一種玉米珠心原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種玉米珠心原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法，涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域。本發(fā)明是取授粉后6天到8天的玉米珠心組織，高滲處理后酶解，然后再用含0.55M甘露醇的MMG溶液重懸，制得珠心原生質(zhì)體；最后采用PEG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。本發(fā)明操作簡單，制備珠心原生質(zhì)數(shù)量大、活性高，原生質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高，為后續(xù)基因功能分析，特別是有關(guān)細(xì)胞程序化死亡機(jī)理解析提供有力的技術(shù)支持。
【專利說明】一種玉米珠心原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域，尤其涉及的是一種玉米珠心原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物原生質(zhì)體指去除細(xì)胞壁并被質(zhì)膜所包圍的具有生活力的細(xì)胞。其結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等部分。植物原生質(zhì)體去除了細(xì)胞壁的保護(hù)，因而較易從外界攝入病毒、細(xì)菌、細(xì)胞器、細(xì)胞核、蛋白質(zhì)、核酸等。植物原生質(zhì)體這些特點(diǎn)，使其在基礎(chǔ)理論研究及生物工程技術(shù)中都有重要利用。[0003]原生質(zhì)體的制備主要包括材料選擇、材料預(yù)處理及原生質(zhì)體的分離等過程。通常選用植物幼嫩組織作為原生質(zhì)體制備材料，如幼根、子葉下胚軸、子葉、根及根毛等。研究表明不同組織原生質(zhì)體的制備效率存在差異，如子葉原生質(zhì)體制備效率高于葉、子葉下胚軸及根的原生質(zhì)體制備。原生質(zhì)體的分離前，通常會對材料進(jìn)行預(yù)處理。材料預(yù)處理目的主要是改變細(xì)胞和細(xì)胞壁的生理狀態(tài)，提高細(xì)胞壁酶解的效率，減少原生質(zhì)體損傷的。高滲處理及暗處理是材料預(yù)處理常用的方法，如在紫羅蘭原生質(zhì)體制備時(shí)，將下胚軸先甘露醇高滲處理，再進(jìn)行酶解，可提高原生質(zhì)體制備效率。原生質(zhì)體的分離主要有兩種方式:機(jī)械分離法及酶解分離法。相對于機(jī)械分離法而言，酶解分離法是大量分離原生質(zhì)體的常用方法。酶解分離原生質(zhì)體中，纖維素酶和果膠酶是酶解過程中主要兩種酶。纖維素酶主要用于酶解植物細(xì)胞壁主要成分纖維素，而果膠酶主要是用于分離酶解后原生質(zhì)體細(xì)胞。在植物原生質(zhì)體制備過程中，多種因素響原生質(zhì)體的制備效率，包括材料細(xì)胞壁的厚度，酶解液滲透壓，酶解時(shí)間，酶解過程中搖晃速度等情況。
[0004]植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化通常指原生質(zhì)體細(xì)胞吸收外源核酸等，為外源核酸等提供一個(gè)行使功能的場所。原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化是進(jìn)行下一步試驗(yàn)，特別是基因功能研究等試驗(yàn)的重要步驟。PEG (polyethyleneglycol)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體是較早發(fā)現(xiàn)并利用較多的試驗(yàn)，PEG濃度過高過低都不利于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，PEG濃度過高會加快原生質(zhì)體的融合，濃度過低轉(zhuǎn)化效率也很低，并且PEG中加入MgCl2能提高原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率。利用電擊儀電擊原生質(zhì)體是另外一種原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，M.Nishiguchi試驗(yàn)首次利用電擊轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)將煙草花葉病毒RNA轉(zhuǎn)化到了原生質(zhì)體中。R.M.Hauptmann等在雙子葉和單子葉植物中原生質(zhì)體的電擊轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了探索。此外，顯微注射轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體也是方法之一。目前，以上三種轉(zhuǎn)化方法在原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化上都有利用，而對不同的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，為提高原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率，需選擇適合本身試驗(yàn)的最佳轉(zhuǎn)化方法及體系。
[0005]植物原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化技術(shù)最為常見也最為成熟的是葉片原生質(zhì)體的制備。葉片原生質(zhì)體制備相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在對目的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位、蛋白活性、蛋白與蛋白間相互作用及基因調(diào)控都有很好利用。Lee，Y.等利用擬南芥葉片原生質(zhì)體技術(shù)，借助于熒光標(biāo)記蛋白GFP，鑒定了 At0EP7蛋白跨膜區(qū)及C端7個(gè)氨基酸在靶定到葉綠體中的重要作用。Worley, C.K.利用煙草葉片原生質(zhì)體等技術(shù)，證明生長素響應(yīng)因子PSIAA6參與生長素信號調(diào)控，該蛋白的降解為信號傳導(dǎo)過程中的必須過程。ShuichiYanagisawa等利用擬南芥葉片原生質(zhì)體相關(guān)技術(shù)，進(jìn)一步闡明了轉(zhuǎn)錄因子EIN3參與了葡萄糖和乙烯相互作用信號的傳遞。
[0006]雖然葉片原生質(zhì)體的利用在基礎(chǔ)理論研究中取得了巨大成功，但對不同生理過程及代謝途徑而言，葉片原生質(zhì)體并不是通用載體對象。
[0007]珠心是高等植物胚囊周圍的一種特殊組織。珠心在胚囊的發(fā)育過程中起了重要作用。研究報(bào)道，珠心的降解主要是為胚及胚乳提供營養(yǎng)物質(zhì)，珠心停止降解將會導(dǎo)致胚乳發(fā)育的停止。珠心也是植物細(xì)胞程序化死亡研究的理想組織，珠心組織降解過程中存在著多種細(xì)胞程序化死亡方式，這對深入研究細(xì)胞程序化死亡機(jī)理具有重要意義。目前，對胚乳發(fā)育過程了解較為詳細(xì)，但對胚乳發(fā)育調(diào)控研究還不清楚；同時(shí)，植物細(xì)胞程序化死亡機(jī)理的研究仍不清楚。珠心原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的利用將會為解決相關(guān)科學(xué)問題提供有力的技術(shù)支撐。
[0008]至今，國內(nèi)外還未曾發(fā)現(xiàn)有對珠心細(xì)胞原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化相關(guān)研究報(bào)道，由于珠心材料的特殊性，使其原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化都與葉片原生質(zhì)體制備有所不同。同時(shí)，相對于其他植物而言，玉米珠心組織發(fā)育成熟后壽命較長，組織較大，易于分析，因此選用玉米珠心組織為對象，對玉米珠心原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行摸索。該試驗(yàn)技術(shù)的成功探索，將為其他植物珠心原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化提供借鑒，同時(shí)為研究玉米胚囊發(fā)育及細(xì)胞程序化死亡提供技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種玉米珠心原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0011]一種玉米珠心原生質(zhì)體的制備方法，其步驟如下:
[0012](I)在授粉后6天到8天，取玉米珠心組織2g，加入20mL濃度為0.6M的甘露醇高滲暗處理10分鐘，去除甘露醇后加入20mL酶解液，立即用真空泵在壓力
0.04xl05Pa-0.05xl05Pa之間抽真空30min，然后酶解，酶解條件是28°C恒溫?fù)u床，80rpm黑暗情況下?lián)u4-6小時(shí)，在搖的過程中，隔一小時(shí)用手來回晃蕩兩次，使其充分酶解；
[0013](2)將(I)中酶解后的珠心混合液加入W5溶液終止酶解反應(yīng)后，80g水平離心3min,棄去上清，用4mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重懸，重懸液轉(zhuǎn)移至5mL的EP管中自然放置30分鐘；然后棄去上清，保留下面沉淀，再用2mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重懸，制得珠心原生質(zhì)體；
[0014]所述的酶解液如下表所示:[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種玉米珠心原生質(zhì)體的制備方法，其特征是，其步驟如下: (1)在授粉后6天到8天，取玉米珠心組織2g，加入20ml濃度為0.6M的甘露醇高滲暗處理10分鐘，去除甘露醇后加入20ml酶解液，立即用真空泵在壓力0.(MxlO5Pa-0.05xl05Pa之間抽真空30min，然后酶解，酶解條件是28°C恒溫?fù)u床，80rpm黑暗情況下?lián)u4_6小時(shí)，在搖的過程中，隔一小時(shí)用手來回晃蕩兩次，使其充分酶解； (2)將(I)中酶解后的珠心混合液加入W5溶液終止酶解反應(yīng)后，80g水平離心3min，棄去上清，用4mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重懸，重懸液轉(zhuǎn)移至5mL的EP管中自然放置30分鐘；然后棄去上清，保留下面沉淀，再用2mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重懸，制得玉米珠心原生質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是，所述酶解液如下表所示:

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是，所述W5溶液如下表所示:

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是，所述0.55M甘露醇的MMG溶液如下表所示:
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法制得的玉米珠心原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，在離心管中加入10μ g質(zhì)粒DNA，其體積不超過20 μ 1，再加入玉米珠心原生質(zhì)體100 μ L,輕輕混合；然后采用PEG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化,加入W5溶液終止轉(zhuǎn)化過程后，80g水平離心3min,棄去上清，用500 μ L含0.55Μ甘露醇的MMG溶液重懸培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時(shí)后進(jìn)行相應(yīng)試驗(yàn)分析。
【文檔編號】C12N15/82GK103789252SQ201410052434
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】黃玉碧, 張軍杰, 陳江, 劉漢梅, 胡育峰, 劉應(yīng), 余國武, 顧勇 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)