[0060](3)擴(kuò)增步驟
[0061]在擴(kuò)增步驟S2中，使用在上述溶解步驟SI中將固相試劑溶解于其中的液體，對(duì)所述液體中含有的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。在擴(kuò)增步驟S2中，能夠從現(xiàn)有的核酸擴(kuò)增方法中適當(dāng)?shù)剡x擇方法來進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。核酸擴(kuò)增方法的實(shí)例包括實(shí)施溫度循環(huán)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)0此外，還可使用不帶溫度循環(huán)的多種等溫?cái)U(kuò)增方法。等溫?cái)U(kuò)增方法的實(shí)例包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法和轉(zhuǎn)錄-逆轉(zhuǎn)錄協(xié)同(TRC)方法。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增方法中，優(yōu)選等溫下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的等溫?cái)U(kuò)增方法，例如，作為等溫?cái)U(kuò)增方法優(yōu)選LAMP方法。
[0062](4)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟
[0063]在液體中含有的核酸是核糖核酸(RNA)的情況下，樣品制備方法可包括在擴(kuò)增步驟S2前使用核糖核酸作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和核酸擴(kuò)增反應(yīng)可獨(dú)立進(jìn)行或在一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)連續(xù)進(jìn)行，例如，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)或進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)_LAMP(RT-LAMP)。在連續(xù)進(jìn)行兩個(gè)反應(yīng)的情況下，優(yōu)選固相試劑除DNA聚合酶外還含有逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0064](5)超聲處理步驟
[0065]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的樣品制備方法可包括在溶解步驟SI前，對(duì)所述液體的稀釋液進(jìn)行超聲處理的步驟。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的樣品制備方法中，超聲處理步驟是任選的。然而，例如， 在作為模板的核酸在細(xì)胞中、類似于細(xì)菌基因組的情況下，通過進(jìn)行超聲處理能夠破壞細(xì)胞膜，從而容易將核酸釋放于稀釋液中。由于這一原因，與核酸留存在細(xì)胞中的情況相比，因?yàn)楹怂峥扇菀椎嘏c引物或試劑中的其它成分接觸，所以核酸擴(kuò)增反應(yīng)變得更有效。
[0066]在稀釋液的超聲處理步驟中，可使用現(xiàn)有的超聲波發(fā)生器。例如，可使用接觸式超聲波發(fā)生器，如喇ΠΛ型(horn-type)超聲勻楽;機(jī)。此外,也可使用不與樣品接觸的非接觸式超聲設(shè)備?？苫诔暡òl(fā)生器的性能或液體的性質(zhì)選擇合適的超聲波頻率。
[0067](6)加熱步驟
[0068]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的樣品制備方法可包括在溶解步驟SI前，對(duì)所述液體的稀釋液進(jìn)行加熱的步驟。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的樣品制備方法中，加熱步驟是任選的。然而，例如，在作為模板的核酸在細(xì)胞中、類似于細(xì)菌基因組的情況下，與超聲處理一樣，能夠通過加熱稀釋液進(jìn)行溶菌。此外，即使作為模板的核酸來自于病毒，例如，在病毒具有包膜的情況下，使用加熱步驟能夠?qū)⒉《净蚪M從包膜中分離并將病毒基因組擴(kuò)散于液體中。
[0069]進(jìn)行加熱步驟時(shí)，為更有保證地進(jìn)行上述細(xì)胞膜的溶解或包膜的分離，優(yōu)選在稀釋步驟SO中，將病毒基因組稀釋于含有離子表面活性劑(如SDS)的液體中。在加熱步驟中，稀釋液中SDS的濃度優(yōu)選高于或等于0.01%并低于1%，更優(yōu)選高于或等于0.1%并低于1%(參見實(shí)施例5)。3.微芯片
[0070]上述根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的固相試劑適用于使用微芯片的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。圖2A和圖2B闡明了根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的微芯片。圖2A是微芯片M的俯視圖，圖2B是沿圖2A的IIB-1IB箭頭線的剖視圖。微芯片M設(shè)置為具有三層基底層11、12和13 (參見圖2B)。此外，微芯片M提供有孔21-25作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)。在圖2A和圖2B中，與流道連通的五個(gè)孔分配有相同的附圖標(biāo)記。
[0071]微芯片M提供有固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑(固相試劑)R，所述固相試劑R至少含有RNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑。如圖2B所示，優(yōu)選在微芯片M中設(shè)置的多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)(孔23)中提供固相試劑R。此外，如圖2A所示，反應(yīng)位點(diǎn)(孔21-25)通過流道31-35與入口 4連通，液體通過所述入口 4進(jìn)入所述微芯片M。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的微芯片M的形狀不限于圖2A和圖2B所示的形狀，并可基于微芯片的應(yīng)用目的來合適地設(shè)計(jì)孔21-25的數(shù)量等。
[0072]根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的微芯片M在其內(nèi)部提供有固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑。由于這一原因，通過含有核酸的液體從外部進(jìn)入，能夠在微芯片中制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品。
[0073]此外，由于固相試劑R含有環(huán)糊精，因此能夠抑制固相試劑R中含有的DNA聚合酶的活性降低，并能夠在微芯片M中有保證地進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
[0074]此外，由于固相試劑R含有粘合劑，所述試劑的形狀得以穩(wěn)定。由于這一原因，即使在固相試劑R提供于多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)(孔21-25)中的情況下，固相試劑R的形狀是一致的。因此，能夠抑制關(guān)于由于液體進(jìn)入微芯片M造成固相試劑R溶解的變化。此外，相比于制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品并隨后使其進(jìn)入反應(yīng)位點(diǎn)的情況，通過在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)位點(diǎn)提供固相試劑R，能夠校準(zhǔn)(align)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的起始時(shí)間。據(jù)此，能夠精確改進(jìn)使用微芯片M進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
[0075]可如下設(shè)置本發(fā)明的實(shí)施方式:
[0076](I)制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法包括:將至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑的固相試劑溶解于含有核酸的液體中的步驟。
[0077](2)根據(jù)上述(I)的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法進(jìn)一步包括:在所述固相試劑的溶解步驟前，用含有離子表面活性劑的溶液對(duì)所述液體進(jìn)行稀釋的步驟。
[0078](3)根據(jù)上述(2)的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，其中，所述離子表面活性劑是陰離子表面活性劑。
[0079](4)根據(jù)上述(3)的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，其中，所述陰離子表面活性劑是十二烷基硫酸鈉。
[0080](5)根據(jù)上述(4)的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，其中，所述環(huán)糊精的濃度高于或等于所述十二烷基硫酸鈉濃度的8倍。
[0081](6)根據(jù)上述(2)- (5)的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法進(jìn)一步包括:在所述固相試劑的溶解步驟前，對(duì)所述液體的稀釋液進(jìn)行超聲處理的步驟。
[0082](7)根據(jù)上述(2)- (5)的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法進(jìn)一步包括:在所述固相試劑的溶解步驟前，對(duì)所述液體的稀釋液進(jìn)行加熱的步驟。
[0083](8) 一種核酸擴(kuò)增方法，所述方法包括如下步驟:將至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑的固相試劑溶解于含有核酸的液體中的步驟；以及擴(kuò)增所述核酸的步驟。
[0084](9)根據(jù)上述(8)的核酸擴(kuò)增方法，其中，所述核酸的擴(kuò)增在等溫下進(jìn)行。
[0085](10)根據(jù)上述(8)或(9)的核酸擴(kuò)增方法，其中，所述核酸是核糖核酸；以及，所述核酸擴(kuò)增方法進(jìn)一步包括在擴(kuò)增所述核酸的步驟前，使用核糖核酸作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟。
[0086](11) 一種固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑。
[0087](12)根據(jù)上述(11)的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，其中，所述環(huán)糊精包含羥丙基基團(tuán)。
[0088](13)根據(jù)上述(11)或(12)的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，其中，將所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑混合于含有模板核酸鏈和離子表面活性劑的液體中。
[0089](14)根據(jù)上述(12)和(13)的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，其中，所述環(huán)糊精的濃度高于或等于所述離子表面活性劑濃度的8倍。
[0090](15)根據(jù)上述(11)- (14)的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑進(jìn)一步含有核糖核酸酶H。
[0091]( 16) 一種微芯片,所述微芯片包含固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑。
[0092](17)根據(jù)上述(16)的微芯片，其中，在所述微芯片中設(shè)置的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)的每一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)中提供所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑；并且，所述反應(yīng)位點(diǎn)通過流道與入口連通，液體通過所述入口進(jìn)入所述微芯片。
[0093]實(shí)施例
[0094]實(shí)施例1
[0095]1.驗(yàn)證由環(huán)糊精所產(chǎn)生的對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑的活性的維持
[0096]對(duì)通過將環(huán)糊精加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑(含有DNA聚合酶)是否使得所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑的活性得以維持進(jìn)行了驗(yàn)證。
[0097]材料和方法
[0098]實(shí)施例1中使用的固相試劑的組成在表1中示出。作為環(huán)糊精，在實(shí)施例1中使用羥丙基-β-環(huán)糊精(HP β CD)。作為粘合劑，使用溶解有下列物質(zhì)中任何一種以上物質(zhì)的粘合劑溶液:蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、海藻糖、膠原肽、明膠、BSA、FICOLL和聚乙烯吡咯烷酮。將Bst DNA聚合酶Lg Frag (NEW ENGLAND B10LABS)用作DNA聚合酶。將含有HP β CD、粘合劑溶液和DNA聚合酶的試劑溶液混合，以達(dá)到表1中示出的預(yù)定濃度，將混合物分配至容器中并凍干，以獲得試驗(yàn)例1-6的固相試劑。此外，作為比較例1，還制備了不含有HP β CD及粘合劑的試劑溶液，并將其凍干。此外，作為比較例2，將不含有粘合劑的試劑溶液與HP β⑶混合，并將混合物凍干。
[0099]表1
[0100]
比較例試驗(yàn)例
_ I I Υ~ I I 2 I 3 I 4 I 5 I 6
HPpCD 濃度(w/v%) 0.0 3.6 —3.0 3.0 Τβ~ 3.6 3.6~X6~ 粘合劑濃度(w/v%) 0.0 0.0 _5.7 5.7 42~ 4.8 ~48~?6~
直到反應(yīng)開始的時(shí)間(％) 不反『+17 ~10 +36 ~m~ +60 +3 +--
固相狀態(tài)X |χ|ο|ο|ο|ο|ο|δ
[0101]將上述比較例1-2以及試驗(yàn)例1-6溶解于含有模板核酸的液體中，以使用LAMP方法進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。用與擴(kuò)增的核酸鏈特異性雜交的淬滅(quenching)探針對(duì)擴(kuò)增的核酸鏈進(jìn)行檢測(cè)。淬滅探針的末端結(jié)合有熒光物質(zhì)。在淬滅探針中，如果淬滅探針未與核酸鏈雜交，結(jié)合的熒光物質(zhì)發(fā)光；但是如果淬滅探針與核酸雜交，熒光物質(zhì)則淬滅。通過測(cè)定熒光的變化，能夠檢測(cè)核酸的擴(kuò)增。
[0102]結(jié)果
[0103]實(shí)施例1的結(jié)果在表1中示出。在表1中，直到反應(yīng)開始的時(shí)間表明直到核酸擴(kuò)增反應(yīng)開始的時(shí)間，對(duì)應(yīng)于Tt值(分鐘)，該時(shí)間基于熒光物質(zhì)的淬滅信號(hào)的拐點(diǎn)。關(guān)于直到確定使用LAMP方法進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)開始時(shí)所需的時(shí)間，將使用由相同組分構(gòu)成且未凍干的試劑進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的時(shí)間(Tt值)作為參比，將相對(duì)于該時(shí)間(Tt值)的增加以比例(％)表不。此外，固相狀態(tài)表明凍干后試劑的狀態(tài)?！癤”表明試劑并未成為固相狀態(tài)Δ ”表明試劑成為固相狀態(tài),“O”表明固相狀態(tài)長(zhǎng)時(shí)間維持。
[0104]如表1所示，在不含有ΗΡβ CD的比較例I中無法檢出核酸擴(kuò)增。另一方面，在含有HPiiCD的比較例2和試驗(yàn)例1-6中進(jìn)行了核酸擴(kuò)增，盡管與試劑未凍干的情況相比，直到核酸擴(kuò)增反應(yīng)開始花費(fèi)了較長(zhǎng)時(shí)間。結(jié)果證實(shí)，當(dāng)加入HPiiCD時(shí)，甚至凍干試劑中DNA聚合酶的活性也得到維持。
[0105]此外，如表1所示，在不含粘合劑的比較例2中，即使將試劑凍干仍難以使試劑成為固相。另一方面，證實(shí)了在含有粘合劑的試驗(yàn)例1-6中所述試劑成為了固相。上述結(jié)果證實(shí)，環(huán)糊精和粘合劑是維持試劑中含有的DNA聚合酶的活性以及將試劑維持在固相狀態(tài)所必需的。
[0106]實(shí)施例2
[0107]2.驗(yàn)證環(huán)糊精對(duì)加入了 SDS的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的效果
[0108]在實(shí)施例2中，對(duì)加入環(huán)糊精是否使SDS對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的影響降低進(jìn)行了驗(yàn)證。
[0109]材料和方法
[0110]實(shí)施例2中使用的試劑的組成在表2中示出。作為環(huán)糊精，在實(shí)施例2中使用羥丙基-β -環(huán)糊精(HP β⑶)。將以預(yù)定濃度加入有SDS和環(huán)糊精的RT-LAMP反應(yīng)試劑設(shè)置為試驗(yàn)例1-3。此外，作為比較例1，僅制備RT-LAMP反應(yīng)試劑。此外，將含有濃度為0.4%的SDS的LAMP反應(yīng)試劑設(shè)置為比較例2。分別將上述比較例1-2以及試驗(yàn)例1_3與模板核酸混合，以使用LAMP方法進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。使用類似于實(shí)施例1的淬滅探針對(duì)擴(kuò)增的核酸鏈進(jìn)行檢測(cè)。
[0111]結(jié)果
[0112]實(shí)施例2的結(jié)果在表2中示出。在表2中，直到反應(yīng)開始的時(shí)間如實(shí)施例1所述。如表2所示，證實(shí)了通過將SDS加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液，抑制了核酸擴(kuò)增反應(yīng)(比較例2)。此外，證實(shí)了即使將HP β CD以5倍于SDS的濃度加入，核酸擴(kuò)增反應(yīng)仍然受到抑制(試驗(yàn)例I)。另一方面，在含有10倍于SDS濃度的HP β⑶的試驗(yàn)例2以及含有15倍于SDS濃度的ΗΡβ⑶的試驗(yàn)例3中，證實(shí)了核酸的擴(kuò)增。上述結(jié)果證實(shí)了，即使在SDS的存在下，通過將環(huán)糊精以例如約10倍于SDS的濃度加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液，核酸擴(kuò)增反應(yīng)不被抑制。
[0113]表2

【權(quán)利要求】
1.一種制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法包括: 將至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑的固相試劑溶解于含有核酸的液體中的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法進(jìn)一步包括: 在所述固相試劑的溶解步驟前，用含有離子表面活性劑的溶液對(duì)所述液體進(jìn)行稀釋的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，其中，所述離子表面活性劑是陰離子表面活性劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，其中，所述陰離子表面活性劑是十二烷基硫酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，其中，所述環(huán)糊精的濃度高于或等于所述十二烷基硫酸鈉濃度的8倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法進(jìn)一步包括: 在所述固相試劑的溶解步驟前，對(duì)所述液體的稀釋液進(jìn)行超聲處理的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的樣品的方法，所述方法進(jìn)一步包括: 在所述固相試劑的溶解步驟前，對(duì)所述液體的稀釋液進(jìn)行加熱的步驟。
8.—種核酸擴(kuò)增方法，所述方法包括如下步驟: 將至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑的固相試劑溶解于含有核酸的液體中的步驟；以及 擴(kuò)增所述核酸的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，所述核酸的擴(kuò)增在等溫下進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸擴(kuò)增方法， 其中，所述核酸是核糖核酸；以及 其中，所述核酸擴(kuò)增方法進(jìn)一步包括在擴(kuò)增所述核酸的步驟前，使用所述核糖核酸作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟。
11.一種固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，其中，所述環(huán)糊精包含羥丙基基團(tuán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，其中，將所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑混合于含有模板核酸鏈和離子表面活性劑的液體中。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，其中，所述環(huán)糊精的濃度高于或等于所述離子表面活性劑濃度的8倍。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑進(jìn)一步含有核糖核酸酶H。
16.一種微芯片，所述微芯片包含固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑至少含有DNA聚合酶、環(huán)糊精和粘合劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的微芯片， 其中，在所述微芯片中設(shè)置的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)的每一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)中提供所述固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑；以及 其中，所述反應(yīng)位點(diǎn) 通過流道與入口連通，液體通過所述入口進(jìn)入所述微芯片。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104073485SQ201410108292
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月29日
【發(fā)明者】中村友彥, 町田賢三 申請(qǐng)人:索尼公司