一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉及其培養(yǎng)和制備普魯蘭多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏號為CCTCC?M2013611。本發(fā)明還公開了一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉的誘變篩選方法及其培養(yǎng)方法以及一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉發(fā)酵生產普魯蘭多糖的方法。應用上述茁芽短梗霉菌株GM-1發(fā)酵培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物不會因黑色素樣物質積累而呈現(xiàn)出暗綠色或者墨綠色，而是形成乳白色或淡黃色組合物。本發(fā)明的芽短梗霉菌株GM-1與常規(guī)普魯蘭糖生產菌株相比，其得到普魯蘭多糖為無色，且普魯蘭多糖的產率更高，實現(xiàn)原料利用率的提高、降低生成成本，以及滿足了食品、醫(yī)藥、環(huán)境等應用領域對無色普魯蘭糖的要求。
【專利說明】一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉及其培養(yǎng)和制備普魯蘭多糖的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于普魯蘭多糖的微生物菌種生物工程【技術領域】，具體涉及一種大量產生無色素普魯蘭多糖的誘變茁芽短梗霉菌株及發(fā)酵培養(yǎng)方法。
本發(fā)明茁芽短梗霉保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏地址是中國武漢武漢大學，保藏日期是2013年11月27日，保藏號為CCTCC M 2013611 ;保藏名稱:出芽短梗霉GM-1(Aureobasidium pullulans GM-1)。
技術背景
[0002]普魯蘭多糖是范芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)產生的胞外多糖,易溶于水，具有非常優(yōu)良的增稠作用，造膜性強、易形成良好的水溶性的可食薄膜，并且具有無毒無害、無色無味等優(yōu)良特性，常用其作為保色、保香、保鮮、抗氧化等的包裝材料。普魯蘭糖的生產及應用已經有30多年的研究歷史，日本林原公司在70年代進行中試規(guī)模工業(yè)化生產，至今一直壟斷國際市場。經過20年研究發(fā)展，國內的相關研究中篩選到了一些多糖產量高色素較低的茁芽短梗霉菌株，方宣鈞等(茁芽短梗霉菌株紫外誘變及發(fā)酵條件優(yōu)化，農業(yè)生物技術學報，1998年02期)也通過紫外照射得到變異株ZY047，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件多糖轉化率達到54.1%，但其含有色素；劉娜等(茁霉多糖生產菌的復合誘變篩選及發(fā)酵條件研究，吉林農業(yè)大學，食品科學，2005，碩士論文)研究了普魯蘭多糖生產菌種和發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定了菌種與發(fā)酵條件，雖然其色素水平低，但其普魯蘭多糖產量不高，原料利用率也低,增加了生產成本,因此使得工業(yè)化過程相當緩慢。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術問題是針對現(xiàn)有生產方法得到的普魯蘭多糖為黑色或色素較淺并且得率普遍不高的問題，通過紫外`線和亞硝基胍NTG誘變，從誘變菌株中篩選無色透明和/或顏色白而且轉化率較高的誘變菌株，獲得一種大量產生無色素普魯蘭多糖的菌株。本發(fā)明還提出一種大量生產無色素普魯蘭多糖的方法，利用CCTCC M 2013611菌株生產無色素普魯蘭糖，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，以及在發(fā)酵過程中按發(fā)酵時間對攪拌速度及通氣量進行調控，使培養(yǎng)基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生產成本，實現(xiàn)高效率、低成本、無色素的普魯蘭糖生產。
[0004]為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案是:
一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏地址是中國武漢武漢大學，保藏日期是2013年11月27日，保藏號為CCTCC M 2013611 ；所述高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉呈淡乳白色或淡乳黃色，色度以明度L值計在15以上。
[0005]一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉的誘變篩選方法，包括以下步驟:
I)茁芽短梗霉為出發(fā)菌株，采用紫外線(15W 3min)和亞硝基胍NTG(lmg/ml)復合誘變的方法對出發(fā)菌株進行處理；2)從誘變菌株中篩選無色透明或者顏色白的誘變菌株；
3)培養(yǎng)誘變菌株，檢測菌株培養(yǎng)物的色度L值，以及測定培養(yǎng)物中普魯蘭多糖的含量，并以此作為復篩的依據(jù)，獲得高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉GM-1。
[0006]一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉的培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
O菌種活化:將斜面菌種茁芽短梗霉GM-1轉接斜面PDA培養(yǎng)基，30°C活化培養(yǎng)3d ；
2)種子培養(yǎng):選取生長良好的斜面作為種子，用接種針挑一塊接入種子培養(yǎng)基中，于300C，200 士 20 rpm下培養(yǎng)48h，制得種子液；
3)發(fā)酵培養(yǎng):將上述步驟2)中的種子培養(yǎng)液以體積比5~15%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C下，220rpm振蕩培養(yǎng)5d。
[0007]為了獲得更好的技術效果，步驟2)中所述種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖20.0g/L，蛋白胨 2.0g/L,米糠 3.0g/L,草酸 0.3g/L, K2HP04 1.0g/L, NaCl 1.0g/L, MgSO 4.7H20
0.2g/L，F(xiàn)eS04 -7H20 0.01g/L,pH 6.5 ;步驟3)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:蔗糖30.0g/L,蛋白胨 5.0g/L，米糠 5.0g/L，草酸 1.0g/L，K2HP04 3.0g/L, NaCI 2.50g/L, MgSO 4.7H200.20g/L, FeS04.7H20 0.01g/L,pH6.5。
[0008]經上述過程培養(yǎng)茁芽短梗霉突變株GM-1后，得到的培養(yǎng)物呈淡乳白色或淡乳黃色，不會出現(xiàn)深綠色或者墨綠色，且培養(yǎng)物的著色度以Lab色度系統(tǒng)化得到的明度L值在15以上。
[0009]一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉發(fā)酵生產普魯蘭多糖的方法，包括以下步驟:
O制備種子培養(yǎng)基，其水溶液組成為:蔗糖20.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，米糠3.0 g/L,草酸0.3 g/L，K2HP04 1.0 g/L, NaCl 1.0 g/L, MgSO 4.7Η20 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4.7Η20 0.01g/L, pH5.5~8.0，121°C滅菌20min ;用接種環(huán)蘸取少許茁芽短梗霉GM-1接入所述種子培養(yǎng)基中，于30°C,轉速為200rpm培養(yǎng)48h,作為一級種子液；將一級種子液以體積比5%~10%的接種量接種于所述種子培養(yǎng)基中，于30°C，轉速為200rpm培養(yǎng)48h，作為二級種子液；經一級種子、二級種子逐步擴大培養(yǎng)后，作為液體種子；
2)制備發(fā)酵培養(yǎng)基，其水溶液組成為:蔗糖30.08/1，蛋白胨5.0 8/1，米糠5.0 g/L,草酸 1.0g/L，K2HP04 3.0g/L, NaCI 2.5g/L，MgSO 4.7H20 0.2g/L，F(xiàn)eSO4.7H20 0.01g/L，pH5.5，121°C滅菌20min ;按體積比2%~12%的接種量將液體種子接入發(fā)酵罐中；前24小時發(fā)酵溫度為30°C ；24小時后將溫度調整為28°C，再持續(xù)發(fā)酵120~144h ；
3)將上述得到的茁芽短梗霉突變株GM-1培養(yǎng)物在罐壓維持在0.08~0.1 MPa下保持20~30min后，用200目的過濾板進行過濾除菌，然后進行超濾濃縮，得到濃縮糖液；
4)對濃縮糖液進行噴霧干燥，得到粉末狀普魯蘭多糖。
[0010]為了獲得更好的技術效果，步驟(2)中發(fā)酵罐的工藝參數(shù)為:發(fā)酵前24h，攪拌速度150~300 rpm，通空氣量I~2L/min ；24小時后菌體濃度達到1.5~2.5 X IO8個/mL，調攪拌速度到300~600 rpm，通空氣量3~5L/min ；48h以后，攪拌速度調為300~600rpm,通空氣量5~8L/min,直至發(fā)酵結束。
[0011] 本發(fā)明的茁芽短梗霉菌株GM-1與常規(guī)普魯蘭糖生產菌株相比，本發(fā)明得到普魯蘭多糖為無色，且普魯蘭多糖的產率更高，實現(xiàn)原料利用率的提高、降低生成成本，以及滿足了食品、醫(yī)藥、環(huán)境等應用領域對無色普魯蘭糖的要求。[0012]具體實施方法
下面結合實施例具體闡述本發(fā)明。
[0013]實施例1:復合誘變處理篩選茁芽短梗霉突變株及性能 Cl)菌株
出發(fā)菌株為茁芽短梗霉(Aureobasidium pullulans ATCC 201253)，經復合誘變后的突變株為茁芽短梗霉GM-1。該突變株茁芽短梗霉突變株GM-1于2013年11月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC M 2013611。
[0014](2)菌種活化及種子培養(yǎng)
將出發(fā)菌株茁芽短梗霉(Aureobasidium pullulans ATCC 201253)轉接PDA斜面培養(yǎng)基，28~33°C恒溫培養(yǎng)3~4d，選擇生長良好的活化斜面菌種轉接于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于28~33°C 200±20rpm下培養(yǎng)36h。
[0015](3)菌種選育
以茁芽短梗霉為出發(fā)菌株進行紫外線、亞硝基胍NTG誘變，從大量的誘變菌株中篩選分泌黑色素極少而且轉化率高的誘變菌株；
O孢子懸浮液的制備將活化后的出發(fā)菌株接種至種子培養(yǎng)液中，30°C恒溫振蕩培養(yǎng)；吸取經培養(yǎng)20h后的種子培養(yǎng)液I ml, 1000Orpm下離心2min,棄上清液,加入滅菌的生理鹽水洗滌離心三次，以I ml生理鹽水重新懸浮，制成單孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)后，將孢子濃度調整到I X 106CFU/ml。
[0016]2)紫外誘變
誘變處理時取IOml孢子懸浮液放于直徑`9 cm的培養(yǎng)皿中，放入無菌攪拌鐵芯，液層厚度為2~3_，將培養(yǎng)皿放入恒溫箱中備用；將磁力攪拌器(包括轉子)放入超凈工作臺，調整高度使距15W紫外燈30cm處，隨后打開紫外燈5-30min，使其穩(wěn)定。將培養(yǎng)箱中存放的培養(yǎng)皿迅速放至磁力攪拌器上,攪拌并開始計時，分別在30sec、lmin、2min、4min、6min的時候將培養(yǎng)皿的蓋子蓋上，關閉紫外燈；然后將照射后的培養(yǎng)皿中的菌液0.2ml加入到PDA培養(yǎng)基中，振蕩均勻，于30°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)72h，挑取平板上的無色透明的菌落進行搖瓶復篩，根據(jù)檢測培養(yǎng)物明度L值在15以上，作為亞硝基胍NTG誘變的出發(fā)菌株。
[0017]3)亞硝基胍NTG誘變
在上述紫外線誘變菌株孢子懸浮液中添加亞硝基胍溶液至終濃度為lmg/ml，于28°C160rpm下培養(yǎng)2h，處理后離心分離，并反復用生理鹽水洗滌離心5次以上，最后用生理鹽水恢復原體積后稀釋IO3倍，取100 μ L誘變后菌液涂布平板培養(yǎng)；72h后，挑取平板上的無色透明的菌落進行搖瓶復篩，確定篩選培養(yǎng)物含普魯蘭糖量最高，且檢測培養(yǎng)物明度L值在15以上，由此獲得高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉突變株GM-1。
[0018](4)誘變菌株的特性
(1)菌體形態(tài):發(fā)酵液中主要呈現(xiàn)酵母樣形態(tài)，細胞橢圓形且大小均一，數(shù)個菌體可連成桿狀，菌株的繁殖方式類似于酵母的出芽生殖方式；
(2)菌落形態(tài):菌落由最初粘稠乳白色漸漸轉變?yōu)榈S色；菌落呈圓形，中心隆起，表面光滑，濕潤，質地粘稠不易挑取，生長后期有菌絲體產生；
(3)培養(yǎng)特征:28~33°C，200rpm下震蕩培養(yǎng)5d后，發(fā)酵液顏色乳白或淡黃色；
(4)可以利用的碳源:葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，果糖，可溶性淀粉，糊精等，上述氮源可以混合使用，也可單一使用；
(5)可以利用的氮源:牛肉膏、蛋白胨、米糠、玉米漿、硝酸鈉、酵母膏、硫酸銨等，上述氮源可以混合使用，也可單一使用；
實施例2芽短梗霉突變株的培養(yǎng)及性能
培養(yǎng)方法:1)將斜面菌種茁芽短梗霉突變株GM-1轉接斜面PDA培養(yǎng)基，30°C活化培養(yǎng)
3d ；
2)將茁芽短梗霉GM-1接種于含蔗糖20.0 8/1，蛋白胨2.(^/1，米糠3.0 g/L，草酸
0.3 g/L，K2HPO4L O g/L, NaCl 1.0 g/L，MgSO 4.7H20 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4.7H20 0.01 g/L, pH
6.0的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，于28°C 220rpm下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至增值穩(wěn)定期(從接種起144小時)。經誘變后的突變株GM-1發(fā)酵得到的培養(yǎng)物呈淡乳白色或淡乳黃色，而出發(fā)親本株茁芽短梗霉(Aureobasidium pullulans ATCC 201253)發(fā)酵培養(yǎng)物具有深綠色或者墨綠色。
[0019]為了測定前述培養(yǎng)物中的葡聚糖含量，以1000Orpm離心收集培養(yǎng)物上清液，加入2倍體積無水乙醇，4°C靜置12小時，于12000rpm離心10min，得到多糖沉淀，用乙醇等有機溶劑洗滌3次，在105°C下烘3h至恒重，測定其重量，作為普魯蘭多糖的量。
[0020](I)芽短梗霉突變株色素積聚性 為了將范芽短梗霉GM-1的色素積累性與親本的范芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans ATCC 201253)的色素積累性進行比較，將兩者以實施例二的培養(yǎng)方法至增殖穩(wěn)定期，該培養(yǎng)期間從接種起48小時后到144小時后分別采集培養(yǎng)物的一部分。為了對采集的培養(yǎng)物的色成分進行定性分析，使用PR-650 SpectraScan Colorimeter光譜光度計/色度計進行分析，表中表示將分析結果通過CIE (國際照明委員會)Lab色度系統(tǒng)化得到的測定值。
[0021]
【權利要求】
1.一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉，其特征在于，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏地址是中國武漢武漢大學，保藏日期是2013年11月27日，保藏號為CCTCC M 2013611。
2.權利要求1所述的高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉，其特征在于，所述高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉呈淡乳白色或淡乳黃色，色度以明度L值計在15以上。
3.一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉的誘變篩選方法，包括以下步驟: 1)茁芽短梗霉為出發(fā)菌株，采用紫外線照射和亞硝基胍NTG復合誘變的方法對出發(fā)菌株進行處理； 2)從誘變菌株中篩選無色透明或者顏色白的誘變菌株； 3)培養(yǎng)誘變菌株，檢測菌株培養(yǎng)物的色度L值，以及測定培養(yǎng)物中普魯蘭多糖的含量，并以此作為復篩的依據(jù)，獲得高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉GM-1。
4.一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉的培養(yǎng)方法，包括如下步驟: 1)菌種活化:將斜面菌種茁芽短梗霉GM-1轉接斜面PDA培養(yǎng)基，30°C活化培養(yǎng)3d； 2)種子培養(yǎng):選取生長良好的斜面作為種子，用接種針挑一塊接入種子培養(yǎng)基中，于300C，200 士 20 rpm下培養(yǎng)48h，制得種子液； 3)發(fā)酵培養(yǎng):將上述步驟2)中的種子培養(yǎng)液以體積比5~15%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C下，220rpm振蕩培養(yǎng)5d。
5.如權利要求4所述的高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟2)中所述種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖20.0g/L,蛋白胨2.0g/L,米糠3.0g/L,草酸0.3g/L, K2HPO4 1.0g/L, NaCl 1.0g/L, MgSO 4.7H20 0.2g/L，F(xiàn)eSO4.7H20 0.01g/L, pH6.5o
6.如權利要求4所述 的高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟3)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:蔗糖30.0g/L，蛋白胨5.0g/L，米糠5.0g/L，草酸1.0g/L, K2HPO4 3.0g/L, NaCI 2.50g/L, MgSO 4.7H20 0.20g/L, FeSO4.7H20 0.01g/L,pH6.5。
7.如權利要求4所述的高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟3)中得到的培養(yǎng)物呈淡乳白色或淡乳黃色，且培養(yǎng)物的著色度以Lab色度系統(tǒng)化得到的明度L值在15以上。
8.一種高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉發(fā)酵制備普魯蘭多糖的方法，包括以下步驟: O制備種子培養(yǎng)基，其水溶液組成為:蔗糖20.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，米糠3.0 g/L，草酸0.3 g/L，K2HP04 1.0 g/L, NaCl 1.0 g/L, MgSO 4.7Η20 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4.7Η20 0.01g/L, pH5.5~8.0，121°C滅菌20min ;用接種環(huán)蘸取少許茁芽短梗霉GM-1接入所述種子培養(yǎng)基中，于30°C,轉速為200rpm培養(yǎng)48h,作為一級種子液；將一級種子液以體積比5%~10%的接種量接種于所述種子培養(yǎng)基中，于30°C，轉速為200rpm培養(yǎng)48h，作為二級種子液；經一級種子、二級種子逐步擴大培養(yǎng)后，作為液體種子； 2)制備發(fā)酵培養(yǎng)基，其水溶液組成為:蔗糖30.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，米糠5.0 g/L,草酸 1.0g/L，K2HP04 3.0g/L, NaCI 2.5g/L，MgSO4.7H20 0.2g/L，F(xiàn)eSO4.7H20 0.01g/L，pH5.5，121°C滅菌20min ;按體積比2%~12%的接種量將液體種子接入發(fā)酵罐中；前24小時發(fā)酵溫度為30°C ；24小時后將溫度調整為28°C，再持續(xù)發(fā)酵120~144h ； 3)將上述得到的茁芽短梗霉突變株GM-1培養(yǎng)物在罐壓維持在0.08~0.1 MPa下保持20~30min后，用200目的過濾板進行過濾除菌，然后進行超濾濃縮，得到濃縮糖液； 4)對濃縮糖液進行噴霧干燥，得到粉末狀普魯蘭多糖。
9.如權利要求8所述的高產無色素普魯蘭多糖的茁芽短梗霉發(fā)酵制備普魯蘭多糖的方法，其特征在于，其中步驟(2)中發(fā)酵罐的工藝參數(shù)為:發(fā)酵前24h，攪拌速度150~300rpm，通空氣量I~2L/min ；24小時后菌體濃度達到1.5~2.5 X IO8個/mL，調攪拌速度到300~600 rpm，通空氣量3~5L/min ；48h以后，攪拌速度調為300~600 rpm，通空氣量5~8L/m in，直至發(fā)酵結束。
【文檔編號】C12N1/14GK103881927SQ201410076179
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權日:2014年3月4日
【發(fā)明者】袁林, 郭建軍, 張小華, 楊罡 申請人:江西省科學院微生物研究所