專利名稱：用于擴增反應(yīng)的分析工具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及借助于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的核酸定量的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核酸的定量在從分子生物學(xué)和遺傳研究到診斷和病原體檢測的許多領(lǐng)域中是重要的。當(dāng)存在足夠量的核酸吋，可以應(yīng)用斑點(blot)技術(shù)用于定量。然而，這些技術(shù)的有限靈敏度妨礙了它們在許多情況中的使用。不久前發(fā)展起來的定量PCR方法提供了在要求高得多的靈敏度情況下用于分析的工具。這些技術(shù)是基于以下事實在PCR擴增期間產(chǎn)物的量以指數(shù)方式增長，并且因此， 可以通過常規(guī)手段(例如，熒光檢測)來檢測在少量循環(huán)之后所獲得的產(chǎn)物的量。另外，原則上，如果已知擴增循環(huán)的數(shù)目，則可以從擴增結(jié)束時獲得的產(chǎn)物的量來確定初始(即，在擴增開始吋)存在的產(chǎn)物的量。在擴增反應(yīng)進程上形成的PCR產(chǎn)物的典型曲線圖揭露了擴增過程的四個不同階段(見圖1):(1)基底階段(GP)，其中熒光信號由背景熒光和噪聲主導(dǎo)；( 指數(shù)階段(EP)， 其中來自PCR產(chǎn)物的信號上升超過基底水平并以指數(shù)形式増加；(3)對數(shù)線性階段(LP)，其中由于由諸如PCR試劑消耗和檢測探針退化之類的因素引起的減小的擴增效率，信號以小于指數(shù)速率増加；(4)由于擴增反應(yīng)的漸增的放緩和最終的停止而具有該信號的余量上升的平穩(wěn)階段(PP)。然而目前沒有可用的物理模型以逼真的形式描述在PCR過程期間被檢測到的信號的發(fā)展。因此，當(dāng)前的用于核酸定量的方法要求執(zhí)行校準(zhǔn)步驟，該校準(zhǔn)步驟涉及對具有已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)/或比較的核酸序列的參照樣品執(zhí)行同樣的PCR反應(yīng)。很多時候，用作標(biāo)準(zhǔn)的核酸序列是公知的看家基因(housekeeping gene) 0簡要地概述，在實踐中，靶核酸序列以及標(biāo)準(zhǔn)和/或比較的樣品在確定的反應(yīng)條件下進行PCR，并且也稱為擴增子的PCR產(chǎn)物的形成在擴增過程的進程上受到監(jiān)控。例如，借助于熒光標(biāo)記的雜交探針或借助于檢測雙鏈 PCR產(chǎn)物的DNA插入熒光染料來實現(xiàn)PCR產(chǎn)物的檢測。確定了為獲得特定熒光閾值水平所需的擴增循環(huán)的數(shù)目，其被指定為Ct值，并將靶的Ct值與具有已知濃度稀釋系列的核酸標(biāo)準(zhǔn)的樣品的Ct值比較(絕對定量)。為確定靶的絕對量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線并將該標(biāo)準(zhǔn)曲線用于確定靶的初始濃度。可替換地，將靶的Ct值與關(guān)心的單個比較核酸的 Ct值比較0 對定量)。在該情況下，靶和比較樣品的Ct值的比值被確定并用于評估靶和比較核酸序列的初始量的比值?？傮w而言，核酸定量新方法的發(fā)展面臨許多挑戰(zhàn)，其中的某些挑戰(zhàn)源于將在以下更詳細地討論的若干應(yīng)用要求完全自動化的事實，并且其中的某些挑戰(zhàn)與校準(zhǔn)過程相關(guān)。采用Ct值確定的用于核酸定量方法所要求的校準(zhǔn)過程引入了許多潛在的限制。首先，標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢查要求另外的實驗努力和資源。其次，這些方法是基于標(biāo)準(zhǔn)和靶樣品內(nèi)的擴增效率相同的假設(shè)。重要的是，該假設(shè)通常是不正確的并因此提供了不準(zhǔn)確的來源。定量的PCR領(lǐng)域中的另外挑戰(zhàn)與在短時間間隔內(nèi)分析大量樣品的增長的需求相關(guān)。由于定量PCR的日益增長的應(yīng)用范圍要求以高通量方式分析數(shù)量非常大的樣品，例如在臨床實踐中，就需要發(fā)展能夠完全自動化且需要非常少或無需人機交互的定量的PCR方法。這在某些情況下是至關(guān)重要的，因為如果要求人機交互，高通量應(yīng)用(例如在臨床實踐中)就不能簡單地在所要求的短時間段內(nèi)進行。使用這種自動化方法能夠?qū)崿F(xiàn)的另外的優(yōu)點將是目前使用迥異的定量PCR實驗室協(xié)議的不同實驗室之間的分析數(shù)據(jù)改進的可比性?？紤]到越來越多的實驗室使用定量 PCR技術(shù)用于基礎(chǔ)研究，該問題具有至高的重要性。建立自動化方法作為定量實驗的客觀參照將通過增強實驗室間的一致性而使這些研究努力極大地受益。兩種使用Ct值確定的方法目前可用于核酸定量，這兩種方法原則上似乎適于完全自動化ニ階導(dǎo)數(shù)最大值方法和S形曲線(sigmoidal curve)擬合方法。對于ニ階導(dǎo)數(shù)最大值方法，擴增曲線的ニ階導(dǎo)數(shù)的最大值被數(shù)值地確定。相應(yīng)的循環(huán)被假設(shè)為表示指數(shù)增長階段的結(jié)束，在此反應(yīng)開始放緩至線性增長。該循環(huán)數(shù)目與Ct類似地被用于確定靶的量。對于S形曲線擬合方法，在擴增曲線上對S形函數(shù)建摸。對應(yīng)于曲線拐點的循環(huán)數(shù)目可以從模型獲得，并與Ct類似地被用于確定靶的量。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ニ階導(dǎo)數(shù)最大值方法和 S形曲線擬合方法對于要求高靈敏度的應(yīng)用具有有限的用途(JD Durtschi m, Analytical Biochemistry, 361 (2007)，第55-64頁)。此外，這兩種方法均要求校準(zhǔn)步驟。另外，在使用S形曲線擬合方法的過程中在擴增曲線上建模的S形函數(shù)極為理想化，并且決不能被視為描述在PCR過程期間檢測到的信號的發(fā)展的物理模型。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供適于要求高靈敏度的靶核酸序列的完全自動化定量的方法。另外，本發(fā)明的目的是提供不需要比較靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的方法，即，不要求校準(zhǔn)步驟的方法。此外，本發(fā)明的目的是提供ー種物理模型，其允許在擴增過程期間非常詳細地分析檢測到的信號。


圖1示出了在擴增反應(yīng)的進程上獲得的典型擴增曲線，其揭露了擴增過程的不同階段=GP=基底階段，EP=指數(shù)階段，LP=對數(shù)線性階段，PP=平穩(wěn)階段。C表示循環(huán)的數(shù)目且 Ie表示實驗者使用的圖像分析軟件所記錄的信號強度。許多這些軟件程序是本領(lǐng)域人員公知的。圖2示出了用于為擴增曲線確定模型函數(shù)IF(n)擬合的方法的示意性表達。圖3示出了相對于根據(jù)本發(fā)明確定的結(jié)果㈧繪制的一系列樣品中的靶DNA的絕對初始量(B)。分析的結(jié)果與最初呈現(xiàn)的靶DNA初始量相對應(yīng)。圖4示出了對于一系列樣品的相對于彼此繪制的根據(jù)本發(fā)明確定的參數(shù)も⑶和 α (A)0圓形表示包含靶DNA的規(guī)則樣品而正方形表示不包含靶DNA的樣品。包括規(guī)則樣品的數(shù)據(jù)點的不同簇的存在表明も和α可以用于識別并可能地排除具有不正常擴增反應(yīng)的樣品，否則其可能導(dǎo)致錯誤判斷。圖5示出了對于一系列樣品的相對于彼此繪制的根據(jù)本發(fā)明確定的參數(shù)も和ε。 菱形表示包含靶DNA的規(guī)則樣品而正方形表示不包含靶DNA的樣品。包括每個樣品類型的數(shù)據(jù)點的不同簇的存在表明も和ε可以用于識別并可能地排除具有不正常擴增反應(yīng)的樣品，否則其可能導(dǎo)致錯誤判斷。圖6Α和6Β示出了在使用兩個PCR樣品(ー個添加有49%的渣滓(feces)且另ー 個沒有添加渣滓)執(zhí)行的PCR反應(yīng)循環(huán)的進程上獲得的擴增曲線(C)、模型函數(shù)的最佳擬合 (A)以及擴增效率(B)的曲線圖。如實例4中所描述的，對于沒有渣滓的樣品(圖6A)和具有渣滓的樣品(圖6B)所確定的擴增效率的曲線圖比較示出了渣滓的存在對于擴增反應(yīng)的效率具有顯著且不利的影響圖6A中的擴增效率在1. 0處開始，而圖6B中的擴增效率在 0.51處開始。
具體實施例方式遵從本發(fā)明的核酸包括DNA、RNA以及具有改性的主鏈和/或基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的核酸。通常通過各種方法并且借助于本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的儀器由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)執(zhí)行擴增。然而，為了本發(fā)明的目的，無法直接由PCR擴增的核酸可能必須借助于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法轉(zhuǎn)錄成DNA。例如，RNA可能必須在擴增前使用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成DNA。為了允許重構(gòu)原始量的相應(yīng)核酸，這種轉(zhuǎn)錄過程必須在使能進行理由充分的假設(shè)的條件下執(zhí)行， 該假設(shè)涉及被轉(zhuǎn)錄成DNA的核酸與在轉(zhuǎn)錄進程中產(chǎn)生的DNA的量的比率。該類型的反應(yīng)條件在本領(lǐng)域中是公知的。實踐本發(fā)明的進程中擴增的每個核酸序列通常以有選擇性的方式來擴增。在PCR 期間獲得選擇性擴增的ー種方式是使用特定序列引物。這種引物的設(shè)計和使用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。為了本發(fā)明的目的，通過PCR的核酸擴增，即通過擴增反應(yīng)的核酸的產(chǎn)生，又稱為擴增子，是通過記錄與所述核酸序列的擴增相關(guān)的信號來檢測。這通常借助于熒光指示探針(此處也指定為熒光指示體或指示探針)來實現(xiàn)。這種熒光指示探針在本領(lǐng)域中是共知的。在本發(fā)明的一個實施例中，熒光指示探針包括寡核苷酸，該寡核苷酸在雜交條件下特異地結(jié)合至靶核酸序列，并在其序列的一端上攜帯有熒光基團且在其序列的另一端上攜帯有相應(yīng)的猝滅基團。在該狀態(tài)下的熒光基團和猝滅基團的緊鄰防止了熒光的發(fā)射。然而，當(dāng)熒光指示探針的中央寡核苷酸在下一個擴增循環(huán)的進程中被打破吋，熒光團和猝滅劑的接近不復(fù)存在，導(dǎo)致熒光發(fā)射。擴增產(chǎn)物量即擴增子的増加因此產(chǎn)生了熒光的成比例増加。在本發(fā)明另一個實施例中，熒光指示探針是FRET(熒光能量轉(zhuǎn)移)探針。在本發(fā)明ー個實施例(TaqMan)中，熒光指示探針是PCR引物之一。在本發(fā)明優(yōu)選實施例中，借助于熒光指示探針檢測核酸擴增。根據(jù)本發(fā)明，在擴增反應(yīng)的進程上記錄與核酸序列的擴增相關(guān)聯(lián)的信號。在擴增反應(yīng)循環(huán)的進程上記錄的信號的表達被表示為擴增曲線。通常這種信號是熒光發(fā)射；然而， 本發(fā)明也包括本領(lǐng)域中使用的其它信號?？梢杂蔁晒馊玖厢尫艧晒獍l(fā)射，若干所述熒光染料在本領(lǐng)域中是已知的。某些熒光染料具有足夠分開的吸收和發(fā)射光譜以允許在同一樣品中的并行檢測。在擴增反應(yīng)進程上的信號記錄可能被腔室中不同顏色通道之間的光學(xué)串?dāng)_干擾，該光學(xué)串?dāng)_是低于理想的光學(xué)過濾器和熒光團的結(jié)果。此外實驗裝置的外部組件的自動熒光能夠干擾信號的記錄，例如，用于反應(yīng)的塑料容器可能響應(yīng)于激發(fā)波長并發(fā)射熒光。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過本領(lǐng)域公知的方法減少由光學(xué)串?dāng)_和自動熒光所導(dǎo)致的干擾。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，在減少由光學(xué)串?dāng)_和自動熒光所導(dǎo)致的干擾之后的擴增反應(yīng)循環(huán)進程上所記錄信號的表達被表示為擴增曲線。減少由自動熒光導(dǎo)致的干擾的簡單方法是在存在容器但不存在用于擴增反應(yīng)的試劑的情況下確定實驗裝置的信號偏移。然后，針對該偏移校正擴增反應(yīng)期間記錄的信號。減少由光學(xué)串?dāng)_導(dǎo)致的干擾的簡單方法是通過測量未猝滅熒光團的已知濃度來確定描述不同顏色通道之間串?dāng)_的串?dāng)_矩陣。該串?dāng)_矩陣可以用于校正在擴增反應(yīng)期間記錄的信號。在執(zhí)行本發(fā)明的方法的進程中，定義了模型，該模型描述了擴增曲線并包括與對所記錄的信號有影響的物理量相關(guān)的至少ー個參數(shù)。該模型可以包括ー個或若干模型函數(shù)。在優(yōu)選實施例中模型包括若干模型函數(shù)。對記錄的信號有影響的物理量可以是與擴增反應(yīng)本身相關(guān)的量或是與測量裝置有關(guān)的量。在優(yōu)選的實施例中，物理量是與擴增過程期間信號噪聲的產(chǎn)生相關(guān)的。在另ー 個優(yōu)選的實施例中，物理量是與擴增過程的抑制相關(guān)的。在另ー個優(yōu)選的實施例中，物理量是與擴增過程期間熒光團的自發(fā)未猝滅相關(guān)的。在另ー個優(yōu)選的實施例中，物理量從下述選擇(i)靶核酸序列的絕對初始量，(ii)靶核酸序列的初始擴增效率，(iii)擴增反應(yīng)的抑制程度，(iv)用于擴增過程的反應(yīng)容器的信號吸收程度。在執(zhí)行本發(fā)明方法的進程中，包括至少ー個模型函數(shù)的模型被擬合到擴增曲線。 用于確定這種模型的最佳擬合的方法在本領(lǐng)域是已知的并依照所用的模型來選擇。在優(yōu)選的實施例中，這種模型的最佳擬合以如下方式來確定首先定義成本函數(shù)，例如，擬合誤差平方。該成本函數(shù)可以被加權(quán)從而強調(diào)曲線的特定部分，例如Ct周圍的數(shù)據(jù)點。然后使用迭代的Newton Raphson極小化、變步長方法來最小化該成本函數(shù)。在執(zhí)行本發(fā)明方法的進程中，在模型的最佳擬合中確認參數(shù)值。相應(yīng)的值包含這些參數(shù)關(guān)聯(lián)到的物理量的信息。在本發(fā)明優(yōu)選的實施例中，例如，在使用TaqMan熒光指示探針的環(huán)境中，定義了描述擴增曲線的以下模型函數(shù)IF(η)；選擇與對所記錄的信號有影響的物理量相關(guān)的參數(shù)作為靶核酸序列的絕對初始量為Ntl，以及參數(shù)ら、α、ε和γ :
其中
權(quán)利要求
1.從靶核酸序列的擴增曲線獲得信息的方法，包括步驟(a)定義至少ー個模型函數(shù)，該模型函數(shù)描述該擴增曲線并包含與對記錄的信號有影響的物理量相關(guān)的至少ー個參數(shù)，(b)將所述模型函數(shù)擬合到該擴增曲線，(c)通過確認導(dǎo)致該模型函數(shù)的最佳擬合的所述參數(shù)的值，獲得關(guān)于所述物理量的信
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該物理量是選自以下的物理量在擴增過程期間與信號噪聲的產(chǎn)生相關(guān)的物理量、與擴增過程的抑制相關(guān)的物理量、在擴增過程期間與熒光團的自發(fā)未猝滅相關(guān)的物理量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該物理量選自以下 靶核酸序列的絕對初始量，靶核酸序列的初始擴增效率， 擴增反應(yīng)的抑制程度，用于擴增過程的反應(yīng)容器對信號吸收的程度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中參數(shù)是靶核酸序列的絕對初始量Ntl，以及參數(shù)も、α、 ε和Y，并且其中模型函數(shù)定義為IF (η)， 其中
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的方法，進ー步包括步驟(d)，其中所獲得的信息是該擴增曲線的Ct值，其中(d)使用所述模型函數(shù)的最佳擬合來確定所述擴增曲線的Ct值。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5的方法，其中同時分析樣品中的ー個靶核酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5的方法，其中同時分析樣品中的多于ー個靶核酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7的方法，其中在減小由光學(xué)串?dāng)_和自動熒光導(dǎo)致的干擾之后，在擴增反應(yīng)的循環(huán)進程上記錄的信號的表達被用作擴增曲線。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8的方法，其中所有步驟以完全自動化的方式執(zhí)行，S卩，在PCR過程期間沒有任何人機交互。
10.一種機器可讀介質(zhì)，其上存儲有用于實施根據(jù)權(quán)利要求1至9的方法的指令。
11.一種用于核酸樣品分析的設(shè)備，其包括機器可讀存儲器裝置，該機器可讀存儲器裝置包含用于實施根據(jù)權(quán)利要求1至9的方法的信息。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種方法和裝置，該方法和裝置用于通過定義描述擴增曲線并包含與影響所記錄的信號的物理量相關(guān)的至少一個參數(shù)的至少一個模型函數(shù)，將所述模型函數(shù)擬合至該擴增曲線，并通過確認導(dǎo)致模型函數(shù)的最佳擬合的所述參數(shù)的值而獲得關(guān)于所述物理量的信息，從而從一個或多個靶核酸序列的擴增曲線獲得信息。
文檔編號G06F19/24GK102576389SQ201080047305
公開日2012年7月11日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日
發(fā)明者B.尹, J.A.H.M.卡爾曼, T.M.E.尼森 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司