含油污泥中石油高效降解菌及菌組的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含油污泥中石油的高效降解菌及菌組及應(yīng)用。所述降解菌組包括兩種菌，其中一種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院研究所，保藏編號：CGMCC?NO.8646和保藏編號：CGMCC?NO.8647，名稱為谷氨酸棒狀桿菌Corynebacteriumglutamicum(RS1)。本發(fā)明還提供一種菌組，由RS3，其保藏編號CGMCC?NO.8646和RS1，其保藏編號CGMCCNO.8647組成，本發(fā)明提供的混合菌組對n-C12～n-C34的正構(gòu)烷烴均有明顯降解，通過GC-MS分析表明，對萘、苊、屈和苯并[b]熒蒽的降解能力較強(qiáng)。
【專利說明】含油污泥中石油高效降解菌及菌組的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及降解石油烴的菌株，尤其是一種含油污泥中石油高效降解菌及菌組的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]石油是當(dāng)今社會生活生產(chǎn)中必不可少的能源之一，同時也是全球公認(rèn)的對環(huán)境最具嚴(yán)重影響的污染物之一。石油的勘探、開發(fā)和加工運(yùn)輸過程中會產(chǎn)生大量含油污泥。含油污泥中通常含有烷烴、芳香烴、非烴化合物和浙青質(zhì)等物質(zhì)，會通過土壤和地下水污染生態(tài)環(huán)境威脅人類健康，因此，含油污泥的安全處置是一個重大問題。含油污泥的處理處置，主要涉及油含量的減少以及水和油泥的分離。當(dāng)前焚燒、制磚等處理方法均有一定局限性，而利用微生物對石油污染進(jìn)行降解修復(fù)安全性高、無二次污染，是一項成本低、效益高且環(huán)境友好型的處理技術(shù)。由于含油污泥成分復(fù)雜難于降解，目前國內(nèi)外對含油污泥的微生物降解修復(fù)研究相對較少。
[0003]申請者從渤海油田含油污泥中分離出二株高效石油烴降解菌，并進(jìn)一步研究菌株及菌組對含油污泥中石油烴的降解能力，以期應(yīng)用于含油污泥的微生物修復(fù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種含油污泥中石油的高效降解菌及菌組的應(yīng)用，本發(fā)明提供一種假單胞菌，以及由該假單胞菌與棒狀桿菌組成的菌組，該菌種及菌組對石油烴的降解效果明顯，大幅提高了降解率，為制備一種高效的石油污泥降解劑提聞良好的技術(shù)支持。
[0005]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是:
[0006]一種含油污泥中石油的高效降解菌，所述降解菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院研究所，保藏編號:CGMCC N0.8646,施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri,保藏日期:2013年12月27日。
[0007]而且，所述降解菌對芳香烴的降解率達(dá)到8.08%。
[0008]而且，所述降解菌對石油的降解條件為42°C、鹽度1%、pH6~10。
[0009]而且，所述對含油污泥中總石油烴的降解率為53.29%。
[0010]含油污泥中石油的高效降解菌作為含油污泥凈化劑的應(yīng)用。
[0011]一種含油污泥中石油的高效降解菌組，所述降解菌組包括兩種菌，其中一種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCjia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院研究所，保藏編號:CGMCC N0.8646，施氏假單胞菌Pseudomonasstutzeri ;保藏日期:2013年12月27日。另外一種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院研究所，保藏編號:CGMCC N0.8647,分類號為谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum,保藏日期:2013年12月27日。
[0012]而且，所述菌組對n-C12 ~n_C34的正構(gòu)烷烴均有明顯降解，且對萘、苊、屈和苯并[b]熒蒽的降解能力較強(qiáng)，分別達(dá)到44.39%,27.79%,30.78%和39.43%。
[0013]含油污泥中石油的高效降解菌組作為含油污泥凈化劑的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)是: [0015]1、本申請從渤海油田含油污泥中分離出石油烴降解菌，其保藏編號CGMCC8646，經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí),RS3對芳香烴的降解率最高，達(dá)到8.08%,該細(xì)菌30d內(nèi)對含油污泥中總石油烴(TPH)的降解率分別為53.29%，該細(xì)菌對石油的最適降解條件分別為42°C、鹽度1%、ρΗ6~10。
[0016]2、本發(fā)明還提供一種菌組，由RS3，其保藏編號CGMCC8646和RS1，其保藏編號CGMCC8647組成，本發(fā)明提供的混合菌組對n_C12~n_C34的正構(gòu)烷烴均有明顯降解，通過GC-MS分析表明，對萘、苊、屈和苯并[b]熒蒽的降解能力較強(qiáng)，分別達(dá)到44.39%,27.79%、30.78% 和 39.43%ο
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明溫度對降解率的影響；
[0018]圖2為本發(fā)明鹽度對降解率的影響；
[0019]圖3為本發(fā)明pH值對降解率的影響；
[0020]圖4為本發(fā)明TPH降解率隨時間變化；
[0021]圖5為本發(fā)明菌株對石油烴不同組分的降解效果；
[0022]圖6處理組(T)與對照組(C)的m/z85選擇離子色譜圖，圖中標(biāo)記I~23分別代表正構(gòu)烷烴n-C12~n-C34。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024]本申請通過以下方法來篩選、確認(rèn)菌株種類，同時提供該菌株的各項優(yōu)異性能，具體內(nèi)容如下:
[0025]I材料與方法
[0026]1.1含油污泥
[0027]含油污泥樣品來源于渤海油田鉆井巖屑，取自中海油渤海公司環(huán)保技術(shù)服務(wù)分公司，經(jīng)測定油泥的含水率為70.55%，pH值為6.4，鹽度3.0%。
[0028]1.2培養(yǎng)基
[0029]1.2.1 富集分離培養(yǎng)基(g/L)酵母粉 3，NaCl5, MgSO4.7Η200.25，(NH4)2SO4I,K2HPO4IO, ΚΗ2Ρ044, ρΗ7.2 ~7.4。
[0030]1.2.2斜面固體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基。
[0031]1.2.3 含油液體培養(yǎng)基(g/L)酵母粉 3，NaC15，MgSO4.7Η200.25，(NH4)2SO4I,K2HPO4IO, ΚΗ2Ρ044,原油 10，ρΗ7.2 ~7.4。
[0032]1.3降解菌的分離和形態(tài)觀察[0033](I)稱取IOg含油污泥樣品，加入40mL吐溫80-水溶液(1%。v/v)，靜置I~2h。取上層懸濁液ImL加到含有9mL吐溫水的試管中，重復(fù)以上步驟3次。分別取100 μ L菌懸液涂抹于富集固體培養(yǎng)基平板，于培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24h。
[0034](2)挑取形態(tài)不同的單獨(dú)菌落，接種于裝有50mL液體富集培養(yǎng)基的150mL錐形瓶中，每個菌種做3個平行，將錐形瓶置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中37°C、IOOrpm培養(yǎng)24h后進(jìn)行劃線分離。
[0035](3)重復(fù)步驟(2)對菌株進(jìn)行純化，直至平板上所有菌落形態(tài)一致，即為單一菌株。純化后的菌株接種于斜面固體培養(yǎng)基，4°C保存。以上實(shí)驗(yàn)均在無菌操作條件下進(jìn)行。
[0036]使用掃描電鏡(SEM)對分離菌株進(jìn)行形態(tài)觀察。
[0037]菌株采用16SrRNA基因序列分析的方法鑒定到屬。使用AXYGEN細(xì)菌DNA提取試劑盒對篩選出的兩株石油烴降解菌進(jìn)行總DNA提取，以提取的細(xì)菌總DNA作為模板，細(xì)菌16SrRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用的引物為:
[0038]27F:5/ AGAGTTTGATCATGGCTCAG3'；
[0039]1492R:5/ CTACGGTTACCTTGTTACGAC3'；
[0040]PCR 反應(yīng)體系(50 μ L)為:Μ?χ25 μ L，模板 2.0 μ L，引物各 1.0 μ L，ddH2021 μ L。 [0041]PCR 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 4min，94°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 2min，以上共進(jìn)行30個循環(huán)，72°C延伸lOmin，最后4°C保存。
[0042]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后，交由北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行純化測序。
[0043]1.4菌株的鑒定
[0044]菌株采用16SrRNA基因序列分析的方法鑒定到屬。使用AXYGEN細(xì)菌DNA提取試劑盒對篩選出的二株石油降解菌進(jìn)行總DNA提取，以提取的細(xì)菌總DNA作為模板，細(xì)菌16SrRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用的引物為:
[0045]27F:5/ AGAGTTTGATCATGGCTCAG3'；
[0046]1492R:5/ CTACGGTTACCTTGTTACGAC3'；
[0047]PCR 反應(yīng)體系(50 μ L)為:Μ?χ25 μ L，模板 2.0 μ L，引物各 1.0 μ L，ddH2021 μ L。
[0048]PCR 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 4min，94°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 2min，以上共進(jìn)行30個循環(huán)，72°C延伸lOmin，最后4°C保存。
[0049]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后，交由北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行純化測序。
[0050]1.5降解菌的最適降解條件
[0051]將活化后的降解菌接種于裝有50mL含油液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，采用單因素實(shí)驗(yàn)，在其它條件因素相同的情況下，分別改變溫度、鹽度和pH條件進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)7d，每組實(shí)驗(yàn)做三個平行，對照組不接種降解菌。采用紫外分光光度法測定培養(yǎng)基中石油含量，計算降解率Η (%):
[0052]

對照組含量-處理組含量,ΑΑη/ ( Λ Λ
η =-χ 100% Cl)

對照組含量
[0053]溫度、鹽度和pH值分別設(shè)定為以下幾個梯度:(1)溫度:22°C、27°C、32°C、37°C、42°C>47°C>50°C ；(2)鹽度:0.5%、1%、2%、3%、5%、7%、8% ; (3) pH:4、5、6、7、8、9、10、11。
[0054] 1.6降解菌對含油污泥的降解
[0055]1.6.1含油污泥總TPH的降解
[0056]將活化后的二株石油烴降解菌接種于富集液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)24h，然后將RS1，RS3和投加比例為1:1的混合菌菌液各30mL加入盛有100g左右含油污泥的燒杯中，對照組則加入等量富集液體培養(yǎng)基，每組設(shè)三個平行，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30d，每3d測定TPH質(zhì)量分?jǐn)?shù)，含油污泥的TPH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用超聲萃取-紫外分光光度法測定。
[0057]1.6.2石油烴不同組份的降解
[0058]取5g左右添加菌液處理7d的含油污泥置于具塞比色管中，分三次加入50mL 二氯甲烷(20mL、20mL、IOmL),每次超聲萃取30min，收集萃取液于圓底燒瓶中。將濾液用事先烘干的WhatmanGF/F玻璃纖維濾膜過濾，過濾后的萃取液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后定容至IOmL,氮吹至ImL用于硅膠柱層析。
[0059]層析柱內(nèi)徑Icm,高30cm,從下至上依次填入玻璃纖維,25cm硅膠和Icm無水硫酸鈉，加入ImL濾液樣品，分別用30mL正己烷、50mL正己烷-二氯甲烷(體積比1:1)洗脫，所得到的飽和烴、芳香烴組份用事先稱重的圓底燒瓶接取。將所得組份風(fēng)干后用萬分之一分析天平稱重，用重量法測得各組分含量，按照式(I)計算石油烴降解菌對飽和烴和芳香烴的降解率。
[0060]然后將稱重后的芳香烴和飽和烴組份用適量正己烷完全溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至適量后氮吹至ImL裝入樣品瓶進(jìn)行GC-MS檢測。
[0061]儀器分析條件:PAHs和正構(gòu)烷烴的分析均使用Agilent7890A氣相色譜-5975C質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行，色譜柱為DB-5MS(30mX0.25mm X 0.25 μ m)。( I )PAHs分析氣相條件:進(jìn)樣口溫度 290°C，初始溫度 70°C保持 lmin，10°C /min 升到 260°C保持 4min，5°C /min 升到 300°C保持4min。質(zhì)譜條件:傳輸線溫度280°C，離子源溫度230°C，電離方式:EI，掃描方式:SM。載氣為He，流速為lmL/min。(2)正構(gòu)烷烴的儀器分析條件為:進(jìn)樣口溫度220°C，程序升溫，傳輸線溫度250°C，離子源溫度250°C，掃描方式:fullscan。
[0062]2結(jié)果與討論
[0063]2.1降解菌的分離和形態(tài)
[0064]從含油污泥樣品中分離純化得到二株石油烴降解菌，編號為RSl和RS3。通過掃描電鏡觀察到RSl大小為0.6~0.8 μ mX 0.8~1.4 μ m，RS3大小為0.6~0.8 μ mX 1.2~
2.0ym ；RS1為橢圓形，RS3為短桿狀。
[0065]2.2菌株的16SrRNA基因鑒定
[0066]測序結(jié)果顯示兩株細(xì)菌的16SrRNA基因序列長度分別為1422bp、1415bp。將得到的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，獲得各序列的同源性信息(表1)。
[0067]表1兩株菌的16SrRNA基因序列BLAST比對結(jié)果
[0068]
【權(quán)利要求】
1.一種含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于:所述降解菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院研究所，保藏編號:CGMCC N0.8646,施氏假單胞菌Pseudomonasstutzeri。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于:所述降解菌對芳香烴的降解率達(dá)到8.08%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于:所述降解菌對石油的降解條件為42°C、鹽度1%、ρΗ6~10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于:所述對含油污泥中總石油烴的降解率為53.29%。
5.權(quán)利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌作為含油污泥凈化劑的應(yīng)用。
6.一種含油污泥中石油的高效降解菌組，其特征在于:所述降解菌組包括兩種菌，其中一種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院研究所，保藏編號:CGMCC N0.8646，施氏假單胞菌Pseudomonasstutzeri ;另外一種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院研究所，保藏編號:CGMCCN0.8647,分類號為谷氨酸棒狀桿菌Corynebacteriumglutamicum。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含油污泥中石油的高效降解菌組，其特征在于:所述菌組對n-C12~n-C34的正構(gòu)烷 烴均有明顯降解，且對萘、苊、屈和苯并[b]熒蒽的降解能力較強(qiáng)，分別達(dá)到 44.39%、27.79%、30.78% 和 39.43%。
8.權(quán)利要求6所述的含油污泥中石油的高效降解菌組作為含油污泥凈化劑的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK103981119SQ201410072227
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】劉憲斌, 任麗君, 田勝艷, 趙興貴 申請人:天津科技大學(xué)