1，3-二羥基丙酮高產(chǎn)菌株及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的1，3-二羥基丙酮高產(chǎn)菌株及其構(gòu)建方法，所述1,3-二羥基丙酮高產(chǎn)菌株GOX205是以氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H作為宿主，選擇質(zhì)粒pBBR1MCS-2作為載體，通過將編碼甘油脫氫酶的sldAB基因轉(zhuǎn)化進入宿主并進行表達的一種菌株，其構(gòu)建具體：（1）制備氧化葡萄糖酸桿菌染色體；（2）擴增sldAB基因；（3）pBBR1MCS-2質(zhì)粒與sldAB基因的消化；（4）DNA片段的純化回收；（5）載體pBBR1MCS-2片段和sldAB基因片段的連接；（6）質(zhì)粒的富集與提?。唬?）電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建重組菌株GOX205；（8）挑選轉(zhuǎn)化子；所述菌株通過過量表達編碼膜系甘油脫氫酶的基因sldAB提高二羥基丙酮產(chǎn)量。
【專利說明】1，3- 二羥基丙酮高產(chǎn)菌株及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是1，3-二羥基丙酮高產(chǎn)菌株及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，迅速升溫的生物柴油投資熱使生產(chǎn)過程中副產(chǎn)的甘油出現(xiàn)過剩，每生產(chǎn)IOg生物柴油就會產(chǎn)生Ig甘油，因此為這些甘油尋找新的利用途徑已引起全球的普遍關(guān)注，而利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)1，3-二羥基丙酮則是其中的一條有效途徑。
[0003]1，3-二羥基丙酮(DHA)是一種天然存在的酮糖，具有生物可降解性，且對人體和環(huán)境無毒害。DHA具有極強的防曬性，利用這一特性，國外已經(jīng)成功開發(fā)出了多種保濕防曬化妝產(chǎn)品；在醫(yī)學(xué)上已經(jīng)證明DHA可以用來治療白斑和白癜風(fēng)，且具有抗肥胖功效，還可以直接作為一種抗病毒試劑，DHA的相應(yīng)的衍生物還具有抗艾滋病病毒的作用；而且，DHA的衍生物也是有機合成化學(xué)中一類非常重要的中間體，其用途極其廣泛。
[0004]利用甘油發(fā)酵二羥基丙酮的過程中，優(yōu)良的菌種是發(fā)酵成功的前提。相對于傳統(tǒng)的菌種選育方法，基因工程手段具有目標(biāo)明確、途徑清晰的優(yōu)點，經(jīng)過基因改造的高產(chǎn)菌株將更適于工業(yè)化的生產(chǎn)過程，可降低生產(chǎn)成本，繼而實現(xiàn)經(jīng)濟效益的大幅度提升。目前國內(nèi)針對高產(chǎn)二羥基丙酮生產(chǎn)菌株的研究多集中于菌種選育，而利用基因工程手段選育DHA高產(chǎn)菌株的研究還很少，經(jīng)查新發(fā)現(xiàn)，僅華東理工大學(xué)的魏東芝等人用重組基因工程質(zhì)粒PET - gdh和pET - ndh轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建得到一株工程菌，提高了二羥基丙酮的轉(zhuǎn)化率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供1，3-二羥基丙酮高產(chǎn)菌株。
[0006]本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供所述1，3_ 二羥基丙酮高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0008]I，3_ 二羥基丙酮高產(chǎn)菌株G0X205，是以氧化葡萄糖酸桿菌(GluconobacterOXydans)ATCC621H作為宿主，選擇質(zhì)粒pBBRlMCS-2作為載體，通過將編碼甘油脫氫酶的sldAB基因轉(zhuǎn)化進入宿主并進行表達的一種菌株。
[0009]上述1，3_ 二羥基丙酮高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，具體步驟如下:
[0010](1)制備氧化葡萄糖酸桿菌染色體；
[0011](2)擴增 sldAB 基因;
[0012](3) pBBRlMCS-2 質(zhì)粒與 sldAB 基因的消化；
[0013](4) DNA片段的純化回收；
[0014](5)載體pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的連接；
[0015](6)質(zhì)粒的富集與提??；
[0016](7)電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建重組菌株G0X205 ；
[0017](8)挑選轉(zhuǎn)化子。[0018]上述1，3- 二羥基丙酮高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，具體步驟如下:
[0019](I)制備氧化葡萄糖酸桿菌染色體:將氧化葡萄糖酸桿菌接種到含有5ml甘露醇液體培養(yǎng)基的試管中，30°C條件下振蕩培養(yǎng)10-12小時；然后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移入1.5ml離心管中，12000rpm離心30-60秒后，棄上清液，沉淀用0.5ml無菌水重懸,然后12000rpm離心30-60秒，收集菌體；加190 μ I TE懸浮沉淀，并加10μ 110%SDS，I μ 120mg/ml蛋白酶K，混勻，37°C保溫 Ih ;加 30 μ 15mol/LNaCl，混勻;加 30 μ I CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C保溫20min ;加入300 μ I酹/氯仿/異戍醇(25:24:1)抽提，5000rpm離心IOmin,將上清液移至干凈離心管；加入300 μ I氯仿/異戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干凈管中；加300 μ I異丙醇,顛倒混合,室溫下靜止IOmin,沉淀DNA ；5000rpm離心IOmin,沉淀DNA,加入500 μ 170%乙醇，5000rpm離心lOmin，棄乙醇，自然風(fēng)干；溶解于20 μ 1TE，于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0020](2)擴增sldAB基因:以氧化葡萄糖酸桿菌染色體作為模板，根據(jù)氧化葡萄糖酸桿菌染色體中sldAB基因序列設(shè)計引物，上引物為sldab-fw:catggatccaacgccagtttgctctg,下引物為sldab-re:catgaattccacctccgaccgtcat分別在上下引物兩端添加Hind II1、EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切位點，以PCR方法擴增sldAB基因，PCR體系為50 μ 1:上下引物均為I μ I, 200Μ的dNTP4 μ I,緩沖液5 μ 1，步驟(1)所述氧化葡萄糖酸桿菌染色體模板為0.5 μ 1，雙蒸水38.25 μ 1，聚合酶0.25 μ I ;PCR擴增條件為:94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30sec ;55°C退火30sec，72°C延伸3min，得到PCR擴增產(chǎn)物sldAB基因；
[0021 ] (3) pBBRlMCS-2質(zhì)粒與sldAB基因的消化:將擴增的sldAB基因片段4 μ I與pBBRlMCS-2質(zhì)粒4 μ I分別用限制性內(nèi)切酶Hind II1、EcoR I各加入0.25-0.5 μ 1，IOX酶緩沖液2μ 1，用無菌水將總體積補充到20μ 1，放于37°C條件下消化1-2小時；
[0022](4) DNA片段的純化回收:將步驟(3)中的sldAB片段和載體pBBRlMCS-2的雙酶切產(chǎn)物分別從瓊脂糖凝膠上切下，分別利用試劑盒進行純化回收；首先向凝膠塊的管中加入2-5倍體積溶膠液，46-50°C水浴放置5-15分鐘，300rpm振蕩，使瓊脂糖凝膠完全溶解，然后加到一個吸附柱中，13000rpm離心5分鐘，倒掉收集管中的廢液；加入700 μ I漂洗液，13000rpm離心5分鐘后棄廢液，重復(fù)該步驟；取出吸附柱，放到離心管中，加入洗脫緩沖液30 μ 1，室溫放置I分鐘，13000rpm離心3分鐘，得到純化后的DNA片段；
[0023](5)載體pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的連接:在20 μ I連接體系中，加入2μ 110ΧΤ4連接酶緩沖液，I μ 1Τ4連接酶，載體pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的加入量分別為5-7 μ I和6-8 μ 1，加水至20 μ I體系，在16°C條件下連接2-3小時后，通過酶切驗證得到pBBRlMCS-2-sldAB質(zhì)粒；
[0024](6)質(zhì)粒的富集與提取:將經(jīng)過酶切驗證的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到提前制備成感受態(tài)的大腸桿菌DH5 α中，轉(zhuǎn)化子在LB-卡那霉素固體培養(yǎng)平板上被篩選出來，進而通過菌落PCR和雙酶切實驗進行驗證，得到pBBRlMCS-2-sldAB質(zhì)粒；利用常規(guī)方法提取質(zhì)粒；
[0025](7)電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建重組菌株G0X205:
[0026](a)制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞:將氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H接種于裝有50ml電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，將搖瓶放于30°C，200rpm的搖床中培養(yǎng)至培養(yǎng)液在600nm的吸光度達到0.4 ;將細(xì)胞通過在4°C，6000rpm條件下離心4min進行收獲，并在30ml的滅菌過的10% (v/v)甘油中重懸，細(xì)胞用冷的10% (v/v)甘油洗三次，最后重懸于2mll0% (v/v)甘油中；
[0027](b)取400μ1電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞用于電轉(zhuǎn)化，每管感受態(tài)細(xì)胞加入
1μ lpBBRlMCS-2-sldAB質(zhì)粒，用移液器輕輕吸打均勻，置冰上；
[0028](c)將要轉(zhuǎn)化的混合物加入預(yù)冷的Imm的電轉(zhuǎn)化杯中，立即按下按鈕電擊，脈沖電壓 2000ν ；
[0029](d)立即加800-1000 μ I甘露醇培養(yǎng)基到轉(zhuǎn)化杯中重懸細(xì)胞；
[0030](e)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)管中置于30°C搖床中培養(yǎng)3-5小時；？
[0031](f)吸取100-200 μ I的菌液涂布到甘露醇-卡那霉素固體培養(yǎng)基平板上，30°C條件下培養(yǎng)3-5天；
[0032](8)挑選轉(zhuǎn)化子:挑出在甘露醇-卡那霉素固體培養(yǎng)基平板上上生長的單菌落，通過菌落PCR和雙酶切實驗進行驗證得到轉(zhuǎn)化子。
[0033]本發(fā)明的有益效果是:
[0034]上述I，3- 二羥基丙酮高產(chǎn)菌株，將氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H作為宿主，選擇質(zhì)粒pBBRlMCS-2作為載體，通過將編碼甘油脫氫酶的sldAB基因轉(zhuǎn)化進入宿主并進行表達，利用氧化葡萄糖酸桿菌在進行DHA發(fā)酵生產(chǎn)過程中，膜系甘油脫氫酶所起的關(guān)鍵作用，通過過量表達編碼膜系甘油脫氫酶的基因sldAB提高二羥基丙酮產(chǎn)量，選育高甘油脫氫酶活性的菌株來提高由底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率，進而達到提高1，3-二羥基丙酮產(chǎn)量的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1:sldAB的擴增片段電泳圖；
[0036]圖2:pBBRMCS-2-sldAB 質(zhì)粒圖譜；
[0037]圖3:重組菌株G0X205與出發(fā)菌株ATCC621H生產(chǎn)二羥基丙酮比較圖，其中，圖3-1為菌株生長情況圖；圖3-2為菌株消耗甘油能力圖；3-3為菌株DHA生成情況圖。
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進一步的說明。
[0039]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0040]實施例1
[0041]1，3_ 二羥基丙酮高產(chǎn)菌株G0X205，以氧化葡萄糖酸桿菌(GluconobacterOXydans)ATCC621H作為宿主，選擇質(zhì)粒pBBRlMCS-2作為載體，通過將編碼甘油脫氫酶的sldAB基因轉(zhuǎn)化進入宿主并進行表達，具體的構(gòu)建方法如下:
[0042](1)制備氧化葡萄糖酸桿菌染色體:將氧化葡萄糖酸桿菌接種到含有5ml甘露醇液體培養(yǎng)基的試管中，30°C條件下振蕩培養(yǎng)11小時；然后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移入1.5ml離心管中，12000rpm離心50秒后,棄上清液,沉淀用0.5ml無菌水重懸,然后12000rpm離心50秒,收集菌體；加190 μ I TE懸浮沉淀，并加10μ 110%SDS，ly 120mg/ml蛋白酶K，混勻，37°C保溫 Ih ;加 30 μ 15mol/L NaCl，混勻;加 30 μ I CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C保溫 20min ;加入300 μ I酹/氯仿/異戍醇(25:24:1)抽提,5000rpm離心IOmin,將上清液移至干凈離心管；加入300 μ I氯仿/異戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干凈管中；加300 μ I異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止IOmin,沉淀DNA ；5000rpm離心IOmin,沉淀DNA,加入500 μ 170%乙醇，5000rpm離心lOmin，棄乙醇，自然風(fēng)干；溶解于20 μ 1TE，于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0043](2)擴增sldAB基因:以氧化葡萄糖酸桿菌染色體作為模板，根據(jù)氧化葡萄糖酸桿菌染色體中sldAB基因序列設(shè)計引物，上引物為sldab-fw:catggatccaacgccagtttgctctg,下引物為sldab-re:catgaattccacctccgaccgtcat分別在上下引物兩端添加Hind II1、EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切位點，以PCR方法擴增sldAB基因，PCR體系為50 μ 1:上下引物均為I μ I，200Μ的dNTP4 μ I，緩沖液5 μ I，步驟(1)所述氧化葡萄糖酸桿菌染色體模板為
0.5 μ 1，雙蒸水38.25 μ 1，聚合酶0.25 μ I ;PCR擴增條件為:94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30sec ;55°C退火30sec，72°C延伸3min，得到PCR擴增產(chǎn)物sldAB基因，見圖1 ；
[0044](3) pBBRlMCS-2質(zhì)粒與sldAB基因的消化:將擴增的sldAB基因片段4 μ I與pBBRlMCS-2質(zhì)粒4 μ I分別用限制性內(nèi)切酶Hind IILEcoR I各加入0.4 μ 1，IOX酶緩沖液
2μ 1，用無菌水將總體積補充到20 μ 1，放于37°C條件下消化1.5小時；
[0045](4) DNA片段的純化回收:將步驟(3)中的sldAB片段和載體pBBRlMCS-2的雙酶切產(chǎn)物分別從瓊脂糖凝膠上切下，分別利用試劑盒進行純化回收；首先向凝膠塊的管中加入2-5倍體積溶膠液，46-50°C水浴放置10分鐘，300rpm振蕩，使瓊脂糖凝膠完全溶解，然后加到一個吸附柱中，13000rpm離心5分鐘，倒掉收集管中的廢液；加入700 μ I漂洗液，13000rpm離心5分鐘后棄廢液，重復(fù)該步驟；取出吸附柱，放到離心管中，加入洗脫緩沖液30 μ 1，室溫放置I分鐘，13000rpm離心3分鐘，得到純化后的DNA片段；
[0046](5)載體pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的連接:在20 μ I連接體系中，加入2μ 110ΧΤ4連接酶緩沖液，I μ 1Τ4連接酶，載體pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的加入量分別為6μ I和7μ 1，加水至20 μ I體系，在16 °C條件下連接3小時后，通過酶切驗證得到 pBBRlMCS-2-sldAB 質(zhì)粒，見圖 2 ；
[0047](6)質(zhì)粒的富集與提取:將經(jīng)過酶切驗證的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到提前制備成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a中，轉(zhuǎn)化子在LB-卡那霉素固體培養(yǎng)平板(將LB-卡那霉素固體培養(yǎng)基傾倒于平皿上)上被篩選出來，進而通過菌落PCR和雙酶切實驗進行驗證，得到pBBRlMCS-2-sldAB質(zhì)粒；利用常規(guī)方法提取質(zhì)粒；
[0048](7)電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建重組菌株G0X205:
[0049](a)制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞:將氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H接種于在裝有50ml電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，將搖瓶放于30°C，200rpm的搖床中培養(yǎng)至培養(yǎng)液在600nm的吸光度達到0.4 ;將細(xì)胞通過在4°C，6000rpm條件下離心4min進行收獲，并在30ml的滅菌過的10% (v/v)甘油中重懸，細(xì)胞用冷的10% (v/v)甘油洗三次，最后重懸于2mll0% (v/v)甘油中；
[0050](b)取400μ1電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞用于電轉(zhuǎn)化，每管感受態(tài)細(xì)胞加入I μ lpBBRlMCS-2-sldAB質(zhì)粒，用移液器輕輕吸打均勻，置冰上；
[0051](c)將要轉(zhuǎn)化的混合物加入預(yù)冷的Imm的電轉(zhuǎn)化杯中，立即按下按紐電擊，脈沖電壓 2000ν ；
[0052]Cd)立即加1000 μ I甘露醇培養(yǎng)基到轉(zhuǎn)化杯中重懸細(xì)胞；
[0053](e)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)管中置于30°C搖床中培養(yǎng)4小時；？
[0054](f)吸取150 μ I的菌液涂布到甘露醇-卡那霉素固體培養(yǎng)基平板上，30°C條件下培養(yǎng)4天；
[0055](8)挑選轉(zhuǎn)化子:挑出在甘露醇-卡那霉素固體培養(yǎng)基平板上上生長的單菌落，通過菌落PCR和雙酶切實驗進行驗證得到轉(zhuǎn)化子。
[0056]實施例2
[0057]本發(fā)明中構(gòu)建的過量表達膜系甘油脫氫酶的重組菌株G0X205的發(fā)酵情況:將重組菌株G0X205在甘露醇固體培養(yǎng)基平板上劃線活化2-3次，接種1-3環(huán)到甘油初始濃度為20g/l的液體種子培養(yǎng)基中，300C，200rpm搖床中培養(yǎng)12_15h，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油初始濃度為100g/L，發(fā)酵溫度28-32°C，發(fā)酵時間52小時，跟蹤測定發(fā)酵過程中發(fā)酵液吸光度變化與甘油消耗及DHA生成情況。同時將出發(fā)菌株ATCC621H做平行對照。如圖3-1、3-2、3-3所示，實驗結(jié)果表明:在100g/L的甘油發(fā)酵液中，G0X205的生長狀況良好，DHA濃度達到94.lg/L，較之于ATCC621H提高了 19.7%，甘油殘量較之于ATCC621H 降低了 15.lg/L。
[0058]上述實施例中所用培養(yǎng)基為常規(guī)方法制備而得，具體組分如下:
[0059]1.甘露醇液體培養(yǎng)基(g/L):酵母抽提物5.0，蛋白胨3.0，甘露醇25.0 ；
[0060]甘露醇固體培養(yǎng)基:在上述甘露醇液體培養(yǎng)基中加入1.5% (w/v)瓊脂粉；
[0061]甘露醇-卡那霉素固體培養(yǎng)基:上述甘露醇固體培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌并冷卻至室溫后加入卡那霉素至終濃度為50 μ g/ml,混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中。
[0062]2.LB-卡那霉素固體培養(yǎng)基:LB固體培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌并冷卻至室溫后加入卡那霉素至終濃度為50 μ g/ml，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；所述LB固體培養(yǎng)基指在LB液體培養(yǎng)基中加入1.5% (w/v)瓊脂粉，其中，LB液體培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母抽提物5，NaCl10，ρΗ7.5。
[0063]3.電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L):甘露醇80，酵母抽提物15，MgSO4.7Η202.5，甘油0.5，CaCl2L 5 ；
[0064]4.種子培養(yǎng)基(g/L):甘油 10，酵母抽提物 20，KH2P041, MgS04.7H200.5。
[0065]5.發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油100，酵母抽提物5，CaC037。
[0066]上述參照具體 實施方式對該1，3_ 二羥基丙酮高產(chǎn)菌株及其構(gòu)建方法進行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.1, 3-二羥基丙酮高產(chǎn)菌株G0X205，其特征在于:是以氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H作為宿主，選擇質(zhì)粒pBBRlMCS-2作為載體，通過將編碼甘油脫氫酶的sldAB基因轉(zhuǎn)化進入宿主并進行表達的一種菌株。
2.權(quán)利要求1所述的1，3-二羥基丙酮高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)制備氧化葡萄糖酸桿菌染色體； (2)擴增sldAB基因； (3)pBBRlMCS-2質(zhì)粒與sldAB基因的消化； (4)DNA片段的純化回收； (5)載體pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的連接； (6)質(zhì)粒的富集與提?。? (7)電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建重組菌株G0X205； (8)挑選轉(zhuǎn)化子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的1，3-二羥基丙酮高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)制備氧化葡萄糖酸桿菌染色體:將氧化葡萄糖酸桿菌接種到含有5ml甘露醇液體培養(yǎng)基的試管中，30°C條件下振蕩培養(yǎng)10-12小時；然后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移入1.5ml離心管中，.12000rpm離心30-60秒后，棄上清液,沉淀用0.5ml無菌水重懸,然后12000rpm離心30-60秒，收集菌體;加19011 I TE懸浮沉淀，并加10μ 110%SDS，ly 120mg/ml蛋白酶K，混勻，37°C保溫 Ih ;加 30 μ 15mol/LNaCl，混勻;加 30 μ I CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C保溫 20min ;加Λ 300 μ I體積比25:24:1的酚/氯仿/異戊醇抽提，5000rpm離心lOmin，將上清液移至干凈離心管；加入300 μ I體積比24:1的氯仿/異戊醇抽提，取上清液移至干凈管中；加.300 μ I異丙醇,顛倒混合,室溫下靜止IOmin,沉淀DNA ;5000rpm離心IOmin,沉淀DNA,加入.500 μ 170%乙醇，5000rpm離心lOmin，棄乙醇，自然風(fēng)干；溶解于20 μ I TE,于_20°C保存?zhèn)溆茫? (2)擴增sldAB基因:以氧化葡萄糖酸桿菌染色體作為模板，根據(jù)氧化葡萄糖酸桿菌染色體中sldAB基因序列設(shè)計引物，上引物為sldab-fw:catggatccaacgccagtttgctctg,下引物為sldab-re:catgaattccacctccgaccgtcat分別在上下引物兩端添加Hind II1、EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切位點，以PCR方法擴增sldAB基因，PCR體系為50 μ 1:上下引物均為I μ I, 200Μ的dNTP4 μ I,緩沖液5 μ 1，步驟(1)所述氧化葡萄糖酸桿菌染色體模板為.0.5 μ 1，雙蒸水38.25 μ 1，聚合酶0.25 μ I ;PCR擴增條件為:94°C預(yù)變性4min ;94°C變性.30sec ;55°C退火30sec，72°C延伸3min，得到PCR擴增產(chǎn)物sldAB基因； (3)pBBRlMCS-2質(zhì)粒與sldAB基因的消化:將擴增的sldAB基因片段4 μ I與pBBRlMCS-2質(zhì)粒4 μ I分別用限制性內(nèi)切酶Hind II1、EcoR I各加入0.25-0.5 μ 1，IOX酶緩沖液2 μ 1，用無菌水將總體積補充到20 μ 1，放于37°C條件下消化1-2小時； (4)DNA片段的純化回收:將步驟(3)中的sldAB片段和載體pBBRlMCS-2的雙酶切產(chǎn)物分別從瓊脂糖凝膠上切下，分別利用試劑盒進行純化回收；首先向凝膠塊的管中加入.2-5倍體積溶膠液，46-50°C水浴放置5-15分鐘，300rpm振蕩，使瓊脂糖凝膠完全溶解，然后加到一個吸附柱中，13000rpm離心5分鐘，倒掉收集管中的廢液；加入700 μ I漂洗液，.13000rpm離心5分鐘后棄廢液，重復(fù)該步驟；取出吸附柱，放到離心管中，加入洗脫緩沖液.30 μ 1，室溫放置I分鐘，13000rpm離心3分鐘，得到純化后的DNA片段； (5)載體pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的連接:在20μ I連接體系中，加入.2μ 110ΧΤ4連接酶緩沖液，I μ 1Τ4連接酶，載體pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的加入量分別為5-7 μ I和6-8 μ 1，加水至20 μ I體系，在16°C條件下連接2-3小時后，通過酶切驗證得到pBBRlMCS-2-sldAB質(zhì)粒； (6)質(zhì)粒的富集與提取:將經(jīng)過酶切驗證的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到提前制備成感受態(tài)的大腸桿菌DH5 α中，轉(zhuǎn)化子在LB-卡那霉素固體培養(yǎng)平板上被篩選出來，進而通過菌落PCR和雙酶切實驗進行驗證，得到pBBRlMCS-2-sldAB質(zhì)粒；利用常規(guī)方法提取質(zhì)粒； (7)電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建重組菌株G0X205: Ca)制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞:將氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H接種于裝有50ml電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，將搖瓶放于30°C，200rpm的搖床中培養(yǎng)至培養(yǎng)液在600nm的吸光度達到0.4 ;將細(xì)胞通過在4°C, 6000rpm條件下離心4min進行收獲,并在30ml的滅菌過的.10% (v/v)甘油中重懸，細(xì)胞用冷的10% (v/v)甘油洗三次，最后重懸于2mll0% (v/v)甘油中； (b)取400μ?電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞用于電轉(zhuǎn)化，每管感受態(tài)細(xì)胞加入I μ lpBBRlMCS-2-sldAB質(zhì)粒，用移液器輕輕吸打均勻，置冰上； (c)將要轉(zhuǎn)化的混合物加入預(yù)冷的Imm的電轉(zhuǎn)化杯中，立即按下按鈕電擊，脈沖電壓.2000ν ； Cd)立即加800-1000 μ I甘露醇培養(yǎng)基到轉(zhuǎn)化杯中重懸細(xì)胞； Ce)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)管中置于30°C搖床中培養(yǎng)3-5小時； Cf)吸取100-200 μ I的菌 液涂布到甘露醇-卡那霉素固體培養(yǎng)基平板上，30°C條件下培養(yǎng)3-5天； (8)挑選轉(zhuǎn)化子:挑出在甘露醇-卡那霉素固體培養(yǎng)基平板上上生長的單菌落，通過菌落PCR和雙酶切實驗進行驗證得到轉(zhuǎn)化子。
【文檔編號】C12N1/21GK103789250SQ201410056346
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月19日
【發(fā)明者】許曉菁, 何雨晴, 夏博勛, 趙瓊 申請人:天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司