一種基于植物cDNA文庫的基因全長cDNA的批量分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從生物中批量分離基因全長cDNA的方法。該方法包括如下步驟：1）提取生物總RNA；2）將總RNA反轉(zhuǎn)錄得到雙鏈cDNA，將所述雙鏈cDNA與文庫載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化受體菌，得到全長cDNA文庫；3）將cDNA文庫的菌液涂在向培養(yǎng)基中添加抗生素后得到的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得單菌落；4）批量挑取單菌落，分別進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，從每個(gè)單菌落中獲得所述生物的一個(gè)基因的全長cDNA序列。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的從生物中批量分離基因全長cDNA的方法，減少了傳統(tǒng)方法通過EST序列進(jìn)行RACE的成本，可快速分離到大量未知基因組物種的基因全長cDNA序列。本發(fā)明對(duì)反向遺傳學(xué)研究中篩選基因及其功能研究具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種基于植物cDNA文庫的基因全長cDNA的批量分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于植物(生物)cDNA文庫的基因全長cDNA的大規(guī)模分離方法，具體涉及一種基于植物cDNA文庫，利用鳥槍法(隨機(jī)法)測(cè)序、拼接等手段，分離植物(或其它生物)基因全長cDNA的方法，特別涉及一種未知基因組全序列的植物(或其它生物)基因全長cDNA經(jīng)濟(jì)、高效的大規(guī)模分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因的分離是進(jìn)行反向遺傳學(xué)研究的前提，是分子生物學(xué)研究中重要的步驟，有利于深入了解植物體生長發(fā)育及逆境響應(yīng)等分子機(jī)制。對(duì)于已知全基因組的物種來說，基因的分離相對(duì)簡(jiǎn)單，可通過電子克隆等手段迅速獲取基因的全長cDNA ;而對(duì)于沒有獲取全基因組的物種，特別是在分子生物學(xué)領(lǐng)域研究較少的物種(如青桿等大部分木本植物種)，則相對(duì)困難。傳統(tǒng)的方法是通過同源序列設(shè)計(jì)兼并引物，或者通過構(gòu)建cDNA文庫來進(jìn)行RACE PCR方法獲取基因全長cDNA，然而設(shè)計(jì)兼并引物難以滿足相似性較低的基因，而通過EST序列進(jìn)行RACE PCR則需要后續(xù)的引物設(shè)計(jì)、質(zhì)粒提取、PCR、轉(zhuǎn)化、測(cè)序等步驟，難以高效的分離得到基因的cDNA序列，且成本較高。急需一種可以經(jīng)濟(jì)、高效的從未知基因組全序列的植物(或其它生物)中批量分離基因全長cDNA的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種從生物中批量分離基因全長cDNA的方法。
[0004]本發(fā)明所提供的從生物中批量分離基因全長cDNA的方法，具體可包括如下步驟:
[0005](I)從生物的組織中提取總RNA ；
[0006](2)將步驟(1)獲得的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到雙鏈cDNA，將所述雙鏈cDNA與文庫載體連接，得到重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化受體菌，得到全長cDNA文庫；
[0007](3)將步驟(2)獲得的全長cDNA文庫的菌液涂在向培養(yǎng)基中添加抗生素后得到的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得單菌落；
[0008](4)批量挑取步驟(3)中的單菌落，將每個(gè)單菌落分別進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，從每個(gè)單菌落中獲得所述生物的一個(gè)基因的全長cDNA序列；
[0009]所述測(cè)序引物為位于所述重組載體中所述雙鏈cDNA上游的序列，和/或位于所述重組載體中所述雙鏈cDNA下游的序列的反向互補(bǔ)序列。
[0010]當(dāng)所述雙鏈DNA大于SOObp時(shí)，所述測(cè)序引物為雙引物，即進(jìn)行正反雙向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，進(jìn)而獲得基因全長cDNA序列；此種情況下，若所述雙鏈DNA過長，一個(gè)正向測(cè)序反應(yīng)和一個(gè)反向測(cè)序反應(yīng)無法測(cè)通需要加測(cè)時(shí)，會(huì)根據(jù)前一個(gè)測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果另行設(shè)計(jì)引物再測(cè)，直至測(cè)通為止。
[0011]當(dāng)所述雙鏈DNA小于等于SOObp時(shí)，所述測(cè)序引物為單引物，即只進(jìn)行單向測(cè)序(正向或反向)，即可獲得基因全長cDNA序列。
[0012]在所述方法的步驟(1)中，所述總RNA的0D260與0D280的比值為1.8~2.0，電泳結(jié)果28S條帶與18S條帶完整清晰，無降解。
[0013]在所述方法中，所述受體菌可為大腸桿菌。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述受體菌具體為大腸桿菌DH10B。
[0014]在所述方法中，所述文庫載體可為質(zhì)粒載體，也可為噬菌體載體。
[0015]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述文庫載體具體為PD0NR222載體。
[0016]相應(yīng)的，所述測(cè)序引物為通用引物M13，即為序列表中的序列I所示的單鏈DNA(記為M13-F)和/或序列表中序列2所示的單鏈DNA (記為M13-R)。
[0017]在所述方法的步驟(3)中，所述培養(yǎng)基為培養(yǎng)所述受體菌的培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)基為培養(yǎng)大腸桿菌的固體培養(yǎng)基，更加具體的，所述培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂15g/L。
[0018]在實(shí)際操作中，所述培養(yǎng)基需高溫(12rC，20min)滅菌、冷卻凝固后使用(滅菌之后在無菌環(huán)境中加入相應(yīng)的抗生素)。其中，抗生素的選擇取決于所述文庫載體的抗性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用的所述文庫載體為具有卡那抗性的PD0NR222載體，相應(yīng)的所述抗生素為卡那霉素；故而在所述培養(yǎng)基中加入了終濃度為0.05~0.lg/L (如0.lg/L)的卡那霉素。
[0019]在所述方法的步驟(3)中，所述培養(yǎng)的溫度為培養(yǎng)所述受體菌的溫度。在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)的溫度為培養(yǎng)大腸桿菌的的溫度，具體為37°C。
[0020]在所述方法的步驟(3)中，所述培養(yǎng)為培養(yǎng)至所述平板上每平方厘米面積上的單菌落數(shù)為2~23個(gè)(如5~20個(gè))之`間，以方便單菌落的分離。
[0021 ] 在所述方法中，所述生物為基因組序列未知的生物，可為植物、動(dòng)物或微生物。
[0022]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述生物為植物，具體為青桿。
[0023]所述方法中，獲得步驟(2)中所述的全長cDNA文庫,可采用Smart方法或Gateway方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，具體是采用Invitrogen公司生產(chǎn)的“CloneMiner cDNALibrary Construction Kit”試劑盒(其產(chǎn)品目錄號(hào)為A11180)獲得步驟(2)中所述的全長cDNA文庫的。
[0024]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的從生物中批量分離基因全長cDNA的方法，減少了傳統(tǒng)方法通過EST序列進(jìn)行RACE的成本，可快速分離到大量未知基因組物種的基因全長cDNA序列。本發(fā)明對(duì)反向遺傳學(xué)研究中篩選基因及其功能研究具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明基于cDNA文庫的批量進(jìn)行基因分離的原理示意圖。
[0026]圖2為青桿cDNA文庫經(jīng)短暫復(fù)蘇涂板后過夜生長，滿足選取單克隆菌落的要求。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0028]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029]pD0NR222載體、大腸桿菌DH10B等:購買于Invitrogen公司生產(chǎn)的“CloneMinercDNA Library Construction Kit” 試劑盒(其產(chǎn)品目錄號(hào)為 Al 1180)。
[0030]實(shí)施例1、采用本發(fā)明方法從青桿中批量分離基因全長cDNA[0031]采用本發(fā)明方法從青桿中批量分離基因全長cDNA的原理示意圖如圖1所示。
[0032]1、青桿總RNA的提取及鑒定
[0033]參照發(fā)明名稱為“一種提取裸子植物組織中RNA的方法”，申請(qǐng)?zhí)枮?00910079897.0的專利中記載的方法，提取青桿針葉與花粉的RNA中的總RNA。
[0034]通過瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度法測(cè)定RNA的純度，其中電泳的結(jié)果顯示28S與18S完整清晰，無降解；紫外分光光度值顯示0D260/0D280在1.8~2.0之間。
[0035]2、青桿全長cDNA文庫的構(gòu)建
[0036]米用Invitrogen 公司生產(chǎn)的“CloneMiner cDNA Library Construction Kit”試劑盒(其產(chǎn)品目錄號(hào)為A11180)，基于GATEWAY法構(gòu)建青桿的cDNA文庫，采用的受體菌為大腸桿菌DH10B，文庫載體為PD0NR222載體。具體操作參見試劑盒說明書進(jìn)行。
[0037](該步驟cDNA文庫的構(gòu)建也可采用Smart方法進(jìn)行)
[0038]3、單菌落分離
[0039]將步驟2獲得的cDNA文庫的部分菌液，進(jìn)行梯度稀釋(1:10:100:1000),分別涂到固體培養(yǎng)基(添加終濃度為0.lg/L的卡那霉素)平板(直徑:75mm)上，37°C過夜(10_16h)生長，計(jì)算固體平板上生長的菌落數(shù)目。選擇菌落數(shù)在I X IO2~I X IO3個(gè)的平板為宜(圖2)。每個(gè)單菌落中含有一段雙鏈DNA。
[0040]其中，所述固體 培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂15g/L。所述固體培養(yǎng)基需高溫(121°C，20min)滅菌、冷卻凝固后使用(滅菌之后在無菌環(huán)境中加入終濃度為0.lg/L的卡那霉素)。
[0041]4、隨機(jī)挑取20個(gè)單菌落，并進(jìn)行編號(hào)、用含有0.1%卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基(不含瓊脂)37°C，過夜復(fù)蘇培養(yǎng)并保種，并提取質(zhì)粒，采用通用引物M13進(jìn)行正向測(cè)序與反向測(cè)序，經(jīng)過拼接，從每個(gè)單菌落中獲取一個(gè)青桿基因的全長cDNA序列。
[0042]通用引物Ml3的正向引物的序列如序列表中序列I所示(記為Ml3-F)，反向引物的序列如序列表中序列2所示(記為M13-R)。
[0043]5、利用NCBI上的Blast工具進(jìn)行同源檢索，預(yù)測(cè)所分離基因的功能，以便進(jìn)一步進(jìn)行功能分析。
[0044]結(jié)果顯示，從20個(gè)單菌落中獲取了 20個(gè)青桿基因的全長cDNA序列(表1)。所得到的編號(hào)1-20的20個(gè)青桿基因的全長cDNA序列具體如序列表中序列3_22所示。
[0045]表1利用本發(fā)明方法從青桿中分離得到的cDNA全長的基因
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種從生物中批量分離基因全長CDNA的方法，包括如下步驟: Cl)從生物的組織中提取總RNA ； (2)將步驟(1)獲得的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到雙鏈cDNA，將所述雙鏈cDNA與文庫載體連接，得到重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化受體菌，得到全長cDNA文庫； (3)將步驟(2)獲得的全長cDNA文庫的菌液涂在向培養(yǎng)基中添加抗生素后得到的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得單菌落； (4)批量挑取步驟(3)中的單菌落，將每個(gè)單菌落分別進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，從每個(gè)單菌落中獲得所述生物的一個(gè)基因的全長cDNA序列； 所述測(cè)序引物為位于所述重組載體中所述雙鏈cDNA上游的序列，和/或位于所述重組載體中所述雙鏈cDNA下游的序列的反向互補(bǔ)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述總RNA的0D260與0D280的比值為1.8~2.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述受體菌為大腸桿菌； 所述大腸桿菌具體為大腸桿菌DH10B。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述文庫載體為質(zhì)粒載體或噬菌體載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述質(zhì)粒載體為PD0NR222載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述測(cè)序引物為序列表中的序列I所示的單鏈DNA和/或序列表中序列2所示的單鏈DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂15g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述培養(yǎng)的溫度為37 0C ； 所述培養(yǎng)為培養(yǎng)至所述平板上每平方厘米面積上的單菌落數(shù)為2-23個(gè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于:所述生物為基因組序列未知的生物； 所述生物具體為植物、動(dòng)物或微生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述植物為青桿。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103805597SQ201410056451
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月19日
【發(fā)明者】張凌云, 李長江, 孫帆, 羅朝兵 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)