核酸擴增反應用筒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供能夠簡便地進行核酸擴增反應的核酸擴增反應用筒。該核酸擴增反應用筒具備管、核酸擴增反應用容器和柱塞，上述管在內部依次具備由第1油構成的第1塞子、由與油混合時發(fā)生相分離且清洗結合有核酸的核酸結合性固相載體的第1清洗液構成的第2塞子、由第2油構成的第3塞子、由與油混合時發(fā)生相分離且將核酸從結合有核酸的核酸結合性固相載體溶出的溶出液構成的第4塞子、由第3油構成的第5塞子、由與油混合時發(fā)生相分離且進行核酸擴增反應的核酸擴增反應液構成的第6塞子、由第4油構成的第7塞子，上述核酸擴增反應用容器與管的第7塞子側連通且含有油，上述柱塞被安裝在管的第1塞子側的開口部，將液體從管的第7塞子側向核酸擴增反應用容器推出。
【專利說明】核酸擴增反應用筒

【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及核酸擴增反應用筒。

【背景技術】
[0002]由Boom等報告了使用二氧化硅粒子等核酸結合性固相載體和促溶劑從生物體材料中更簡便地提取核酸的方法(參照非專利文獻I)。包括該Boom等的方法在內的使用二氧化硅等核酸結合性固相載體和促溶劑使核酸吸附于載體并進行提取的方法主要由以下3個工序構成，即，(I)在促溶劑存在的條件下，使核酸吸附于核酸結合性固相載體的工序(吸附工序)、(2)為了除去非特異性結合的夾雜物和促溶劑，用清洗液清洗吸附有核酸的載體的工序(清洗工序)、以及(3)用水或低鹽濃度緩沖液使核酸從載體中溶出的工序(溶出工序)。
[0003]然而，最近，除以往的PCR (聚合酶鏈反應)裝置以外，還開發(fā)了容易控制加熱時間的熱循環(huán)裝置(參照專利文獻1)，但是迄今為止尚未開發(fā)能夠適合于這些裝置的筒等。
[0004]專利文獻
[0005]專利文獻1:日本特愿2010-268090
[0006]非專利文獻
[0007]非專利文獻I J.Clin.Microb1l.，vol.28Νο.3，p.495-503 (1990)


【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠簡便地進行核酸擴增反應的核酸擴增反應用筒。
[0009]本發(fā)明的一個實施方式的核酸擴增反應用筒具備管、核酸擴增反應用容器和柱塞，所述管在內部依次具備由第I油構成的第I塞子(plug)、由與油混合時發(fā)生相分離且清洗結合有核酸的核酸結合性固相載體的清洗液構成的第2塞子、由第2油構成的第3塞子、由與油混合時發(fā)生相分離且將上述核酸從結合有核酸的核酸結合性固相載體溶出的溶出液構成的第4塞子、由第3油構成的第5塞子、由與油混合時發(fā)生相分離且進行核酸擴增反應的核酸擴增反應液構成的第6塞子、由第4油構成的第7塞子，所述核酸擴增反應用容器與上述管的第7塞子側連通且含有油，所述柱塞被安裝在上述管的第I塞子側的開口部，將液體從管的第7塞子側向上述核酸擴增反應用容器推出。
[0010]本發(fā)明的另一個實施方式的核酸擴增反應用筒具備管、核酸擴增反應用容器和柱塞，所述管在內部依次具備由第I油構成的第I塞子、由與油混合時發(fā)生相分離且清洗結合有核酸的核酸結合性固相載體的清洗液構成的第2塞子、由第2油構成的第3塞子、由與油混合時發(fā)生相分離且將上述核酸從結合有核酸的核酸結合性固相載體溶出的溶出液構成的第4塞子、由第3油構成的第5塞子，所述核酸擴增反應用容器與上述管的第7塞子側連通且含有油，所述柱塞被安裝在上述管的第I塞子側的開口部，將液體從管的第7塞子側向上述核酸擴增反應用容器推出，上述核酸擴增反應用容器包含由與油混合時發(fā)生相分離且進行核酸擴增反應的核酸擴增反應液構成的液滴。
[0011]在上述任一個核酸擴增反應用筒中，上述核酸擴增反應液可以含有DNA聚合酶、dNTP和引物。上述核酸擴增反應用容器可以具有固定上述管的密封形成部和液滴移動的流路形成部。上述密封形成部可以具有收容從上述流路形成部溢出的油的油收容部?？梢赃M一步具備與上述管的第I塞子側連通且將上述核酸結合性固相載體導入上述管的罐。上述罐和上述管可以介由上述柱塞結合。
[0012]本發(fā)明的另一個實施方式的試劑盒具備上述任一種核酸擴增反應用筒和將上述核酸結合性固相載體導入上述管的罐。上述罐可以包含提取核酸的溶解液和上述核酸結合性固相載體。上述罐可以具有開口部，且在上述開口部可以具有能取下的蓋。上述罐的開口部可以按能夠安裝在上述管的第I塞子側的開口部的方式構成。
[0013]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供可簡便進行核酸擴增反應的核酸擴增反應用筒。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1:圖1A和圖1B是筒I的說明圖。
[0015]圖2:圖2A~圖2C是筒I的動作說明圖。
[0016]圖3:圖3A~圖3D是罐3的說明圖。
[0017]圖4:圖4是固定爪25和導板26與安裝部62的說明圖。
[0018]圖5:圖5A和圖5B是PCR容器30的周邊的說明圖。
[0019]圖6:圖6A是PCR 裝置100的內部結構的立體圖。圖6B是PCR裝置100的主要結構的側面圖。
[0020]圖7:圖7是PCR裝置100的框圖。
[0021]圖8:圖8A是旋轉體61的說明圖。圖8B是旋轉體61的安裝部62中安裝有筒I的狀態(tài)的說明圖。
[0022]圖9:圖9A~圖9D是安裝筒I時的PCR裝置100的狀態(tài)的說明圖。
[0023]圖10:圖10是使磁鐵71向下方移動時的磁珠7的行為的示意圖。
[0024]圖11:圖1lA~圖1lC是核酸溶出處理的說明圖。
[0025]圖12:圖12是搖動磁鐵71時的磁珠7的行為的示意圖。
[0026]圖13:圖13是表示有無磁鐵71搖動的表。
[0027]圖14:圖14A~圖14C是液滴形成處理的說明圖。
[0028]圖15:圖15A和圖15B是熱循環(huán)處理的說明圖。
[0029]圖16:圖16是表示在本發(fā)明的一個實施例中使用的核酸提取用試劑盒及其組裝后的裝置的圖。
[0030]圖17:圖17是表示本發(fā)明的一個實施例中的實時PCR的結果的圖。

【具體實施方式】
[0031]以下，對本發(fā)明的實施方式進行詳細說明。應予說明，本領域技術人員根據(jù)本說明書的記載可理解本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點及其構思，本領域技術人員由本說明書的記載能夠容易地再現(xiàn)本發(fā)明。以下記載的發(fā)明的實施方式表示顯示本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，是為了例示或說明而示出的，但本發(fā)明并不限定于此。本領域技術人員清楚在本說明書中公開的本發(fā)明的意圖和范圍內，基于本說明書的記載，可進行各種改變和修飾。
[0032]首先，對被安裝于PCR裝置100的筒進行說明后，對本實施方式的PCR裝置100的構成.動作進行說明。
[0033]筒
[0034]圖1A和圖1B是筒I的說明圖。圖2A~圖2C是筒I的動作說明圖。圖2A是筒I的初始狀態(tài)的說明圖。圖2B是從圖2A的狀態(tài)按壓柱塞10而使密封部件12A與下注射器22接觸時的側面圖。圖2C是按壓柱塞10后的筒I的說明圖。
[0035]筒I是進行使核酸從結合有核酸的磁珠7溶出到溶出液塞子47中的核酸溶出處理的容器，并且是對于溶出液和核酸擴增溶出液的混合液(以下，稱為PCR溶液40)進行聚合酶反應的熱循環(huán)處理的容器。
[0036]核酸提取處理在罐3進行，在通過管20期間被精制。管20的材質沒有特別限定，例如可以為玻璃、塑料等樹脂、金屬等。特別是如果選擇透明的玻璃或樹脂作為管20的材質，則能夠從管20的外部觀察空腔內，因而更優(yōu)選。另外，管20的材質如果選擇透過磁力的物質或非磁性體，則使磁性粒子通過管20時等，從管20的外部賦予磁場，從而能夠容易使磁性粒子通過管20，因而優(yōu)選。應予說明，管20的材質可以與罐3的材質相同。
[0037]管20具有第2清洗液塞子45、溶出液塞子47和油塞子。結合有核酸的磁珠7被外部的磁鐵吸引，因此通過在外部使磁鐵沿管20移動，從而磁珠7在管20內移動，通過第2清洗液塞子45，到達溶出液塞子47。與磁珠7結合的核酸在第2清洗液塞子45被清洗液清洗，在溶出液塞子47溶出。在此，“塞子”是指在管20內特定的液體占一個區(qū)域時的液體。例如，在圖2A~圖2C中將毛細管23內保持為柱狀的液體稱為“塞子”。應予說明，油不與其它溶液混和，因此，由油構成的塞子具有防止其兩側的水溶性的塞子相互混合的功能。優(yōu)選在塞子中或塞子間沒有氣泡或其它液體，但只要磁珠7能夠通過塞子，也可以存在氣泡或其它液體。
[0038]油的種類沒有特別限定，可以使用礦物油、硅油(2CS硅油等)、植物油等，但是通過形成更高粘度的油，從而使核酸結合性固相載體在與上側的塞子的界面移動時，能夠提高由油所帶來的“洗掉效果”。由此，使核酸結合性固相載體從上側的塞子移動至由油構成的塞子時，能夠使附著于核酸結合性固相載體的水溶性的成分更難以帶到油內。
[0039]熱循環(huán)處理在筒I的PCR容器30進行。PCR容器30被油填滿，由于PCR溶液40與該油相分離，所以如果溶出液塞子47和核酸擴增反應液塞子49被從管20推出到油中，則合體成為液滴狀的PCR溶液40，另外，由于比油的比重大，所以成為液滴狀的PCR溶液40沉降(圖15A)。利用外部的加熱器在PCR容器30形成高溫區(qū)域36A和低溫區(qū)域36B，如果反復使筒I整體與加熱器一起上下翻轉，則PCR溶液40在高溫區(qū)域36A和低溫區(qū)域36B之間交替移動，對PCR溶液40實施2階段溫度處理(圖15)。
[0040]PCR容器30的材質沒有特別限定，例如，可以為玻璃、塑料等樹脂、金屬等。另外，由于在其附近有高溫側加熱器65B，所以優(yōu)選PCR容器30的材質具有至少100°C以上的耐熱性。PCR容器30的材質如果選擇透明或半透明的材質，則容易進行熒光測定(亮度測定)，因而優(yōu)選。其中，不需要PCR容器30的全部區(qū)域都為透明或半透明，只要至少與熒光測定器55對置的部位(例如PCR容器30的底35A)是透明或半透明的即可。應予說明，管20的材質可以與罐3、柱塞10的材質相同。
[0041]筒I由罐3和筒主體9構成。在構成筒I的試劑盒中，與罐3和筒主體9 一起預先準備了適配器5。通過罐3與筒主體9介由適配器5連接，組裝成筒I。但是，也可以按將罐3直接安裝在筒主體9的方式構成。
[0042]在以下的筒I的構成要件的說明中，如圖2A所示，將沿長條的筒I的方向作為“長邊方向”，將罐3側作為“上游側”，將PCR容器30側作為“下游側”。應予說明，也可以將上游側簡單表示為“上”，將下游側簡單表示為“下”。
[0043]( 1)罐
[0044]圖3A~圖3D是罐3的說明圖。
[0045]預先在試劑盒中準備的罐3收容有溶解液41和磁珠7。在罐3的開口安裝可拆卸的蓋3(參照圖3A)。作為溶解液41，使用5M硫氰酸胍、2%Triton X_100、50mM Tris-HCl(pH7.2)。操作者取下蓋3A，打開罐3的開口(參照圖3B)，將附著有病毒的棉棒浸在罐3內的溶解液41中，將病毒采集到溶解液41中(參照圖3C)。攪拌罐3內的液體時，可以在圖3C的狀態(tài)下振蕩罐3，但是如果這樣，則溶解液41容易溢出，因此優(yōu)選如圖3D所示，在罐3的開口安裝帶蓋5A的適配器5后振蕩罐3。由此罐3內的物質被攪拌，病毒粒子被溶解液41溶解，核酸游離，并且被涂布于磁珠7的二氧化硅吸附核酸。其后，操作者取下安裝在罐3的開口的適配器5的蓋5A，介由適配器5將罐3安裝在筒主體9 (參照圖2A)。
[0046]罐3由有柔性的樹脂構成，罐3能夠膨脹。當柱塞10滑動而從圖2A的狀態(tài)變到圖2B的狀態(tài)時，罐3膨脹，從而抑制管20內的液體的壓力過度上升，抑制管20內的液體被推出到下游側。優(yōu)選以罐3容易膨脹的方式在罐3形成變形部3B。
[0047]應予說明，提取?擴增核酸的試樣不限于病毒，也可以是細胞。細胞的來源也沒有特別限定，可以是微生物，也可以是高等生物的組織片、血液等。
[0048]另外，溶解液只要含有促溶物質就沒有特別限定，出于破壞細胞膜或使細胞中所含的蛋白質變性的目的，可以使之含有表面活性劑。作為該表面活性劑，只要通常被用于從細胞等提取核酸，就沒有特別限定，具體而言，可舉出Triton-X等Triton系表面活性劑、TWeen20等Tween系表面活性劑這樣的非離子型表面活性劑，N-月桂酰肌氨酸鈉(SDS)等陰離子型表面活性劑，特別優(yōu)選使非離子型表面活性劑成為0.1~2%的范圍而使用。此外，溶解液中優(yōu)選含有2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇等還原劑。溶解液也可以是緩沖液，但優(yōu)選是pH6~8的中性溶液?？紤]這些因素，具體而言，優(yōu)選含有3~7M的胍鹽、O~5%的非離子型表面活性劑、O~0.2mM的EDTA、0~0.2M的還原劑等。
[0049]促溶物質只要是在水溶液中生成促溶離子(離子半徑大的I價的陰離子)，具有增加疏水性分子的水溶性的作用，有助于核酸對固相載體的吸附的物質就沒有特別限定。具體而言，可舉出硫氰酸胍、鹽酸胍、碘化鈉、碘化鉀、高氯酸鈉等，其中，優(yōu)選蛋白質變質作用強的硫氰酸胍或鹽酸胍。這些促溶物質的使用濃度因根據(jù)各物質不同而異，例如使用硫氰酸胍時，優(yōu)選在3~5.5M的范圍使用，使用鹽酸胍時，優(yōu)選在5M以上使用。
[0050]另外，采集試樣的器具沒有特別限定，可以根據(jù)用途選擇刮刀、棒、刮板等代替棉棒。
[0051]罐3的內容積沒有特別限定，例如，可以為0.1mL~100mL。罐3的材質沒有特別限定，例如，可以為玻璃、塑料等樹脂、金屬等。特別是如果選擇透明的玻璃、樹脂作為罐的材質，則能夠從罐3的外部觀察內部，因而更優(yōu)選。應予說明，罐3和各管20可以一體成型，也可以可裝卸地構成。罐3的材質如果利用橡膠、彈性體、高分子等具有柔性的材料，則通過在對罐3安裝蓋的狀態(tài)下，使罐3變形，能夠對罐3的內部加壓。由此，能夠從管的內部向外部，從管的前端側推出管20的內容物。
[0052](2)筒主體
[0053]筒主體9具有柱塞10、管20和PCR容器30。
[0054](2-1)柱塞
[0055]以下，參照圖2A~圖2C對柱塞10進行說明。
[0056]柱塞10是將液體從作為注射器發(fā)揮功能的管20的下游側推出的可動式推桿。柱塞10具有將管20內的規(guī)定量的液體從管20的末端向PCR容器30推出的功能。另外，柱塞10還具有介由適配器5安裝罐3的功能。
[0057]柱塞10具有筒狀部11 和棒狀部12。筒狀部11設在罐3側(上游側)，棒狀部12設在管20側(下游側)。棒狀部12從筒狀部11的下游側的內壁被板狀的2個凸緣13支撐。棒狀部12的下游側從筒狀部11向下游側突出。
[0058]筒狀部11在上游側和下游側開口，筒狀部11的內壁成為液體的通路。適配器5與筒狀部11的上游側(罐3側)的開口嵌合。對于在試劑盒中預先準備的筒主體9的柱塞10而言，可以在筒狀部11的上游側的開口安裝能取下的蓋。筒狀部11的下游側的開口位于管20的上注射器21的內部。從筒狀部11的上游側的開口導入的磁珠7通過筒狀部11的內部，穿過凸緣13的表面和背面，從筒狀部11的下游側的開口出來，被導入到管20的上注射器21。
[0059]筒狀部11的下游側與管20的上注射器21的內壁嵌合。筒狀部11與管20的上注射器21內接，并且能夠相對于上注射器21在長邊方向滑動。
[0060]在筒狀部11的上游側的開口的周圍形成有安裝適配器5的安裝臺11A。另外，安裝臺IlA也是在按壓按壓柱塞10時被按壓的部位。通過按壓安裝臺11A，從而使柱塞10相對于管20滑動，從圖2A的狀態(tài)變成圖2C的狀態(tài)。如果柱塞10移動到下游側，則安裝臺IlA與管20的上緣接觸(參照圖2C)。換言之，柱塞10的安裝臺IlA與管20的上緣的間隔是柱塞10的滑動長度。
[0061]棒狀部12在初始狀態(tài)時位于管20的上注射器21的內部，與下注射器22分離(參照圖2A)。如果柱塞10相對于管20滑動，則棒狀部12被插入到管20的下注射器22，棒狀部12與下注射器22內接，并且相對于下注射器22向下游方向滑動(參照圖2B和圖2C)。
[0062]棒狀部12的與長邊方向正交的截面的形狀為圓形。但是，棒狀部12的截面形狀只要能夠與管20的下注射器22的內壁嵌合，就可以為圓、橢圓、多邊形，沒有特別限定。
[0063]在棒狀部12的下游側的端部形成了密封部件12A。如果密封部件12A與下注射器22嵌合，則防止下游側的管20內的液體向上注射器21逆流。而且，如果將柱塞10從圖2B的狀態(tài)按壓到圖2C的狀態(tài)，則期間以與密封部件12A在下注射器22內滑動的體積相當?shù)牧?，?0內的液體從下游側被推出。
[0064]應予說明，密封部件12A在下注射器22內滑動的體積(管20內的液體從下游側被推出的量)比推出的塞子的總體積大。由此，能夠以溶出液和核酸擴增反應液不殘留在管20內的方式推出管20內的液體。
[0065]柱塞10的材質沒有特別限定，例如，可以為玻璃、塑料等樹脂、金屬等。另外，柱塞10的筒狀部11和棒狀部12可以由相同的材質一體形成，也可以由不同的材質形成。在此，將筒狀部11和棒狀部12用樹脂分別成型，介由凸緣13接合筒狀部11與棒狀部12，從而形成柱塞10。
[0066]在柱塞10的內部，預先收容了構成第I塞子的油42和構成第2塞子的第I清洗液43。由于柱塞10內的油42的比重比第I清洗液43得比重小，所以在將罐3安裝到筒主體9時，如果將柱塞10的安裝臺IlA朝上而豎起筒主體9，則如圖2A所示，在罐3內的液體與筒主體9的第I清洗液43之間配置油42。作為油42，使用2CS硅油，作為第I清洗液43，使用 8M 鹽酸胍、0.7%Triton X-100。
[0067]應予說明，第I清洗液43只要是與構成第I塞子的油42和構成第3塞子的油44混合時均相分離的液體即可。第I清洗液43優(yōu)選為水或低鹽濃度水溶液，在為低鹽濃度水溶液時，優(yōu)選為緩沖液。低鹽濃度水溶液的鹽濃度優(yōu)選為10mM以下，更優(yōu)選為50mM以下，最優(yōu)選為1mM以下。另外，低鹽濃度水溶液的下限沒有特別限定，但優(yōu)選為0.1mM以上，進一步優(yōu)選為0.5mM以上，最優(yōu)選為ImM以上。另外，該溶液可以含有Triton、Tween、SDS等表面活性劑，pH沒有特別限定。用于形成緩沖液的鹽沒有特別限定，優(yōu)選使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的鹽。此外，該清洗液優(yōu)選含有不阻礙核酸對載體的吸附、逆轉錄反應、PCR反應等的量的醇。此時，醇濃度沒有特別限定，可以為70%以下，也可以為60%以下，也可以為50%以下，也可以為40%以下，也可以為30%以下，也可以為20%以下，也可以為10%以下，優(yōu)選為5%以下或2%以下，進一步優(yōu)選為1%以下或0.5%以下，最優(yōu)選為0.2%以下或0.1%以下。
[0068]應予說明，第I清洗液43可以含有促溶劑。例如，如果第I清洗液43含有鹽酸胍，則能夠在維持或強化吸附在粒子等上的核酸的吸附的同時清洗粒子等。作為含有鹽酸胍時的濃度，例如，可以為3mol/L~10mol/L,優(yōu)選為5mol/L~8mol/L。只要鹽酸胍的濃度為該范圍，就能夠使吸附在粒子等上的核酸更穩(wěn)定地吸附，同時能夠清洗其它夾雜物。
[0069](2-2)管
[0070]以下，參照圖2A~圖2C對管20進行說明。
[0071]管20是能夠使液體在長邊方向流通的筒狀的形狀。管20具有上注射器21、下注射器22和毛細管23，各部的內徑分階段性地不同。
[0072]上注射器21是能夠使液體在長邊方向流通的筒狀的形狀。柱塞10的筒狀部11可滑動地與上注射器21的內壁內接，上注射器21作為與柱塞10的筒狀部11相對的注射器發(fā)揮功能。
[0073]下注射器22是能夠使液體在長邊方向流通的筒狀的形狀。柱塞10的棒狀部12的密封部件12A可滑動地與下注射器22的內壁嵌合，下注射器22作為與柱塞10的棒狀部12相對的注射器發(fā)揮功能。
[0074]毛細管23是能夠使液體在長邊方向流通的細管狀的形狀。毛細管23的內徑是液體能夠維持塞子的形狀的大小，在此為1.0mm0在毛細管23的末端(管20的下游側的端部)，與其余部分相比內徑變小，在此為0.5mm。毛細管23的末端的內徑被設定成比后述的液滴狀的反應液的直徑(1.5~2.0mm)小。由此，反應液塞子47從毛細管23的末端被推出時，能夠避免液滴狀的反應液附著在毛細管23的末端,或者逆流到毛細管內。
[0075]應予說明，毛細管23只要在內部具有空腔且具有能夠使液體在長邊方向流通的筒狀的形狀即可，可以在長邊方向彎曲，但優(yōu)選位直線狀。管的內部的空腔只要能夠使液體在管內維持塞子的形狀，則其大小、形狀均無特別限定。另外，管內的空腔的大小、與長邊方向垂直的截面的形狀可以沿管的長邊方向變化。
[0076]管的外形的與長邊方向垂直的截面的形狀也沒有限定。此外，管的壁厚(從內部的空腔的側面到外部的表面的尺寸)也沒有特別限定。管為圓筒狀時，其內徑(內部的空腔的與長邊方向垂直的截面的圓的直徑)例如可以為0.5mm~2mm。如果管的內徑為該范圍，則對于管的材質、液體的種類，在廣泛的范圍內都能容易地形成液體的塞子。前端優(yōu)選進一步變細而成錐形，可以為0.2mm~1mm。而且，通過使毛細管23的末端的內徑(毛細管23的開口直徑)變小，能夠抑制在PCR容器30內液滴化的PCR溶液40吸附在毛細管23的開口而不脫離。但是，如果使毛細管23的末端的內徑過小，則將形成大量小液滴的PCR溶液40。應予說明，如果使毛細管23的末端以外的部分與末端同樣細徑化，則從確保各塞子的體積的必要性考慮，筒I會變長，所以不優(yōu)選。
[0077]毛細管23從上游側在內部依次具備第I油塞子44、第2清洗液塞子45、第2油塞子46、溶出液塞子47、第3油塞子48、核酸擴增反應液塞子49以及第4油塞子50。換言之，在水溶性的塞子(第2清洗液塞子45或溶出液塞子47或核酸擴增反應液塞子49)的兩側配置有油塞子。
[0078]應予說明，在與第I油塞子44相比位于上游側的上注射器21和下注射器22預先收容了油42和第I清洗液43 (參照圖2A)。上注射器21和下注射器22的內徑比毛細管23的內徑大，在上注射器21和下注射器22無法將液體(油42和第I清洗液43)維持成塞子這樣的柱狀，但由于第I油塞子44被毛細管23以塞子的形狀保持，所以抑制構成第I油塞子44的油移動到上游側。
[0079]第2清洗液塞子45可以由5mMTris鹽酸緩沖液構成，第2清洗液可以是與第I清洗液中述及的成分基本上相同的構成，可以與第I清洗液相同也可以不同，優(yōu)選事實上不含促溶物質的溶液。這是為了不向后面的溶液帶入促溶物質。如上所述，該清洗液也優(yōu)選僅含有不阻礙核酸對載體的吸附、逆轉錄反應、PCR反應等的量的醇。此時，醇濃度沒有特別限定，可以為70%以下，也可以為60%以下，也可以為50%以下，也可以為40%以下，也可以為30%以下，也可以為20%以下，也可以為10%以下，但優(yōu)選為5%以下或2%以下，進一步優(yōu)選為1%以下或0.5%以下，最優(yōu)選為0.2%以下或0.1%以下。
[0080]第2清洗液塞子45可以由被油塞子分割開的多個塞子構成。第2清洗液塞子45由多個塞子構成時，各塞子的液體可以相同也可以不同。其中，只要至少有I個清洗液的塞子，其它塞子的液體沒有特別限定，優(yōu)選全部塞子為清洗液。第2清洗液塞子45被分割的數(shù)目例如可以考慮管20的長度、清洗的對象等適當?shù)卦O定。
[0081]溶出液是指使吸附在核酸結合性固相載體上的核酸從載體溶出到溶液中并進行逆轉錄反應的液體。因此，預先將核酸溶出后的反應液制備成直接用于逆轉錄反應和聚合酶反應的緩沖溶液。而且，核酸擴增反應液是指進行聚合酶反應的液體。
[0082]溶出液用于逆轉錄反應,含有逆轉錄酶、dNTP和逆轉錄酶用引物(寡聚核苷酸)，特別是不設置核酸擴增反應液塞子29和油塞子50時，為了聚合酶反應，進一步含有DNA聚合酶和DNA聚合酶用引物(寡聚核苷酸)，可以含有TaqMan探針、分子信標(MolecularBeacon)、循環(huán)探針等實時PCR用探針、SYBR綠等嵌入劑用熒光色素。此外，作為反應阻礙防止劑，優(yōu)選含有BSA (牛血清白蛋白)或者明膠。溶劑優(yōu)選為水，更優(yōu)選事實上不含有乙醇、異丙醇等有機溶劑和促溶物質。另外，優(yōu)選含有鹽，以形成逆轉錄酶用緩沖液和/或DNA聚合酶用緩沖液。用于形成緩沖液的鹽只要不阻礙酶反應，就沒有特別限定，優(yōu)選使用Tris、HEPES, PIPES、磷酸等的鹽。逆轉錄酶沒有特別限定，例如，可以使用來自禽成髓細胞瘤病毒(Avian Myeloblast Virus)、Ras 相關病毒 2 型(Ras Associated Virus2 型)、莫洛尼小鼠白血病病毒(Mouse Molony Murine Leukemia Virus)、人類免疫缺陷病毒I型(HumanImmunodefficiency Virusl型)的逆轉錄酶等,但優(yōu)選耐熱性的酶。DNA聚合酶也沒有特別限定，優(yōu)選耐熱性的酶、PCR用酶，例如，有Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶或者它們的改良型等非常大量的市售品，優(yōu)選進行熱啟動的DNA聚合酶。
[0083]DNA聚合酶用引物可以針對于檢測的DNA容易地決定適當?shù)男蛄?。通常，為了擴增I種DNA，含有5’側的引物和3’側的引物的引物對即可。應予說明，為了擴增多種DNA，預先含有用不同的熒光色素標記的多種引物對，從而也能夠應對多重PCR對應。此時，TaqMan探針也適當?shù)貫槎鄠€即可。
[0084]反應液中所含的dNTP、鹽的濃度成為對于所使用的酶而言適合的濃度即可，通常，可以使dNTP為10~1000 μ M，優(yōu)選為100~500 μ Μ，使Mg2+為I~10mM,優(yōu)選為5~1mM,使Cf為I~2000mM，優(yōu)選為200~700mM，總離子濃度沒有特別限定，可以為大于50mM的濃度，優(yōu)選為大于10mM的濃度,更優(yōu)選為大于120mM的濃度,進一步優(yōu)選為大于150mM的濃度，特別優(yōu)選為大于200mM的濃度。上限優(yōu)選為500mM以下，更優(yōu)選為300mM以下，進一步優(yōu)選為200mM以下。引物用寡聚核苷酸分別使用0.1~10 μ Μ、優(yōu)選為0.1~I μ M的濃度。BSA或明膠的濃度為lmg/mL以下時，防止反應阻礙的效果變小,如果為10mg/mL以上，則可能阻礙逆轉錄反應及其后的酶反應，因此優(yōu)選I~10mg/mL。使用明膠時，其來源可例示牛皮、豬皮、牛骨，但沒有特別限定。明膠難溶解時，可以加溫使其溶解。
[0085]溶出液塞子47的體積沒有特別限定，可以將吸附有核酸的粒子等的量等作為指標來適當?shù)卦O定。例如，粒子等的體積為0.5μ L時，溶出液塞子47的體積只要為0.5μ L以上就夠用，優(yōu)選為0.8 μ L~5 μ L，進一步優(yōu)選為I μ L~3 μ L。只要溶出液塞子的體積在這些范圍內，例如，即便核酸結合性固相載體的體積為0.5 μ L，也能夠使核酸從載體充分溶出。
[0086]毛細管23的下游部被插入PCR容器30。由此，通過從管20推出管20內的核酸擴增反應液塞子49和溶出液塞子47，就能夠將核酸擴增反應液塞子49和溶出液推出至PCR容器30中。
[0087]毛細管23的外壁的環(huán)狀的凸部通過與PCR容器30的內壁接觸而形成上密封部。另外，位于密封部的下游側的毛細管23的外壁通過與PCR容器30的內壁接觸形成下密封部。上密封部和下密封部在后面述及。
[0088]管20進一步具有固定爪25和導板26。圖4是固定爪25和導板26與安裝部62的說明圖。
[0089]固定爪25是將筒I固定在安裝部62的部件。如果筒I插入安裝部62直到固定爪25鉤掛在安裝部62上為止，則筒I相對于安裝部62被固定在正常的位置。換言之，當筒I相對于安裝部62位于異常的位置時，固定爪25未鉤掛在安裝部62上。
[0090]導板26是將筒I安裝在PCR裝置100的安裝部62時引導筒I的部件。在PCR裝置100的安裝部62形成有導軌63Α，筒I邊由管20的導板26沿導軌63Α引導，邊被插入并固定于安裝部62。筒I為長尺的形狀，但由于筒I邊由導板26引導邊插入安裝部62，所以容易將筒I相對于安裝部62固定在正常的位置。
[0091]固定爪25和導板26是從毛細管23的左右突出的板狀的部件。當用磁鐵使管20內的磁珠7移動時,使磁鐵從板狀的固定爪25、導板26的垂直方向靠近。由此，可以使磁鐵與管20內的磁珠7的距離拉近。但是，只要能使磁鐵與管20內的磁珠7的距離拉近，固定爪25和導板26也可以為其它形狀。
[0092](2-3) PCR 容器
[0093]圖5A和圖5B是PCR容器30的周邊的說明圖。圖5A是初始狀態(tài)的說明圖。圖5B是按壓柱塞10后的狀態(tài)的說明圖。以下，參照圖2A~圖2C對PCR容器30進行說明。
[0094]PCR容器30是收入被從管20推出的液體的容器，并且是在熱循環(huán)處理時收容核酸擴增反應液塞子49和溶出液的混合液(以下，稱為PCR溶液40)的容器。
[0095]PCR容器30具有密封形成部31和流路形成部35。密封形成部31是插入管20的部分，是抑制從流路形成部35溢出的油泄漏到外部的部位。流路形成部35與密封形成部31相比是下游側的部分，是形成液滴狀的PCR溶液40移動的流路的部位。PCR容器30以密封形成部31的上密封部34A和下密封部34B這2個位置固定在管20。
[0096]密封形成部31具有油收容部32和階梯部33。
[0097]油收容部32是筒狀的部位，作為收容從流路形成部35溢出的油的腔室發(fā)揮功能。在油收容部32的內壁與管20的毛細管23的外壁之間有縫隙，該縫隙成為收容從流路形成部35溢出的油的油收容空間32A。油收容空間32A的體積比柱塞10的密封部件12A在管20的下注射器22內滑動的體積大。
[0098]油收容部32的上游側的內壁通過與管20的環(huán)狀的凸部接觸而形成上密封部34A。上密封部34A是允許空氣通過且抑制油收容空間32A的油泄漏到外部的密封部件。上密封部34A以油因油的表面張力而不泄漏的程度形成有通氣口。上密封部34A的通氣口可以是管20的凸部與油收容部32的內壁之間的縫隙，也可以是在管20的凸部形成的孔、槽或切口。另外，也可以利用吸收油的油吸收材形成上密封部34A。
[0099]階梯部33是被設置于油收容部32的下游側的有階梯的部位。階梯部33的下游部的內徑比油收容部32的內徑小。階梯部33的內壁與管20的毛細管23的下游側的外壁接觸。階梯部33的內壁和管20的外壁接觸，從而形成下密封部34B。下密封部34B是允許流路形成部35的油向油收容空間32A流入，同時又抵抗該流動的密封。因在下密封部34B的壓力損失而導致流路形成部35的壓力比外部大氣壓高，因此即便在熱循環(huán)處理時流路形成部35的液體被加熱，也不易在流路形成部35的液體中產(chǎn)生氣泡。
[0100]流路形成部35是管狀的部位，成為形成液滴狀的PCR溶液40移動的流路的容器。在流路形成部35填充油。流路形成部35的上游側被管20的末端封閉，管20的末端向流路形成部35開口。流路形成部35的內徑比管20的毛細管23的內徑大，比溶出液塞子47的容量的液體成為球形時的外徑大。流路形成部35的內壁優(yōu)選具有水溶性的PCR溶液40不附著的程度的疏水性。
[0101]應予說明，流路形成部35的上游側被外部的高溫側加熱器65B加熱至相對高的溫度(例如約為95度)，形成高溫區(qū)域36A。流路形成部35的下游側被外部的低溫側加熱器65C加熱至相對低的溫度(例如約為60°C)，形成低溫區(qū)域36B。PCR容器30的底35A(下游側的端部)被包含在低溫區(qū)域36B。由此，流路形成部35內的液體形成了溫度梯度。
[0102]如圖5A所示，在初始狀態(tài)下，在PCR容器30的流路形成部35填充有油。油的界面位于油收容空間32A的較下游側。油收容空間32A的油的界面上游側的體積比柱塞10的密封部件12A在管20的下注射器22內滑動的體積大。
[0103]如圖5B所示，如果按壓柱塞10，則管20內的液體被推出至流路形成部35中。但由于在流路形成部35預先填充了油，并且管20內的液體被推出到其中，所以氣體不會流入流路形成部35。
[0104]按壓柱塞10時，首先，管20的第4油塞子50流入流路形成部35，流入部分的油從流路形成部35流入油收容空間32A，油收容空間32A的油界面上升。此時，因下密封部34B的壓力損失而使得流路形成部35的液體的壓力升高。第4油塞子50被從管20推出后，核酸擴增反應液塞子49、第3油塞子48、溶出液47依次從管20流入流路形成部35。由于流路形成部35的內徑比毛細管23的內徑大，所以在管20內為塞子狀(柱狀)的溶出液47和核酸擴增反應液塞子49在流路形成部35油中合體，成為液滴狀的PCR溶液40。應予說明，由于油收容空間32A中的初始狀態(tài)下的油界面上游側的體積比柱塞10的密封部件12A在管20的下注射器22內滑動的體積大，所以油不會從油收容空間32A溢出。
[0105]< PCR 裝置 100 >
[0106]圖6A是PCR裝置100的內部結構的立體圖。圖6B是PCR裝置100的主要結構的側面圖。圖7是PCR裝置100的框圖。PCR裝置100使用筒I，進行核酸溶出處理和熱循環(huán)處理。
[0107]在以下的PCR裝置100的說明中，如圖所示，定義上下、前后、左右。即，以將PCR裝置100的基座51設成水平時的垂直方向為“上下方向”，根據(jù)重力方向定義“上”和“下”。另外，將筒I的旋轉軸的軸向設為“左右方向”，將與上下方向和左右方向垂直的方向設為“前后方向”。從筒I的旋轉軸觀察將筒插入口 53A的側設為“后”，將反向側設為“前”。將從前側觀察時的左右方向的右側設為“右”，左側設為“左”。
[0108]PCR裝置100具有旋轉機構60、磁鐵移動機構70、按壓機構80、熒光測定器55以及控制器90。
[0109](I)旋轉機構60
[0110]旋轉機構60是使筒I和加熱器旋轉的機構。旋轉機構60通過將筒I和加熱器上下翻轉，使液滴狀的PCR溶液40在PCR容器30的流路形成部35內移動，進行熱循環(huán)處理。
[0111]旋轉機構60具有旋轉體61和旋轉用馬達66。圖8A是旋轉體61的說明圖。圖8B是在旋轉體61的安裝部62安裝了筒I的狀態(tài)的說明圖。
[0112]旋轉體61是能夠以旋轉軸為中心旋轉的部件。旋轉體61的旋轉軸被在基座51上固定的支撐臺52支撐。在旋轉體61設有安裝筒I的安裝部62和加熱器(溶出用加熱器65A、高溫側加熱器65B和低溫側加熱器65C)。如果旋轉體61旋轉，則能夠在維持筒I和加熱器的位置關系的狀態(tài)下使筒I上下翻轉。旋轉用馬達66是使旋轉體61旋轉的動力源。旋轉用馬達66根據(jù)來自控制器90的指示，使旋轉體61旋轉至規(guī)定的位置。也可以在旋轉用馬達66與旋轉體61之間夾設齒輪等傳遞機構。
[0113]安裝部62是安裝筒I的部位。安裝部62具有形成有凹口的固定部63。另外，在加熱器(溶出用加熱器65A、高溫側加熱器65B和低溫側加熱器65C)形成的插入孔64A也作為安裝部62發(fā)揮功能。在PCR容器30插入插入孔64A的狀態(tài)下筒I的固定爪25鉤掛在固定部63的凹口，由此筒I被安裝在旋轉體61 (參照圖4)。在此，加熱器的一部分兼作安裝部62，但安裝部62和加熱器也可以各自獨立。另外，安裝部62介由溶出用加熱器65A間接地固定在旋轉體61，但也可以直接設置在旋轉體61。另外，安裝部62可安裝的筒I的數(shù)量不限于I個，可以為多個。
[0114]在固定部63沿上下方向形成有導軌63A (參照圖4)。導軌63A將筒I的導板26邊在前后方向限制，邊引導到插入方向。由于導軌63A邊引導導板26，邊使筒I插入安裝部62，因此筒I的PCR容器30被引導到插入孔64A，筒I相對于安裝部62被固定在正常的位置。
[0115]PCR裝置100具備溶出用加熱器65A、作為PCR用加熱器的高溫側加熱器65B和低溫側加熱器65C。各加熱器由未圖示的發(fā)熱源和加熱塊構成。發(fā)熱源例如為筒式加熱器，被插入加熱塊。加熱塊例如是導熱系數(shù)高的鋁等金屬，抑制熱不均，用來自發(fā)熱源的熱加熱筒I內的液體。另外，為了不吸附使磁珠7移動的磁鐵71，加熱塊優(yōu)選為非磁性體。
[0116]溶出用加熱器65A是加熱筒I的溶出液塞子47的加熱器。如果筒I被固定在正常的位置，則溶出用加熱器65A與管20的溶出液塞子47對置。例如，溶出用加熱器65A通過將溶出液塞子47加熱到約50°C，從而促進核酸從磁珠游離。
[0117]高溫側加熱器65B是加熱PCR容器30的流路形成部35的上游側的加熱器。如果筒I被固定在正常的位置，則高溫側加熱器65B與PCR容器30的流路形成部35的上游側(高溫區(qū)域36A)對置。例如，高溫側加熱器65B將PCR容器30的流路形成部35的上游側的液體加熱到約90~100°C。
[0118]低溫側加熱器65C是加熱PCR容器30的流路形成部35的底35A的加熱器。如果筒I被固定在正常的位置，則低溫側加熱器65C與PCR容器30的流路形成部35的下游側(低溫區(qū)域36B)對置。例如，低溫側加熱器65C將PCR容器30的低溫區(qū)域36B的液體加熱到約50~75。。。
[0119]在高溫側加熱器65B與低溫側加熱器65C之間配置有間隔件65D。間隔件6?抑制高溫側加熱器65B與低溫側加熱器65C之間的熱傳導。另外，間隔件65D也用于正確規(guī)定高溫側加熱器65B與低溫側加熱器65C之間的距離。由此，利用高溫側加熱器65B和低溫側加熱器65C，使PCR容器30的流路形成部35內的液體形成溫度梯度。
[0120]在分別構成溶出用加熱器65A、高溫側加熱器65B和低溫側加熱器65C的加熱塊分別形成有構成插入孔64A的貫通孔。PCR容器30的底35A的外壁從低溫側加熱器65C的插入孔64A的下側開口露出。熒光測定器55從插入孔64A的下側的開口測定位于PCR容器30的底35A的PCR溶液40的亮度。該熒光測定器55可以具有能夠進行多個波長區(qū)域的亮度檢測這樣的構成，以能夠應對多重PCR。
[0121 ] 應予說明，可以在高溫側加熱器65B和低溫側加熱器65C分別設置溫度控制裝置，設定成適合于各聚合酶反應的溫度。
[0122](2)磁鐵移動機構70
[0123]磁鐵移動機構70是使磁鐵71移動的機構。磁鐵移動機構70使筒I內的磁珠7被磁鐵71吸引，同時通過移動磁鐵71而使磁珠7在筒I內移動。磁鐵移動機構70具有一對磁鐵71、升降機構73和搖動機構75。
[0124]磁鐵71是吸引磁珠7的部件。作為磁鐵71，可以使用永磁鐵、電磁鐵等，在此使用了不產(chǎn)生發(fā)熱等的永磁鐵。一對磁鐵71以在前后方向對置且上下方向的位置幾乎相同的方式被臂72保持。各磁鐵71可以從被安裝在安裝部62的筒I的前側或后側對置。一對磁鐵71可以從前后方向夾持被安裝在安裝部62的筒I。通過使磁鐵71從與筒I的固定爪25或導板26被設置的方向(在此為左右方向)正交的方向(在此為前后方向)對置，從而能夠拉近筒I內的磁珠7與磁鐵71的距離。
[0125]升降機構73是使磁鐵71在上下方向移動的機構。由于磁鐵71吸引磁珠7，所以只要配合磁珠7的移動而在上下方向移動磁鐵71，就能夠在上下方向引導筒I內的磁珠7。
[0126]升降機構73具有在上下方向移動的滑架73A和升降用馬達73B?；?3A是能夠在上下方向移動的部件，被設置在有筒插入口 53A的側壁53的滑架引導部73C在上下方向可移動地引導。由于在滑架73A安裝有保持一對磁鐵71的臂72，所以如果滑架73A在上下方向移動，則磁鐵71也在上下方向移動。升降用馬達73B是使滑架73A在上下方向移動的動力源。升降用馬達73B根據(jù)來自控制器90的指示，使滑架73A移動至上下方向的規(guī)定的位置。升降用馬達73B利用帶73D和滑輪73E使滑架73A在上下方向移動，但也可以利用其它傳遞機構使滑架73A在上下方向移動。
[0127]當滑架73A位于最上面的位置(退避位置)時，磁鐵71位于筒I的上側。當滑架73A位于退避位置時，即便筒I旋轉，升降機構73也不與筒I接觸。另外，升降機構73可以將滑架73A的位置下降到磁鐵71與反應塞子對置的位置。由此，升降機構73能夠以使罐3內的磁珠7移動到反應塞子的位置的方式來移動磁鐵71。
[0128]搖動機構75是使一對磁鐵71在前后方向搖動的機構。如果一對磁鐵71在前后方向搖動，則各磁鐵71與筒I的間隔交錯地變化。由于磁珠7被距離更近的磁鐵71吸引，所以通過使一對磁鐵71在前后方向搖動，能夠使筒I內的磁珠7在前后方向移動。
[0129]搖動機構75具有搖動用馬達75A和齒輪。搖動用馬達75A和齒輪被設在滑架73A，能夠與滑架73A —起在上下方向移動。搖動用馬達75A的動力介由齒輪傳遞到臂72，由此保持磁鐵71的臂72相對于滑架73A以搖動旋轉軸75B為中心進行旋轉。為了防止磁鐵71與筒I接觸而損傷筒I，搖動機構75在磁鐵71與筒I不接觸的范圍內搖動磁鐵71。
[0130]搖動旋轉軸75B是臂72的旋轉軸。搖動旋轉軸75B與左右方向平行，以使磁鐵71能夠在前后方向搖動。從右或左觀察搖動旋轉軸75B時，搖動旋轉軸75B以偏離至筒I的前側或后側的方式被配置。由此，當滑架73A向下移動時，能夠避免筒I與臂72接觸。應予說明，只要能夠使磁鐵71在前后方向搖動，搖動旋轉軸75B也可以是與上下方向平行的軸。
[0131](3)按壓機構80
[0132]按壓機構80是按壓筒I的柱塞10的機構。通過用按壓機構80按壓柱塞10，從而筒I的溶出液塞子47和油塞子被推入PCR容器30中，并在PCR容器30的油中形成液滴狀的PCR溶液40。
[0133] 按壓機構80具有柱塞用馬達81和桿82。柱塞用馬達81是使桿82移動的動力源。桿82是按壓筒I的柱塞10的安裝臺IlA的部件。不按壓筒I的罐3而按壓安裝臺IlA的理由是罐3可膨脹，由具有柔性的樹脂構成。在罐3不發(fā)生變形的情況下，按壓機構80也可以通過按壓罐3來按壓柱塞10。
[0134]桿82按壓柱塞10的方向不是上下方向，而是相對于上下方向傾斜45度。因此，利用按壓機構80按壓柱塞10時，PCR裝置100在使旋轉體61旋轉45度而使筒I的長邊方向與桿82的移動方向一致后，使桿82移動。由于桿82按壓柱塞10的方向相對于上下方向傾斜45度，所以容易以不干擾升降機構73的方式配置按壓機構80。另外，由于桿82按壓柱塞10的方向相對于上下方向傾斜45度，所以能夠減小PCR裝置100的上下方向的尺寸。
[0135](4)熒光測定器55
[0136]熒光測定器55是測定PCR容器30的PCR溶液40的亮度的測定器。熒光測定器55以與筒I的PCR容器30的底35A對置的方式被配置在旋轉體61的下側。熒光測定器55從低溫側加熱器65C的插入孔64A的下側開口測定位于PCR容器30的底35A的PCR溶液40的亮度。
[0137](5)控制器 90
[0138]控制器90是進行PCR裝置100的控制的控制部?？刂破?0具有例如CPU等處理器和ROM、RAM等存儲裝置。在存儲裝置中存儲了各種程序和數(shù)據(jù)。另外，存儲裝置提供展開程序的區(qū)域。處理器通過執(zhí)行被存儲在存儲裝置的程序來實現(xiàn)各種處理。
[0139]例如，控制器90控制旋轉用馬達66，使旋轉體61旋轉到規(guī)定的旋轉位置。在旋轉機構60設有未圖示的旋轉位置傳感器，控制器90根據(jù)旋轉位置傳感器的檢測結果來使旋轉用馬達66驅動.停止。
[0140]另外，控制器9 控制加熱器(溶出用加熱器65A、高溫側加熱器65B和低溫側加熱器65C),使各加熱器發(fā)熱。在構成加熱器的加熱塊設有未圖不的溫度傳感器,控制器90根據(jù)溫度傳感器的檢測結果來控制筒式加熱器的開.關。
[0141]另外，控制器90控制升降用馬達73B，使磁鐵71在上下方向移動。在PCR裝置100設有檢測滑架73A的位置的未圖示的位置傳感器，控制器90根據(jù)位置傳感器的檢測結果來使升降用馬達73B驅動.停止。
[0142]另外，控制器90控制搖動用馬達75A，使磁鐵71在前后方向搖動。在PCR裝置100設有檢測保持磁鐵71的臂72的位置的位置傳感器，控制器90根據(jù)位置傳感器的檢測結果來使搖動用馬達75A驅動.停止。
[0143]另外，控制器90控制熒光測定器55，測定PCR容器30的PCR溶液40的亮度。在熒光測定器55與筒I的PCR容器30的底35A對置時，控制器90使熒光測定器55進行測定。測定結果被存儲裝置保存。
[0144]<動作說明>
[0145](I)筒I的安裝動作
[0146]圖9A~圖9D是安裝筒I時的PCR裝置100的狀態(tài)的說明圖。圖9A是安裝筒I前的初始狀態(tài)的說明圖。圖9B是待機狀態(tài)的說明圖。圖9C是剛剛安裝筒I之后的說明圖。圖9D是筒I在安裝狀態(tài)下的初始狀態(tài)的說明圖。
[0147]如圖9A所示，在筒I安裝前的初始狀態(tài)下，安裝部62的安裝方向呈上下方向。在以下的說明中，將該狀態(tài)的旋轉體61的旋轉位置作為基準(O度)，從右觀察以逆時針旋轉為正方向來表示旋轉體61的旋轉位置。
[0148]如圖9B所示，控制器90驅動旋轉用馬達66，使旋轉體61旋轉-30度。在該狀態(tài)下，操作者將筒I從筒插入口 53A插入安裝部62。此時，導軌63A邊引導導板26，邊將筒I插入安裝部62，因此筒I的PCR容器30被引導到安裝部62的插入孔64A。操作者插入筒I直到筒I的固定爪25鉤掛在固定部63的凹口為止。由此，筒I相對于安裝部62固定在正常的位置。假定在PCR容器30沒有被插入插入孔64A而筒I相對于安裝部62位于異常的位置的情況下，筒I的固定爪25未鉤掛在固定部63的凹口，所以操作者能夠識別筒I位于異常的位置。
[0149]如圖9C所示，若筒I相對于安裝部62被固定在正常的位置，則管20的溶出液塞子47與溶出用加熱器65A對置，PCR容器30的流路形成部35的上游側(高溫區(qū)域36A)與高溫側加熱器65B對置，PCR容器30的流路形成部35的下游側(低溫區(qū)域36B)與低溫側加熱器65C對置。由于安裝部62和加熱器被設置于旋轉體61中，所以即便旋轉體61旋轉，筒I與加熱器的位置關系也保持原樣。
[0150]在筒I安裝到安裝部62后，如圖9D所示，控制器90使旋轉體61旋轉30度，使旋轉體61的位置返回基準。應予說明，控制器90可以利用未圖示的傳感器檢測到筒I被安裝在安裝部62，也可以通過來自操作者的輸入操作來檢測。
[0151](2)核酸溶出處理
[0152].磁鐵71的上下移動
[0153]圖10是使磁鐵71向下方移動時的磁珠7的行為的示意圖。筒I內的磁珠7被磁鐵71吸引。因此，如果磁鐵71在筒I的外部移動，則筒I內的磁珠7與磁鐵71 —起移動。
[0154]圖1lA~圖1lC是核酸溶出處理的說明圖。圖1lA是核酸溶出處理前的PCR裝置100的狀態(tài)的說明圖。圖1lB是使磁鐵71移動到溶出液塞子47時的PCR裝置100的狀態(tài)的說明圖。圖1ic是提起磁鐵71時的PCR裝置100的狀態(tài)的說明圖。
[0155]如圖1lA所示，初始狀態(tài)的筒I使罐3位于上側，長邊方向與垂直方向平行。在該狀態(tài)下，如圖2A所示，筒I從上依次具備:包含磁珠7的溶解液41 (罐3)、油42 (柱塞10)、第I清洗液43 (管20的上游側)、第I油塞子44 (毛細管23)、第2清洗液塞子45 (毛細管23)、第2油塞子46 (毛細管23)、溶出液塞子47 (毛細管23)、第3油塞子48 (毛細管23)、核酸擴增反應液塞子49 (毛細管23)、第4油塞子50 (毛細管23)以及油(PCR容器30)。
[0156]如圖1IA所示，在初始狀態(tài)下，滑架73A位于最上面的位置(退避位置)，磁鐵71位于筒I上側。控制器90驅動升降用馬達73B，使滑架73A從該狀態(tài)緩慢向下方移動，使磁鐵71緩慢向下方移動。應予說明，由于筒I的長邊方向與垂直方向平行，所以磁鐵71沿著筒I移動。
[0157]如果磁鐵71向下方移動，則磁鐵71與罐3對置，罐3內的磁珠7被磁鐵71吸引。控制器90以磁珠7能夠與磁鐵71 一起移動的程度的速度，使滑架73A向下方移動。
[0158]如果磁鐵71從與罐3對置的位置(罐3的高度)移動到與柱塞10對置的位置(柱塞10的高度)，則磁珠7通過柱塞10的筒狀部11的上游側的開口，并通過罐3內的溶解液41與筒主體9的上游側的油42的界面。由此，結合有核酸的磁珠7被導入筒主體9。當磁珠7通過與油42的界面時，溶解液41被油42洗掉，所以溶解液41的成分難以帶入油42。由此，能夠抑制溶解液41的成分混入清洗液塞子45、溶出液塞子47、核酸擴增反應液塞子49。
[0159]如果磁鐵71在與柱塞10對置的狀態(tài)下向下方移動，則磁珠7通過筒狀部11的內部，穿過凸緣13的表面和背面，從筒狀部11的下游側的開口出來，被導入管20的上注射器
21。期間，磁珠7在柱塞10內通過油42與第I清洗液43的界面。如果磁珠7被導入第I清洗液43，則與磁珠7結合的核酸被第I清洗液43清洗。
[0160]在該階段，由于柱塞10的棒狀部12沒有被插入管20的下注射器22，所以如果磁鐵71從與上注射器21對置的位置(上注射器21的高度)移動到與毛細管23對置的位置(毛細管23的高度)，則磁珠7從上注射器21向下注射器22移動，從下注射器22移動到毛細管23。在毛細管23的上游側有第I油塞子44，當磁珠7從下注射器22移動到毛細管23時，磁珠7通過第I清洗液43與第I油塞子44的界面。此時，由于第I清洗液43被油洗掉，所以第I清洗液43的成分不易被帶入油中。由此，能夠抑制第I清洗液43的成分混入第2清洗液塞子45、溶出液塞子47。
[0161]如果磁鐵71從與第I油塞子44對置的位置(第I油塞子44的高度)移動到與第2清洗液塞子45對置的位置(第2清洗液塞子45的高度)，則磁珠7通過第I油塞子44與第2清洗液塞子45的界面。如果磁珠7被導入第2清洗液塞子45，則與磁珠7結合的核酸被第2清洗液清洗。
[0162]如果磁鐵71從與第2清洗液塞子45對置的位置(第2清洗液塞子45的高度)移動到與第2油塞子46對置的位置(第2油塞子46的高度)，則磁珠7通過第2清洗液與油的界面。此時，由于清洗液被油洗掉，所以第2清洗液的成分不易被帶入第2油塞子46。由此，能夠抑制第2清洗液的成分混入溶出液塞子47。
[0163]如果磁鐵71從與第2油塞子46對置的位置(第2油塞子46的高度)移動到與溶出液塞子47對置的位置 (溶出液塞子47的高度)，則磁珠7通過第2油塞子46與溶出液47的界面。
[0164]在磁珠7被導入溶出液塞子47前，控制器90控制溶出用加熱器65A，預先將溶出液塞子47加熱到約50°C。另外，在磁珠7被導入前預先加熱溶出液47，從而能夠縮短從磁珠7被導入溶出液47到核酸的溶出結束所需的時間。
[0165]如圖1lB所示，在磁鐵71移動到與溶出液塞子47對置的位置(溶出液塞子47的高度)后，如果控制器90使升降用馬達73B停止，使磁鐵71在上下方的移動停止，在50°C下處理30秒鐘，則與磁珠7結合的核酸游離到溶出液塞子47的溶液中，進行逆轉錄反應。通過加熱溶出液，從而促進核酸從磁珠7的溶出和逆轉錄反應。
[0166]使核酸在溶出液塞子47溶出后，控制器90使升降用馬達73B向與此前相反的方向驅動，使滑架73A緩慢向上方移動，使磁鐵71緩慢向上方移動?？刂破?0以磁珠7能夠與磁鐵71 一起移動的程度的速度使滑架73A向上方移動。
[0167]如果磁鐵71從圖1lB所示的狀態(tài)向上方移動，則磁珠7從溶出液塞子47移動到第2油塞子46，磁珠7被從溶出液塞子47除去。
[0168]如果磁鐵71緩慢移動到與上注射器21對置的位置，則磁珠7也移動到上注射器21，磁珠7位于下注射器22的上側。只要使磁珠7移動到該位置，當按壓柱塞10時磁珠7就不會被導入PCR容器30。因此，控制器90可以在從該狀態(tài)到圖1lC所示的狀態(tài)之間，以磁珠7無法追隨磁鐵71移動的程度的速度使滑架73A向上方移動。應予說明，只要在推動柱塞10時磁珠7不會被導入PCR容器30，則可以在更早的階段加快滑架73A的移動速度。
[0169]在控制器90的存儲裝置中存儲有與磁鐵71的移動速度相關的信息，控制器90根據(jù)該信息來執(zhí)行上述的動作(使磁鐵71上下移動的動作)。
[0170]?磁鐵71的搖動
[0171]使磁鐵71在上下方向移動期間，控制器90可以驅動搖動用馬達75A，使夾持筒I的一對磁鐵71在前后方向搖動。
[0172]圖12是搖動磁鐵71時的磁珠7的行為的示意圖。
[0173]磁鐵71在上下方向移動期間，管20從前后方向被一對磁鐵71夾持。由于一對磁鐵71被臂72保持，所以一對磁鐵71在前后方向的距離幾乎恒定。因此，如果一對磁鐵71中的一方靠近管20，則另一方離開管20。
[0174]由于磁珠7被距離近的磁鐵71吸引，所以如果一方磁鐵71靠近管20，則磁珠7被吸引到該磁鐵71側。其后，如果該磁鐵71離開管20，相反側的磁鐵71靠近管20，則這次磁珠7被相反側的磁鐵71吸引。由此,磁珠7在前后方向移動。如果使一對磁鐵71在前后方向搖動，則磁珠7也在前后方向往復移動。
[0175]如果磁珠7在前后方向往復移動，則磁珠7容易與液體接觸。特別是由于毛細管23內的液體幾乎不具有流動性，所以想要盡量使毛細管23內的液體與磁珠7接觸時，使磁珠7在前后方向往復移動是有效的。
[0176]圖13是表不有無磁鐵71搖動的表。
[0177]當磁珠7在油塞子(第I油塞子44或第2油塞子46)內向下方移動時，控制器90使搖動馬達停止，使磁鐵71不搖動。此時，控制器90在一對磁鐵71中的一方靠近管20的狀態(tài)下，使磁鐵71向下方移動。這是由于與各磁鐵71和管20的距離均衡的情況相比，磁珠7更容易跟隨磁鐵71移動。
[0178]當磁珠7在第2清洗液塞子45內向下方移動時，控制器90驅動搖動馬達，使磁鐵71在前后方向搖動。由此，磁珠7在第2清洗液塞子45內邊在前后方向搖動，邊向下方移動，因此能夠提高磁珠7的清洗效率。另外，由于清洗效率提高，所以能夠抑制第2清洗液塞子45的量，能夠實現(xiàn)筒I的小型化。
[0179]當磁珠7通過清洗液與油(第2油塞子46)的界面時，控制器90使搖動馬達停止，不使磁鐵71搖動。由此，磁珠7不搖動地通過界面，所以清洗液的成分不易被帶入油中。應予說明，控制器90在一對磁鐵71中的一方靠近管20的狀態(tài)下,使磁鐵71向下方移動。由此，磁珠7被距離近的磁鐵71吸引而凝聚，附著在磁珠7的清洗液被推出，因此清洗液的成分不易被帶入油中。
[0180]當磁珠7位于溶出液塞子47時，控制器90驅動搖動馬達，使磁鐵71在前后方向搖動。由此，由于磁珠7在溶出液塞子47內在前后方向搖動，所以能夠提高與磁珠7結合的核酸的溶出效率。另外，由于溶出效率提高，所以能夠縮短從磁珠7被導入溶出液到核酸的溶出結束所需的時間。
[0181]應予說明，在溶出液塞子47溶出核酸后，使磁鐵71向上方移動而提起磁珠7時，控制器90使搖動馬達停止，不使磁鐵71搖動。此時，控制器90在使一對磁鐵71中的一方靠近管20的狀態(tài)下，使磁鐵71向下方移動。由此，磁珠7變得容易追隨磁鐵71的移動，能夠加快磁鐵71的移動速度。
[0182]在控制器90的存儲裝置中存儲有與毛細管23的各塞子的位置相關的信息和如圖13所示的搖動信息，控制器90根據(jù)該信息來執(zhí)行上述動作(搖動磁鐵71的動作)。
[0183](3)液滴形成處理
[0184]圖14A~圖14C是液滴形成處理的說明圖。圖14A是提起磁鐵71時的PCR裝置100的狀態(tài)的說明圖。圖14B是使旋轉體61旋轉45度的狀態(tài)的說明圖。圖14C是按壓機構80的桿82按壓柱塞10的狀態(tài)的說明圖。
[0185]如圖14A所示，當滑架73A位于退避位置時，即便筒I旋轉，升降機構73也不與筒I接觸。成為這樣的狀態(tài)后，控制器90使旋轉體61旋轉45度。
[0186]如圖14B所示，如果旋轉體61旋轉45度，則筒I的長邊方向與按壓機構80的桿82的移動方向平行?？刂破?0驅動柱塞用馬達81，使桿82移動。如果桿82與筒I的柱塞10的安裝臺IlA接觸后再移動桿82，則柱塞10被壓入管20側。控制器90使桿82移動到圖14C所示的狀態(tài)，將柱塞10壓至柱塞10的安裝臺IlA與管20的上緣接觸。
[0187]如果柱塞10被壓入管20側，則柱塞10的棒狀部12的密封部件12A與管20的下注射器22嵌合(參照圖2B)。然后，如果進一步壓入柱塞10，則密封部件12A在下注射器22內滑動。由此，以與密封部件12A在下注射器22內滑動的體積相當?shù)牧?，?0的下游側的液體(第4油塞子50、核酸擴增反應液塞子49、第3油塞子48、溶出液塞子47等)被推出至PCR容器30的流路形成部35。
[0188]首先，管20的第4油塞子50流入流路形成部35。由于在流路形成部35填充有油，所以流入部分的油從流路形成部35流入油收容空間32A，油收容空間32A的油界面上升。此時，由于在下密封部34B的壓力損失，使得流路形成部35的液體的壓力比外部大氣壓(油收容空間32A的壓力)高。第4油塞子50被從管20推出后，核酸擴增反應液塞子49從管20流入流路形成部35。由于流路形成部35的內徑比毛細管23的內徑大，所以在管20內呈塞子狀的核酸擴增反應液塞子49在流路形成部35的油中成液滴狀。
[0189]接下來，同樣地管20的第3油塞子48流入流路形成部35。其后，與核酸擴增反應液塞子49同樣地，溶出液塞子47流入流路形成部35，在流路形成部35的油中成液滴狀。然后，在流路形成部35的油中，這些液滴合體而成為PCR溶液40 (圖15A)。
[0190]由于密封部件12A在下注射器22內滑動的體積(管20內的液體被從下游側推出的量)比管20內的溶出液塞子47和第3油塞子48的總計多，所在溶出液塞子47和核酸擴增反應液塞子49被從管20推出后，第2油塞子46的一部分也被推出至流路形成部35中。由此，溶出液和核酸擴增反應液塞子49不殘留在管20中，溶出液塞子47和核酸擴增反應液塞子49的全部溶液量成為液滴狀。另外，第2油塞子46的一部分被從管20的下游側推出，從而液滴狀的PCR溶液40容易從管20脫離(液滴狀的PCR溶液40不易吸附在毛細管23的開口)。
[0191]由于毛細管23的末端的內徑(毛細管23的開口徑)被設計得較小，所以在PCR容器30內液滴化的PCR溶液40不易吸附在毛細管23的開口。另外，PCR溶液40比PCR容器30的油的比重大。因此，液滴狀的PCR溶液40從毛細管23的末端脫離后，使流路形成部35形成流路，向底35A沉降。但是，在該階段，由于流路形成部35的流路傾斜45度，所以液滴狀的PCR溶液40容易附著在流路形成部35的內壁。因此，需使將流路形成部35的流路返回到垂直方向。
[0192] 在形成了液滴狀的PCR溶液40后(按壓柱塞10后)，控制器90使柱塞用馬達81向與此前相反的方向驅動，使桿82返回到原來的位置。在該狀態(tài)下，即便筒I不旋轉，按壓機構80的桿82也不會與筒I接觸。在成為這樣的狀態(tài)后，控制器90使旋轉體61回到基準位置。如果旋轉體61回到基準位置，則流路形成部35的流路變成垂直方向，因此液滴狀的PCR溶液40不易附著在流路形成部35的內壁。
[0193](4)熱循環(huán)處理
[0194]圖15A和圖15B是熱循環(huán)處理的說明圖。圖15A是對PCR溶液40實施低溫側的溫度處理的狀態(tài)的說明圖。圖15B是對PCR溶液40實施高溫側的溫度處理的狀態(tài)的說明圖。在各圖的左側示出了 PCR裝置100的狀態(tài)，在各圖的右側示出了 PCR容器30的流路形成部35的內部的狀態(tài)。
[0195]如果筒I相對于安裝部62被固定在正常的位置，則PCR容器30的流路形成部35的上游側(高溫區(qū)域36A)與高溫側加熱器65B對置，PCR容器30的流路形成部35的下游側(低溫區(qū)域36B)與低溫側加熱器65C對置。熱循環(huán)處理期間，控制器90利用被設置在旋轉體61的高溫側加熱器65B，將PCR容器30的流路形成部35的上游側的高溫區(qū)域36A的液體加熱到約90~100°C。另外，控制器90利用被設置在旋轉體61的低溫側加熱器65C，將流路形成部35的下游側的低溫區(qū)域36B的液體加熱到約50~75°C。由此，熱循環(huán)處理期間，PCR容器30的流路形成部35內的液體形成溫度梯度。由于安裝部62和加熱器被設置在旋轉體61中，所以即便旋轉體61旋轉，筒I和加熱器的位置關系也能保持原樣。
[0196]熱循環(huán)處理期間，PCR容器30內的液體被加熱。假定PCR容器30的液體因被加熱而產(chǎn)生氣泡時，有可能流路形成部35內的液體的溫度產(chǎn)生波動，或者流路形成部35中的液滴狀的PCR溶液40的移動(沉降)被阻礙等。但是，在本實施方式中，由于在下密封部34B的壓力損失而使得流路形成部35的液體的壓力比外部大氣壓高，所以PCR容器30的液體不易產(chǎn)生氣泡。
[0197]如圖15A所示，當旋轉體61位于基準位置時，低溫側加熱器65C位于高溫側加熱器65B的下側，筒I的PCR容器30的底35A朝下。由于液滴狀的PCR溶液40的比重比油大，所以液滴狀的PCR溶液40在流路形成部35內沉降。液滴狀的PCR溶液40如果在流路形成部35內沉降，則到達PCR容器30的底35A，因此結束沉降后留在低溫區(qū)域36B。由此，液滴狀的PCR溶液40移動到低溫區(qū)域36B。控制器90在規(guī)定時間保持圖15A的狀態(tài)，將液滴狀的PCR溶液40在低溫區(qū)域36B加熱到約50~75°C (實施低溫側的溫度處理)。期間，引發(fā)聚合酶反應的延伸反應。
[0198]如果控制器90驅動旋轉用馬達66而使旋轉體61從圖15A的狀態(tài)旋轉180度，則成為圖15B所示的狀態(tài)。如果旋轉體61從基準位置旋轉180度，則筒I上下翻轉，并且高溫側加熱器65B和低溫側加熱器65C也上下翻轉。換言之，高溫側加熱器65B位于低溫側加熱器65C的下側，筒I的PCR容器30的底35A朝上。如果液滴狀的PCR溶液40在流路形成部35內沉降，則到達管20的末端(毛細管23的末端)，因此沉降結束后留在高溫區(qū)域36A。由此，液滴狀的PCR溶液40移動到高溫區(qū)域36A。控制器90在規(guī)定時間保持圖15B的狀態(tài)，將液滴狀的PCR溶液40在高溫區(qū)域36A加熱到約90~100°C (實施高溫側的溫度處理)。期間，引起聚合酶反應的變性反應。
[0199]如果控制器90驅動旋轉用馬達66而將旋轉體61從圖15B的狀態(tài)旋轉-180度，則回到圖15A的狀態(tài)。在該狀態(tài)下，如果液滴狀的PCR溶液40在流路形成部35內沉降，則液滴狀的PCR溶液40移動到低溫區(qū)域36B，在低溫區(qū)域36B再次被加熱到約50~75°C(實施低溫側的溫度處理)。應予說明，由于毛細管23的末端的內徑(毛細管23的開口徑)被設計得較小，所以PCR溶液40不易吸附在毛細管23的開口，因此如果旋轉體61從圖15B的狀態(tài)旋轉-180度，則液滴狀的PCR溶液40不吸附在毛細管23的開口而脫離管20向PCR容器30的底35A沉降。
[0200]控制器90驅動旋轉用馬達66，以規(guī)定的循環(huán)數(shù)反復使旋轉體61的旋轉位置成為圖15A的狀態(tài)的操作和使之成為圖15B的狀態(tài)的操作。由此，PCR裝置100能夠對PCR溶液40實施PCR的熱循環(huán)處理。
[0201]在控制器90的存儲裝置中存儲有高溫側加熱器65B的溫度、低溫側加熱器65C的溫度、在圖15A的狀態(tài)下保持的時間、在圖15B的狀態(tài)下保持的時間以及循環(huán)數(shù)(圖15A的狀態(tài)和圖15B的狀態(tài)的反復次數(shù))的熱循環(huán)信息，控制器90根據(jù)該熱循環(huán)信息來執(zhí)行上述處理。
[0202](5)熒光測定
[0203]如圖15A所示，當旋轉體61位于基準位置時，熒光測定器55與筒I的PCR容器30的底35A對置。因此，在PCR溶液40的熒光測定時，控制器90在使旋轉體61為基準位置的狀態(tài)下，使熒光測定器55從低溫側加熱器65C的插入孔64A的下側開口測定位于PCR容器30的底35A的PCR溶液40的熒光強度。
[0204]在旋轉體61旋轉180度而變成基準位置之后，液滴狀的PCR溶液40在PCR容器30的流路形成部35內沉降，液滴狀的PCR溶液40有時不到達PCR容器30的底35A。因此，優(yōu)選控制器90在旋轉體61的旋轉位置成為圖15A的狀態(tài)后再經(jīng)過規(guī)定時間后(即將使旋轉體61從圖15A的狀態(tài)旋轉之前)測定熒光強度?；蛘呖刂破?0也可以在使旋轉體61到基準位置時后的規(guī)定時間內，使熒光測定器55測定熒光強度，存儲熒光強度的時間經(jīng)歷。
實施例
[0205]實驗例1
[0206]在本實驗例中，如圖16所示，在上述核酸提取用試劑盒中，使用了在管200的內部具有第I塞子210~第7塞子270的構成。
[0207]首先，在容量3mL的聚乙烯制容器130中收容375 μ L的吸附液和I μ L的磁珠分散液。吸附液使用76質量％的鹽酸胍、1.7質量％的乙二胺四乙酸二鈉二水合物以及10質量％的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯的水溶液(東洋紡制，MagExtractor-Genome-, NPK-1 )。另外，作為磁珠原液，使用含有50體積％的磁性二氧化硅粒子和20質量％的氯化鋰的溶液。
[0208]使用移液管從容器130的口 121加入從人采集的血液50 μ L，對容器130加蓋122并用手振蕩攪拌30秒鐘，進行攪拌。其后，取下容器130的蓋122并與管200連接。應予說明，在管200的兩端形成有栓110，取下第I塞子210側的栓110，將容器130與管200連接。
[0209]在此，第I塞子210、第3塞子230、第7塞子270、第5塞子250為硅油。第2塞子220的第I清洗液為76質量％的鹽酸胍的水溶液。另外，第4塞子240的第2清洗液為ΡΗ8.0的Tris-鹽酸緩沖液(溶質濃度5mM)。第6塞子260的溶出液為無菌水。
[0210]然后，移動永磁鐵410，將容器130內的磁珠125導入管200內。然后，使磁珠125移動到第6塞子260。磁珠125在管200內的各塞子存在的時間大致如下。第1、3、7塞子:各3秒，第2塞子:20秒，第4塞子:20秒，第6塞子:30秒。應予說明，在第2塞子220和第4塞子240中，不進行振蕩磁珠等的操作。另外，第2塞子220、第4塞子240和第6塞子260的體積分別為25 μ L、25 μ L和I μ L。
[0211]接著，取下管的第7塞子側的栓110，用手使容器120變形，使第7塞子270和第6塞子260排出到PCR的反應容器。該操作在利用永磁鐵使磁珠移動而退避至第2塞子220后進行。
[0212]然后，向該提取液中加入19μ L的PCR的反應試劑，根據(jù)常規(guī)方法進行實時PCR。PCR 的反應試劑的詳細成分是 Light Cycler480Genotyping Master (Roche Diagnostics制 4 707 524) 4 μ L、用無菌水稀釋了 1000 倍的 SYBR Green I (Life Technologies 公司制S7563) 0.4 μ LUOOyM ^ β肌動蛋白檢測用引物(F/R)各0.06 μ L、無菌水14.48 μ L0將實驗例I的PCR的擴增曲線示于圖17。應予說明，圖17的縱軸是熒光亮度，橫軸是PCR的循環(huán)數(shù)。
[0213]實驗例2
[0214]在實驗例2中，利用通常的核酸提取法進行核酸的提取。
[0215]首先，在容量1.5mL的聚乙烯制容器(Eppendorf微量離心管)中收容375 μ L的吸附液和20 μ L的磁珠分散液。作為吸附液、磁珠分散液的組成，與上述實驗例相同。
[0216]使用移液管從容器的口導入從人采集的血液50 μ L，對容器加蓋，用旋渦混合器攪拌10分鐘，操作磁性支架和移液管，進行B/F分離操作。在該狀態(tài)下，磁珠和少量的吸附液殘留在容器內。
[0217]接著，在容器中導入450 μ L與實驗例I相同組成的第I清洗液，加蓋后利用旋渦混合器攪拌5秒鐘，操作磁性支架和移液管，除去第I清洗液。反復2次該操作。在該狀態(tài)下，磁珠和少量的第I清洗液殘留在容器內。
[0218]接著，在容器中導入450 μ L與實驗例I相同組成的第2清洗液，加蓋后利用旋渦混合器攪拌5秒鐘，操作磁性支架和移液管，除去第I清洗液。反復2次該操作。在該狀態(tài)下，磁珠和少量的第2清洗液殘留在容器內。
[0219]然后，將50 μ L無菌水(溶出液)加入容器中，加蓋后利用旋渦混合器攪拌10分鐘，操作磁性支架和移液管，回收上清液。該上清液含有靶核酸。
[0220]然后，從該提取液分注I μ L，向其中進一步加入19μ L的PCR的反應試劑，根據(jù)常規(guī)方法進行實時PCR。PCR的反應試劑的詳細成分是Light Cycler480Genotyping Master(Roche Diagnostics 制 4 707 524)4 μ L、用無菌水稀釋了 1000 倍的 SYBR Green I (LifeTechnologies公司制S7563)0.4 μ L、100 μ M的β肌動蛋白檢測用引物(F/R)各0.06 μ L、無菌水14.48yL。將此時的擴增曲線示于圖17。
[0221]實驗結果
[0222]根據(jù)上述實驗例可以理解以下內容。
[0223](I)如果比較作為PCR的前處理的核酸的提取處理所需的時間，則從將樣品插入容器到將靶核酸導入PCR的反應容器的時間在實驗例I中大約為2分鐘。在實驗例2中大約為30分鐘。由此，實驗例I的核酸提取方法與實驗例2的核酸提取方法相比，核酸提取所需的時間大幅度縮短。
[0224](2)各清洗液在實驗例I中的量是實驗例2的約18分之I的量。此外，溶出液的量在實驗例I中也是實驗例2的約50分之I。因此，在實驗例I中，清洗液和溶出液的量相對于實驗例2而言為極少量即足夠。
[0225](3)如果在吸附液和溶出液的量中比較溶出液中的靶核酸的濃度，則認為理想的是實驗例I中的濃度是實驗例2的50倍的濃度。但是，在這次實驗例中，由于血液樣本所含的核酸量多，超過了 I μ L的磁珠可吸附的量，無法將血液樣本所含的核酸全部回收,所以在實驗例I中得不到實驗例2的50倍濃度。在核酸含量少而不超過I μ L的磁珠可吸附的量的樣品時，在實驗例I中可得到實驗例2的50倍濃度。
[0226](4)若觀察圖17的圖，可發(fā)現(xiàn)即便在核酸含量多的全血樣本中，核酸的擴增率的上升在實驗例I中比實驗例2快約0.6循環(huán)。即，實驗例I中使用的PCR的反應液與實驗例2中使用的PCR的反應液相比，靶核酸的濃度高。即，溶出液中的靶核酸的濃度在實驗例I中比實驗例2高。
[0227]符號說明
[0228]I 筒
[0229]3 罐
[0230]3Α 蓋
[0231]3Β變形部
[0232]5 適配器
[0233]5Α 蓋
[0234]7 磁珠
[0235]9 筒主體
[0236]10 柱塞
[0237]11筒狀部
[0238]IlA安裝臺
[0239]12 棒狀部
[0240]12Α密封部件
[0241]13 凸緣
[0242]20 管
[0243]21 上注射器
[0244]22 下注射器
[0245]23 毛細管
[0246]25 固定爪
[0247]26 導板
[0248]30 PCR 容器
[0249]31 密封形成部
[0250]32 油收容部
[0251]33 階梯部
[0252]34Α上密封部
[0253]34Β下密封部
[0254]35 流路形成部
[0255]35A PCR容器的底
[0256]36A高溫區(qū)域
[0257]36B低溫區(qū)域
[0258]40PCR 溶液
[0259]41溶解液
[0260]42油
[0261]43第I清洗液
[0262]44第I油塞子
[0263]45第2清洗液塞子
[0264]46第2油塞子
[0265]47溶出液塞子
[0266]48第3油塞子
[0267]49核酸擴增反應液塞子
[0268]50第4油塞子
[0269]51基座
[0270]53側壁
[0271]55熒光測定器
[0272]60旋轉機構
[0273]61旋轉體
[0274]62安裝部
[0275]63固定部
[0276]64A插入孔
[0277]65A溶出用加熱器
[0278]65B高溫側加熱器
[0279]65C低溫側加熱器
[0280]65D間隔件
[0281]66旋轉用馬達
[0282]70磁鐵移動機構
[0283]71磁鐵
[0284]72支架
[0285]73升降機構
[0286]73A 滑架
[0287]73B升降用馬達
[0288]73C滑架引導部
[0289]75搖動機構
[0290]80按壓機構
[0291]81柱塞用馬達
[0292]82桿
[0293]90控制器
[0294]100PCR 裝置
[0295]110栓
[0296]121口
[0297]122蓋
[0298]125磁珠
[0299]130聚乙烯制容器
[0300]200管
[0301]210第 I 塞子
[0302]220第 2 塞子
[0303]230第 3 塞子
[0304]240第 4 塞子
[0305]250第 5 塞子
[0306]260 第 6 塞子
[0307]270第 7 塞子
【權利要求】
1.一種核酸擴增反應用筒，具備管、核酸擴增反應用容器和按壓機構， 所述管在內部依次具備: 由第I油構成的第I塞子， 由與油混合時發(fā)生相分離且清洗結合有核酸的核酸結合性固相載體的清洗液構成的第2塞子， 由第2油構成的第3塞子， 由與油混合時發(fā)生相分離且將所述核酸從結合有核酸的核酸結合性固相載體溶出的溶出液構成的第4塞子， 由第3油構成的第5塞子， 由與油混合時發(fā)生相分離且進行核酸擴增反應的核酸擴增反應液構成的第6塞子， 由第4油構成的第7塞子， 所述核酸擴增反應用容器與所述管的第7塞子側連通且含有油， 所述按壓機構被安裝在所述管的第I塞子側的開口部，將液體從所述管的所述第7塞子側向所述核酸擴增反應用容器推出。
2.—種核酸擴增反應用筒，具備管、核酸擴增反應用容器和按壓機構， 所述管在內部依次具備: 由第I油構成的第I塞子， 由與油混合時發(fā)生相分離且清洗結合有核酸的核酸結合性固相載體的清洗液構成的第2塞子， 由第2油構成的第3塞子， 由與油混合時發(fā)生相分離且將所述核酸從結合有核酸的核酸結合性固相載體溶出的溶出液構成的第4塞子， 由第3油構成的第5塞子， 所述核酸擴增反應用容器與所述管的第5塞子側連通且含有油， 所述按壓機構被安裝在所述管的第I塞子側的開口部，將液體從所述管的所述第5塞子側向所述核酸擴增反應用容器推出， 所述核酸擴增反應用容器含有由與油混合時發(fā)生相分離且進行核酸擴增反應的核酸擴增反應液構成的液滴。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的核酸擴增反應用筒，其中，所述核酸擴增反應液含有DNA聚合酶、dNTP和引物。
4.根據(jù)權利要求1~3中任一項所述的核酸擴增反應用筒，其中，所述核酸擴增反應用容器具有固定所述管的密封形成部、和液滴流動的流路形成部。
5.根據(jù)權利要求4所述的核酸擴增反應用筒，其中，所述密封形成部具有收容從所述流路形成部溢出的油的油收容部。
6.根據(jù)權利要求1~5中任一項所述的核酸擴增反應用筒，進一步具備與所述管的所述第I塞子側連通且將所述核酸結合性固相載體導入所述管的罐。
7.根據(jù)權利要求6所述的核酸擴增反應用筒，其中，所述罐與所述管介由所述按壓機構結合。
8.—種核酸擴增反應用筒式試劑盒，具備權利要求1~5所述的核酸擴增反應用筒和將所述核酸結合性固相載體導入所述管的罐。
9.根據(jù)權利要求8所述的核酸擴增反應用筒式試劑盒，其中，所述罐包含提取核酸的溶解液和所述核酸結合性固相載體。
10.根據(jù)權利要求8或9所述的核酸擴增反應用筒式試劑盒，其中，所述罐具有開口部，且在所述開口部具有可拆卸的蓋。
11.根據(jù)權利要求8~10中任一項所述的核酸擴增反應用筒式試劑盒，其中，所述罐的開口部以能夠安裝在 所述管的第I塞子側的開口部的方式構成。
【文檔編號】C12M1/00GK104046557SQ201410090081
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年3月12日 優(yōu)先權日:2013年3月13日
【發(fā)明者】齊藤祐司, 高城富美男 申請人:精工愛普生株式會社