有用微生物和目標(biāo)物質(zhì)的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題在于提供一種菌株，所述菌株可以減少由作為中間代謝物的化合物P向代謝物M的轉(zhuǎn)換量，而且在未添加代謝物M或由代謝物M生成的最終產(chǎn)物的培養(yǎng)基中可以高效率地蓄積化合物P。根據(jù)本發(fā)明，提供一種原核生物，所述原核生物具有本說明書中規(guī)定的(a)～(d)所述的所有性質(zhì)，以調(diào)節(jié)將由碳源生成生長(zhǎng)所必須的代謝物M的生物合成途徑中作為中間代謝物的化合物P轉(zhuǎn)換成代謝物M的酶X的表達(dá)量，從而使化合物P蓄積。
【專利說明】有用微生物和目標(biāo)物質(zhì)的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于高效率地制備有機(jī)酸或氨基酸等有用物質(zhì)的微生物和使用了該 微生物的有用物質(zhì)的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 有人開發(fā)了通過導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)需求突變或代謝調(diào)節(jié)突變、或利用重組DNA技術(shù)等，獲 得高效率地制備有機(jī)酸、氨基酸、核酸、維生素等有用化合物的微生物的方法。如圖1所示， 在由碳源經(jīng)由作為中間代謝物的化合物P生成生長(zhǎng)所必須的代謝物M的生物合成途徑或代 謝途徑中，為了高效率地生產(chǎn)化合物P，經(jīng)常采用獲得營(yíng)養(yǎng)需求突變株的方法，所述營(yíng)養(yǎng)需 求突變株使將化合物P轉(zhuǎn)換成代謝物M的酶X的活性缺損。但是，使用該突變株來生產(chǎn)目 標(biāo)化合物P時(shí)，需要向培養(yǎng)基中添加代謝物M或由代謝物M生成的最終產(chǎn)物，存在著制造成 本升高的問題。
[0003] 例如，有報(bào)道稱；使用缺損了莽草酸激酶活性的大腸桿菌肢cAericAiaCO")，可 W高效率地生產(chǎn)作為圖2所示的莽草酸途徑的中間代謝物的莽草酸（專利文獻(xiàn)1、非專利文 獻(xiàn)1)。但是，使用該微生物時(shí)，除了產(chǎn)生色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的需求性W外，還產(chǎn)生對(duì) 輕基苯甲酸、對(duì)氨基苯甲酸和2, 3-二輕基苯甲酸的需求性，所W存在著需要在培養(yǎng)基中添 加該6種化合物的問題。另外，還有報(bào)道稱：使用缺損了莽草酸脫氨活性的大腸桿菌，可W 高效率地生產(chǎn)作為莽草酸途徑的中間代謝物的3-脫氨莽草酸，但該微生物也存在著產(chǎn)生 上述6種化合物的需求性的問題（專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)2)。
[0004] 還可W通過使用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基脈或己基甲賴酸等突變劑的處理 或UV或放射線的照射等突變處理、或自然突變等導(dǎo)入突變，從而導(dǎo)入減少由化合物P轉(zhuǎn)換 成代謝物M的酶X的量的突變，W減少代謝物M的生成量，由此增加化合物P的量。該種情 況下，因殘留酶X的活性，使得一部分化合物P常常會(huì)轉(zhuǎn)換成代謝物M，所W不易找到使化合 物P的生產(chǎn)量最大化的條件。
[0005] 在本發(fā)明中，公開了下述方法；通過人為地將編碼酶X的基因X的轉(zhuǎn)錄置于抑制物 的控制下W控制代謝物M的生成量，不用在培養(yǎng)基中添加代謝物M或由代謝物M生成的最 終產(chǎn)物，而高效率地生產(chǎn)化合物P，但尚未報(bào)道通過利用不是基因X的本來的啟動(dòng)子、而是 通過抑制物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制的其他啟動(dòng)子來控制基因X的轉(zhuǎn)錄量，來提高化合物P的生產(chǎn)量 的事例。
[0006] 使用微生物來制備有用化合物時(shí)，在由碳源經(jīng)由作為中間代謝物的化合物P生成 生長(zhǎng)所必須的代謝物M的生物合成途徑或代謝途徑中，往往采用由該途徑上的化合物P通 過分支的途徑生產(chǎn)該有用化合物的方法。采用該方法時(shí)，也經(jīng)常采用獲得缺損了上述酶X 的活性的營(yíng)養(yǎng)需求突變株的方法，但需要在培養(yǎng)基中添加代謝物M或由代謝物M生成的最 終產(chǎn)物，存在著制造成本升高的問題。
[0007] 關(guān)于采用具有多個(gè)分支途徑的莽草酸途徑（圖2)的目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)，例如，已知 為了使作為中間代謝物的分支酸不流入酪氨酸或苯丙氨酸的合成途徑，大多數(shù)的色氨酸生 產(chǎn)菌株具有酪氨酸和苯丙氨酸的需求性（專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)3和4)。另外，已知苯丙 氨酸生產(chǎn)菌具有酪氨酸的需求性（專利文獻(xiàn)4和5、非專利文獻(xiàn)5)。因此，制備目標(biāo)芳族氨 基酸時(shí)，需要在培養(yǎng)基中添加其他的芳族氨基酸。
[0008] 還有報(bào)道稱；通過制作使由3-脫氨莽草酸（W下簡(jiǎn)記為D服）轉(zhuǎn)換成莽草酸（代 謝物M)的酶缺損、而且使作為莽草酸途徑的起始物質(zhì)的3-脫氧-D-阿糖基庚糖麗酸-7-磯 酸（W下簡(jiǎn)記為DAHP)的生成量增加的突變株，可W生產(chǎn)約40g/L的原兒茶酸（非專利文 獻(xiàn)6)。但是，使用該突變株時(shí)，除了產(chǎn)生色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的需求性W外，還產(chǎn)生對(duì) 輕基苯甲酸、對(duì)氨基苯甲酸和2, 3-二輕基苯甲酸的需求性，因此存在著需要在培養(yǎng)基中添 加該6種化合物的問題。另外，通過向棒狀桿菌似知屬細(xì)菌（專利文獻(xiàn)6) 或短桿菌脈'Wi知C妃riw?)屬細(xì)菌（專利文獻(xiàn)7和8)中導(dǎo)入突變，也獲得了原兒茶酸生 產(chǎn)菌，但對(duì)于原兒茶酸的生產(chǎn)，該些突變株需要酪氨酸等營(yíng)養(yǎng)源。而且，該些突變株的原兒 茶酸生產(chǎn)量的最高值為約13g/l，低于上述的芳族氨基酸營(yíng)養(yǎng)需求突變株的生產(chǎn)量（專利 文獻(xiàn)8)。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)1 ;美國(guó)專利6, 472, 169 ; 專利文獻(xiàn)2 ;美國(guó)專利5, 821，266 ; 專利文獻(xiàn)3 ;日本專利第4, 305, 184號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)4 ;日本特開平5-49489號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)5 ;日本特開平5-304971號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)6 ;日本特公昭45-39036號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)7 ;日本特開昭50-89592號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)8 ;日本特開昭60-98989號(hào)公報(bào)； 非專利文獻(xiàn) 非專利文獻(xiàn) 1 ;Biotechnol.Prog. 19, 808 (2003); 非專利文獻(xiàn) 2 ;Biotechol.Bioeng. 64，61 (1999); 非專利文獻(xiàn) 3 ;Agric.Biol.Chem. 39，343 (1975); 非專利文獻(xiàn) 4;ApplEnvironMicrobiol. 65，2497 (1999); 非專利文獻(xiàn) 5 ;Agric.Biol.Chem. 37，2013 (1973); 非專利文獻(xiàn) 6J.Am.Chem.Soc. 127，2874 (2005)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 發(fā)明所要解決的課題 本發(fā)明的課題在于：提供一種獲得菌株的方法，在使用具有由碳源經(jīng)由作為中間代謝 物的化合物P生成生長(zhǎng)所必須的代謝物M的生物合成途徑或代謝途徑的微生物來生產(chǎn)化合 物P時(shí)，所述菌株可減少由化合物P向代謝物M的轉(zhuǎn)換量、而且在未添加代謝物M或由代謝 物M生成的最終產(chǎn)物的培養(yǎng)基中可W高效率地蓄積化合物P(圖1) ;W及提供根據(jù)蓄積的 化合物P通過酶Y生產(chǎn)化合物Q的方法（圖3)。
[0011] 用于解決課題的手段 本發(fā)明人在使用谷氨酸棒狀桿菌似3T網(wǎng)e/?<3c妃ri"?知ATCC13032株（W下簡(jiǎn)記為ATCC13032株）制作高效率地生產(chǎn)作為目標(biāo)物質(zhì)的D服的菌株的研究中，嘗試著 解決上述課題。首先，增強(qiáng)參與從葡萄糖到DHS(化合物巧的生物合成途徑的多種酶的表 達(dá)，再根據(jù)將編碼促進(jìn)從DHS向原兒茶酸轉(zhuǎn)換的DHS脫水酶（酶Y)的基因qsuB(cg0502)基 因的轉(zhuǎn)錄置于tuf(cg0587)基因的啟動(dòng)子（W下簡(jiǎn)記為化啟動(dòng)子）的控制下的NSH株，制 作在編碼促進(jìn)從D服向莽草酸（代謝物M)轉(zhuǎn)換的莽草酸脫氨酶（酶幻的aroE3(cgl835) 基因中導(dǎo)入了缺失突變的NSH A aroE3株時(shí)，確認(rèn)到若不添加3種芳族氨基酸（色氨酸、苯 丙氨酸和酪氨酸），則NSHAaroE3株的增殖變得極慢。通過在添加了3種芳族氨基酸和莽 草酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該N甜A aroE3株，確認(rèn)到產(chǎn)生了0. 5g/L的原兒茶酸。接下來，為了通 過vanR(cg2615)基因所編碼的抑制物（W下簡(jiǎn)記為VanR抑制物）控制活性型莽草酸脫氨 酶基因（aroE3基因）的表達(dá)，根據(jù)該N甜AaroE3株制作了在染色體中插入了將aroE3基 因與vanA(cg2616)基因的啟動(dòng)子（W下簡(jiǎn)記為VanA啟動(dòng)子）連接的DNA的N甜AaroE3_ vanE3株。發(fā)現(xiàn)該N甜A aroE3_vanE3株可W在沒有添加3種芳族氨基酸和莽草酸的合成 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而且產(chǎn)生了16. 6g/L的原兒茶酸，從而解決了本發(fā)明的課題。另外還發(fā)現(xiàn)： 在根據(jù)該N甜AaroE3株制作通過rhcR(cgl308)基因所編碼的抑制物（W下簡(jiǎn)記為化cR 抑制物）控制aroE3基因的表達(dá)的菌株時(shí)，確認(rèn)到11. 2g/L的原兒茶酸的生產(chǎn)性，通過利用 VanR抑制物W外的抑制物，也獲得了優(yōu)異的原兒茶酸的生產(chǎn)性。
[0012] 接下來，在制作除了導(dǎo)入N甜AaroE3株的aroE3基因缺失突變W外、還在編碼促 進(jìn)從D服向莽草酸（代謝物M)轉(zhuǎn)換的莽草酸脫氨酶的qsuD (cg0504)基因和編碼D服脫水 酶的qsuB基因中導(dǎo)入了缺失突變的N甜A aroE3 AqsuB AqsuD株時(shí)，確認(rèn)到若不添加3種 芳族氨基酸、維生素K2和對(duì)氨基苯甲酸，則N甜A aroE3 A qsuB A qsuD株無法增殖。通過在 加入了該些添加物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該N甜A aroE3 A qsuB A qsuD株，確認(rèn)到產(chǎn)生了7. 7g/L 的D服。按照與N甜A aroE3 A qsuB A qsuD株的構(gòu)建相同的順序，根據(jù)N甜A aroE3_va址3株， 制作了在qsuD基因和qsuB基因中導(dǎo)入了缺失突變的N甜A aroE3_va址3 A qsuB A qsuD株。 根據(jù)該N甜A aroE3_va址3 A qsuB A qsuD株制作在染色體中插入了連接有benA (cg2637)基 因的啟動(dòng)子和編碼VanR抑制物的VanR基因的DNA的化en-vanR株時(shí)，發(fā)現(xiàn)化en-vanR株 可W在不含該些添加物的合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而且可W生產(chǎn)15. 4g/L的DHS，從而解決了本 發(fā)明的課題。
[0013]目P，本發(fā)明涉及W下的（1)?（24)。
[0014] (1)原核生物，該原核生物具有下述的（a)?（d)所述的所有性質(zhì)，W調(diào)節(jié)將由碳 源生成生長(zhǎng)所必須的代謝物M的生物合成途徑中作為中間代謝物的化合物P轉(zhuǎn)換成代謝物 M的酶X的表達(dá)量，從而使化合物P蓄積， (a)在與從該原核生物所能利用的碳源到化合物P的生物合成有關(guān)的酶群中，任意一 個(gè)W上的酶的活性較該原核生物的野生株有所增強(qiáng)； 化）通過在編碼酶X的蛋白的野生型基因X的翻譯區(qū)、該基因的翻譯調(diào)節(jié)區(qū)或促進(jìn)基 因X轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)中具有1個(gè)W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突變，酶X的活性缺損 或降低； (C)利用與促進(jìn)上述基因X轉(zhuǎn)錄的本來的啟動(dòng)子不同、且轉(zhuǎn)錄被抑制物R的蛋白抑制 的啟動(dòng)子A，控制編碼活性型酶X的DNA的轉(zhuǎn)錄； (d) 具有I拷貝W上的編碼抑制物R的蛋白的基因Z，該基因的轉(zhuǎn)錄被該基因的本來的 啟動(dòng)子和/或不同于該啟動(dòng)子的誘導(dǎo)啟動(dòng)子B控制。
[0015] (2) (1)所述的原核生物，其特征在于：性質(zhì)化）所述的促進(jìn)基因X轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子 區(qū)中的取代突變是將該啟動(dòng)子的整個(gè)區(qū)域或一部分區(qū)域取代成性質(zhì)（C)所述的啟動(dòng)子A的 DNA的突變。
[0016] (3) (1)或（2)所述的原核生物，其特征在于；在上述原核生物所具有的代謝化合 物P的酶中，酶XW外的任意一個(gè)W上的代謝酶的活性缺損或降低。
[0017] (4) (1)?（3)中任一項(xiàng)所述的原核生物，其特征在于：上述啟動(dòng)子B是通過添加 選自阿魏酸、香草酸、香蘭素、苯甲酸、3-輕基苯甲酸、間苯二酷、4-輕基苯甲酸、2, 4-二輕 基苯甲酸、果糖和藏糖的化合物而誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
[0018] (5) (1)?（4)中任一項(xiàng)所述的原核生物，其特征在于：編碼上述抑制物R的蛋白 的基因Z為谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032株的vanR(cg2615)基因、pcaR(cg2624)基因、或 rhcRkgl308)基因。
[0019] (6) (1)?巧）中任一項(xiàng)所述的原核生物，其特征在于：上述啟動(dòng)子A為谷氨酸 棒狀桿菌ATCC13032株的VanA(cg2616)基因的啟動(dòng)子、PObA(cgl226)基因的啟動(dòng)子、 PC址(cg2631)基因的啟動(dòng)子、或rh地(cgl309)基因的啟動(dòng)子。
[0020] (7)化合物P的制備方法，其特征在于：在抑制了啟動(dòng)子A轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)下、在碳源 的存在下培養(yǎng)（1)?化）中任一項(xiàng)所述的原核生物。
[0021] (8)化合物P的制備方法，其特征在于：在抑制了啟動(dòng)子A轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)下、在碳源 的存在下培養(yǎng)（1)?（6)中任一項(xiàng)所述的原核生物，之后施加誘導(dǎo)啟動(dòng)子B轉(zhuǎn)錄的處理，使 抑制物R的蛋白表達(dá)量增加，從而減少代謝物M的生成量。
[0022] (9)化合物P的制備方法，其特征在于：在解除了啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄抑制的狀態(tài)下、 在碳源的存在下培養(yǎng)（1)?化）中任一項(xiàng)所述的原核生物，之后施加誘導(dǎo)啟動(dòng)子B轉(zhuǎn)錄的 處理，使抑制物R的蛋白表達(dá)量增加，從而減少代謝物M的生成量。
[002引 （10) (7)?（9)中任一項(xiàng)所述的化合物P的制備方法，其特征在于：上述化合物P和上述代謝物M的組合為下述（f)?（i)中的任意一個(gè)， (f) 化合物P為3-脫氨莽草酸、代謝物M為莽草酸； (g) 化合物P為谷氨酸、代謝物M為N-己醜谷氨酸或Y-谷氨醜磯酸； 化）化合物P為天冬氨酸、代謝物M為目-天冬氨醜磯酸； (i)化合物P為絲氨酸、代謝物M為甘氨酸。
[0024] (11) (1)?做中任一項(xiàng)所述的原核生物，其特征在于：除了具有（a)?（d)所 述的性質(zhì)W外，還具有下述的性質(zhì)（e)，W通過酶Y將蓄積的化合物P轉(zhuǎn)換成化合物Q， (e) 通過在編碼酶Y的蛋白的基因y的翻譯區(qū)、該基因的翻譯調(diào)節(jié)區(qū)或促進(jìn)基因y轉(zhuǎn) 錄的啟動(dòng)子區(qū)中具有1個(gè)W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突變，從化合物P向化合物Q 轉(zhuǎn)換的能力增強(qiáng)、或者基因y的表達(dá)受到不同于野生型的控制。
[002引（11)所述的原核生物，其特征在于：在上述原核生物所具有的代謝化合物Q的酶中，任意一個(gè)W上的代謝酶的活性缺損或降低。
[002引（蝴（11)或所述的原核生物，其特征在于：性質(zhì)（e)所述的促進(jìn)基因y轉(zhuǎn) 錄的啟動(dòng)子區(qū)中的取代突變是將該啟動(dòng)子的整個(gè)區(qū)域或一部分區(qū)域取代成不同于促進(jìn)該 基因轉(zhuǎn)錄的本來的啟動(dòng)子和啟動(dòng)子A的啟動(dòng)子C的DM的突變。
[0027] (14)(蝴所述的原核生物，其特征在于：上述啟動(dòng)子C與啟動(dòng)子B相同、或者上 述啟動(dòng)子C受到控制啟動(dòng)子B轉(zhuǎn)錄的蛋白的轉(zhuǎn)錄控制。
[0028] (15) (13)或（14)所述的原核生物，其特征在于：上述啟動(dòng)子C為誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
[0029] (16) (15)所述的原核生物，其特征在于：上述啟動(dòng)子C是通過添加選自阿魏酸、 香草酸、香蘭素、苯甲酸、3-輕基苯甲酸、間苯二酷、4-輕基苯甲酸、2, 4-二輕基苯甲酸、果 糖和藏糖的化合物而誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
[0030] (17)化合物Q的制備方法，其特征在于：在抑制了啟動(dòng)子A轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)下、在碳源 的存在下培養(yǎng)（11)?（16)中任一項(xiàng)所述的原核生物。
[0031] (18)化合物Q的制備方法，其特征在于：在抑制了啟動(dòng)子A轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)下、在碳源 的存在下培養(yǎng)（11)?（16)中任一項(xiàng)所述的原核生物，之后施加誘導(dǎo)啟動(dòng)子B轉(zhuǎn)錄的處理， 使抑制物R的蛋白表達(dá)量增加，從而減少代謝物M的生成量、并增加化合物Q的生成量。 [003引（19)化合物Q的制備方法，其特征在于：在解除了啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄抑制的狀態(tài)下、 在碳源的存在下培養(yǎng)（11)?（16)中任一項(xiàng)所述的原核生物，之后施加誘導(dǎo)啟動(dòng)子B轉(zhuǎn)錄 的處理，使抑制物R的蛋白表達(dá)量增加，從而減少代謝物M的生成量、并增加化合物Q的生 成量。
[003引 （20) (17)?（19)中任一項(xiàng)所述的化合物Q的制備方法，其特征在于：在碳源的 存在下培養(yǎng)（11)?（16)中任一項(xiàng)所述的原核生物，之后施加誘導(dǎo)上述啟動(dòng)子C轉(zhuǎn)錄的處 理，使上述酶Y的表達(dá)量增加，從而增加化合物Q的生成量。
[0034] (21) (17)?（20)中任一項(xiàng)所述的化合物Q的制備方法，其特征在于：上述化合 物P、上述化合物Q和上述代謝物M的組合為下述（j)?（W)中的任意一個(gè)， (j)化合物P為3-脫氨莽草酸、化合物Q為原兒茶酸、代謝物M為莽草酸； 化）化合物P為分支酸、化合物Q為氨茵酸、代謝物M為預(yù)苯酸； (l) 化合物P為預(yù)苯酸、化合物Q為4-輕基苯基丙麗酸、代謝物M為苯基丙麗酸； (m) 化合物P為預(yù)苯酸、化合物Q為前酪氨酸、代謝物M為苯基丙麗酸； (n) 化合物P為預(yù)苯酸、化合物Q為苯基丙麗酸、代謝物M為4-輕基苯基丙麗酸或前 酪氨酸； (O) 化合物P為2-氧代異戊酸、化合物Q為2-異丙基蘋果酸、代謝物M為額氨酸； (P) 化合物P為2-氧代異戊酸、化合物Q為額氨酸、代謝物M為2-異丙基蘋果酸； (q) 化合物P為谷氨酸、化合物Q為Y-谷氨醜磯酸、代謝物M為N-己醜谷氨酸； (r) 化合物P為谷氨酸、化合物Q為N-己醜谷氨酸、代謝物M為Y-谷氨醜磯酸； (S)化合物P為天冬氨酸、化合物Q為天冬醜胺、代謝物M為目-天冬氨醜磯酸； (t)化合物P為天冬氨酸目-半酵、化合物Q為2, 3-二氨化巧二駿酸、代謝物M為高 絲氨酸； (U) 化合物P為高絲氨酸、化合物Q為0-己醜高絲氨酸、代謝物M為高絲氨酸磯酸； (V) 化合物P為高絲氨酸、化合物Q為高絲氨酸磯酸、代謝物M為0-己醜高絲氨酸； (W) 化合物P為絲氨酸、化合物Q為0-己醜絲氨酸、代謝物M為甘氨酸。
[00巧](22) (21)的（j)所述的原兒茶酸的制備方法，其特征在于；上述酶X為莽草酸脫 氨酶，并且上述酶Y為3-脫氨莽草酸脫水酶。
[0036] (23) (22)所述的原兒茶酸的制備方法，其特征在于，選自編碼原兒茶酸2, 3-雙 加氧酶的基因、編碼原兒茶酸3, 4-雙加氧酶的基因、編碼原兒茶酸4, 5-雙加氧酶的基因 和編碼原兒茶酸脫碳酸酶的基因的至少一個(gè)基因的性質(zhì)為：通過向該基因的翻譯區(qū)或其轉(zhuǎn) 錄?翻譯調(diào)節(jié)區(qū)中導(dǎo)入1個(gè)W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突變，原兒茶酸的代謝活性 缺損或降低。
[0037] (24) (1)?（6)中任一項(xiàng)或（11)?（16)中任一項(xiàng)所述的原核生物，該原核生物 為谷氨酸棒狀桿菌或大腸桿菌。
[00測(cè)發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明，可W根據(jù)葡萄糖等碳源獲得高效率地生產(chǎn)DHS或原兒茶酸等有用有機(jī)化 合物的微生物。另外，使用本發(fā)明的微生物時(shí)，可W使用不含芳族氨基酸的培養(yǎng)基高效率地 制備DHS或原兒茶酸等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1顯示通過利用作為基因Z的產(chǎn)物的抑制物R控制酶X(使從化合物P向代謝 物M轉(zhuǎn)換的酶）的表達(dá)，制備從碳源到生長(zhǎng)所必須的代謝物M的生物合成途徑上的中間代 謝物即目標(biāo)化合物P的方法。
[0040] 圖2顯示關(guān)于從碳源開始的芳族氨基酸的生物合成的莽草酸途徑。
[0041] 圖3顯示通過用作為基因Z的產(chǎn)物的抑制物R控制酶的表達(dá)，制備從碳源到生長(zhǎng) 所必須的代謝物M的生物合成途徑上的目標(biāo)化合物P，同時(shí)通過表達(dá)使從化合物P向化合物 Q轉(zhuǎn)換的酶Y，制備目標(biāo)化合物Q的方法。
[0042] 圖4顯示通過抑制物R對(duì)啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄抑制將酶X的表達(dá)維持在低水平、并限 制代謝物M的生產(chǎn)量，從而可W高效率地生產(chǎn)化合物P。
[0043] 圖5顯示在培養(yǎng)前期通過解除抑制物R對(duì)啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄抑制使酶X正常生產(chǎn)， 但在培養(yǎng)后期通過恢復(fù)抑制物R對(duì)啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄抑制，酶X的表達(dá)量大幅減少，化合物P 蓄積。
[0044] 圖6顯示在培養(yǎng)前期由于抑制物R的量少，所W通過啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄使酶X正常 生產(chǎn)，但在培養(yǎng)后期由于抑制物R的量增加，所W酶X的表達(dá)量大幅減少，化合物P蓄積。
[0045] 圖7顯示通過處于啟動(dòng)子B的控制下的基因Z所編碼的抑制物R來抑制啟動(dòng)子的 轉(zhuǎn)錄，所W酶X的表達(dá)量大幅減少，化合物P蓄積，進(jìn)而通過作為基因Z的產(chǎn)物的酶Y的作 用將化合物P轉(zhuǎn)換成化合物Q。
[0046] 圖8顯示在培養(yǎng)前期通過解除抑制物R對(duì)啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄抑制而使酶X正常生產(chǎn)， 但在培養(yǎng)后期通過恢復(fù)抑制物R對(duì)啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄抑制，酶X的表達(dá)量大幅減少，蓄積的化 合物P通過酶Y的作用轉(zhuǎn)換成化合物Q。
[0047] 圖9顯示在培養(yǎng)前期由于抑制物R的量少，所W通過啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄使酶X正常 生產(chǎn)，但在培養(yǎng)后期由于抑制物R的量增加，所W酶X的表達(dá)量大幅減少，蓄積的化合物P 通過酶Y的作用轉(zhuǎn)換成化合物Q。
[0048] 圖10顯示在培養(yǎng)前期利用抑制物R對(duì)啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄抑制使酶X的表達(dá)維持在 低水平、并限制代謝物M的生產(chǎn)量，從而可W在使微生物增殖的同時(shí)生產(chǎn)少量的化合物P， 但在培養(yǎng)后期通過誘導(dǎo)表達(dá)將化合物P轉(zhuǎn)換成化合物Q的酶Y使酶Y的表達(dá)量增加，從而 使化合物Q的生產(chǎn)量增加。
[0049] 圖11顯示在培養(yǎng)前期通過抑制物R對(duì)啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄抑制使酶X的表達(dá)維持在 低水平、并限制代謝物M的生產(chǎn)量，從而可W在使微生物增殖的同時(shí)生產(chǎn)少量的化合物P， 但在培養(yǎng)后期通過使抑制物R誘導(dǎo)表達(dá)W增加化合物P的蓄積量，同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)將蓄積的 化合物P轉(zhuǎn)換成化合物Q的酶YW增加酶Y的表達(dá)量，從而使化合物Q的生產(chǎn)量增加。

【具體實(shí)施方式】
[0050] W下，利用圖1和圖3,對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0051] 本發(fā)明的微生物是用于高效率地制備從碳源到生長(zhǎng)所必須的代謝物M的生物合 成途徑上的中間代謝物即目標(biāo)化合物P的微生物，其具有W下所示的4個(gè)性質(zhì)（a)?（d)。 該微生物優(yōu)選為抑制物R的轉(zhuǎn)錄抑制系統(tǒng)發(fā)達(dá)W進(jìn)行基因表達(dá)控制的原核生物。
[0052] (a)在與從該微生物所能利用的碳源到化合物P的生物合成有關(guān)的酶群中，任意 一個(gè)W上的酶的活性較該原核生物的野生株有所增強(qiáng)。
[0053] 化）通過在編碼將化合物P轉(zhuǎn)換成代謝物M的酶X的蛋白的野生型基因X的翻譯 區(qū)、該基因的翻譯調(diào)節(jié)區(qū)或促進(jìn)基因X轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)中具有1個(gè)W上的核巧酸的取代、缺 失或添加的突變，酶X的活性缺損或降低。
[0054] (C)利用與促進(jìn)上述基因X轉(zhuǎn)錄的本來的啟動(dòng)子不同、且轉(zhuǎn)錄被抑制物R的蛋白 抑制的啟動(dòng)子A，控制編碼活性型酶X的DNA的轉(zhuǎn)錄。
[0055] (d)具有1拷貝W上的編碼抑制物R的蛋白的基因Z，該基因的轉(zhuǎn)錄被該基因的本 來的啟動(dòng)子和/或不同于該啟動(dòng)子的誘導(dǎo)啟動(dòng)子B控制。
[0056] 對(duì)于與從葡萄糖等碳源到化合物P的生物合成途徑有關(guān)的酶群中的任意一個(gè)W 上的酶，通過如下操作進(jìn)行酶活性的增強(qiáng)和/或酶蛋白量的增加，可W對(duì)本發(fā)明中利用的 微生物賦予性質(zhì)（a)。目P，通過利用向編碼該酶蛋白的基因的翻譯起始區(qū)導(dǎo)入突變、向該基 因的啟動(dòng)子區(qū)導(dǎo)入突變、將該啟動(dòng)子取代成其他強(qiáng)的啟動(dòng)子、對(duì)多拷貝質(zhì)粒通過克隆等擴(kuò) 增該基因、增加正向控制該基因轉(zhuǎn)錄的蛋白的表達(dá)和/或減少?缺損負(fù)向控制該基因轉(zhuǎn)錄 的蛋白的表達(dá)等方法，進(jìn)行該酶活性的增強(qiáng)和/或該酶蛋白量的增加，可W增加化合物P的 生成量。或者，當(dāng)為受到下游代謝物的反饋抑制的酶時(shí)，通過向酶蛋白中導(dǎo)入解除其反饋抑 制的氨基酸的突變，也可W增加化合物P的生成量。關(guān)于向該些DNA或蛋白中導(dǎo)入突變，可 W通過誘變處理等來進(jìn)行，但也可W利用重組DNA技術(shù)或同源重組技術(shù)來進(jìn)行。
[0057] 關(guān)于性質(zhì)化）的賦予，可W利用誘變處理或重組DNA技術(shù)等使酶X的活性缺損，但 優(yōu)選利用同源重組技術(shù)向野生型基因X的翻譯區(qū)內(nèi)導(dǎo)入缺失突變。該種情況下，若缺失整 個(gè)翻譯區(qū)，則有時(shí)會(huì)因極性效果而抑制下游的基因表達(dá)，由此希望留下翻譯區(qū)的5'側(cè)部分 和3'側(cè)部分，符合讀框地向翻譯區(qū)內(nèi)導(dǎo)入缺失突變。另外，通過向基因X的翻譯起始區(qū)周 邊或促進(jìn)基因X轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)中導(dǎo)入1個(gè)W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突變，也可 W使酶X的活性缺損。另外，通過將促進(jìn)基因X轉(zhuǎn)錄的本來的啟動(dòng)子區(qū)取代成性質(zhì)（C)所 述的啟動(dòng)子A的DNA，可W同時(shí)賦予性質(zhì)化）和性質(zhì)（C)。
[0058] 通過將編碼活性型酶X的蛋白的DNA置于轉(zhuǎn)錄被抑制物R抑制的啟動(dòng)子A的控制 下，可W賦予性質(zhì)（C)。啟動(dòng)子A是不同于促進(jìn)上述基因X轉(zhuǎn)錄的本來的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子， 并且只要轉(zhuǎn)錄被抑制物R抑制，則可W是任何的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，作為在大腸桿菌K-12株內(nèi) 被抑制物R抑制的啟動(dòng)子A,可W列舉；受到A瞻菌體的CI857基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄抑制的pL啟動(dòng)子或PR啟動(dòng)子、受到IacI基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄抑制的Iac啟動(dòng)子、或受到galR基因產(chǎn)物 的轉(zhuǎn)錄抑制的gal操縱子的啟動(dòng)子。另外，作為在ATCC13032株內(nèi)被抑制物R抑制的啟動(dòng) 子A，可W列舉；受到vanR(cg2615)基因（W下稱作VanR基因）的產(chǎn)物（W下簡(jiǎn)記為VanR 抑制物）的轉(zhuǎn)錄抑制的VanA啟動(dòng)子、受到rhcR(cgl308)基因（W下稱作rhcR基因）的產(chǎn) 物（W下簡(jiǎn)記為化CR抑制物）的轉(zhuǎn)錄抑制的rhcH(cgl309)基因（W下稱作rhcH基因） 的啟動(dòng)子（W下簡(jiǎn)記為rhcH啟動(dòng)子）、或受到pcaR(cg2624)基因（W下稱作pcaR基因） 的產(chǎn)物（W下簡(jiǎn)記為化aR抑制物）的轉(zhuǎn)錄抑制的pcal(cg2623)基因（W下稱作pcal基 因）的啟動(dòng)子（W下簡(jiǎn)記為pcal啟動(dòng)子）。需要說明的是，基因X可W使用來自本發(fā)明的 微生物的基因，也可W使用來自不同于本發(fā)明的微生物的原核生物或真核生物的基因。
[0059] 本發(fā)明的微生物因賦予性質(zhì)化）和性質(zhì)（C)，使得在通常狀態(tài)下酶X的表達(dá)量低。 但是，該微生物通過賦予性質(zhì)（a)，而具有增加化合物P的量的突變，因此可W生產(chǎn)生長(zhǎng)所 必需的量的代謝物M。當(dāng)化合物P的生成量極低、生長(zhǎng)差時(shí)，可W解除基于抑制物R的轉(zhuǎn)錄 抑制，使酶X的表達(dá)量上升，從而使該微生物的生長(zhǎng)良好。
[0060] 不僅是通過制作編碼抑制物R的蛋白的基因Z的野生型表達(dá)單元可W賦予性質(zhì) (d)，通過制作將基因Z置于不同于該基因的啟動(dòng)子的誘導(dǎo)啟動(dòng)子B的控制下的基因Z的表 達(dá)單元，也可W賦予性質(zhì)（d)。在本發(fā)明的微生物中除了插入基因Z的野生型表達(dá)單元W 夕F，還可W插入置于誘導(dǎo)啟動(dòng)子B的控制下的基因Z的表達(dá)單元。關(guān)于抑制物R，只要是來 自原核生物的抑制物，則可W使用任何的抑制物，但優(yōu)選使用通過添加誘導(dǎo)物質(zhì)或溫度變 化等可W解除抑制的抑制物。具體而言，當(dāng)使用大腸桿菌K-12株作為本發(fā)明的微生物時(shí)， 例如，可W使用下述基因所編碼的抑制物等；通過38CW上的培養(yǎng)而誘導(dǎo)的A瞻菌體的 CI857基因、通過添加乳糖而誘導(dǎo)的IacI基因、通過添加半乳糖而誘導(dǎo)的galR基因、或者通 過添加四環(huán)素而誘導(dǎo)的tetR基因。當(dāng)使用ATCC13032株作為本發(fā)明的微生物時(shí)，例如可W 使用；通過添加阿魏酸、香草酸或香蘭素來解除抑制的VanR抑制物、通過添加間苯二酷或 2, 4-二輕基苯甲酸來解除抑制的化CR抑制物、或者通過添加4-二輕基苯甲酸來解除抑制 的化aR抑制物。
[0061] 作為啟動(dòng)子B，只要是來自原核生物的誘導(dǎo)啟動(dòng)子，則可W使用任何的啟動(dòng)子。具 體而言，在大腸桿菌K-12株中表達(dá)基因Z時(shí)，可W使用A瞻菌體的pL啟動(dòng)子或PR啟動(dòng) 子、Iac啟動(dòng)子、gal操縱子的啟動(dòng)子、trp操縱子的啟動(dòng)子、或araBAD啟動(dòng)子等。另外，在 ATCC13032株中表達(dá)基因Z時(shí)，可W使用下述啟動(dòng)子：通過添加阿魏酸、香草酸或香蘭素而 誘導(dǎo)的VanA啟動(dòng)子、通過添加間苯二酷或2, 4-二輕基苯甲酸而誘導(dǎo)的rhcH啟動(dòng)子、通過 添加4-輕基苯甲酸而誘導(dǎo)的pcal啟動(dòng)子、通過添加3-輕基苯甲酸而誘導(dǎo)的nagl(c的351) 基因（W下稱作nadl基因）的啟動(dòng)子（W下簡(jiǎn)記為nagl啟動(dòng)子）、通過添加苯甲酸而誘導(dǎo) 的benA(cg2637)基因（W下稱作benA基因）的啟動(dòng)子（W下簡(jiǎn)記為benA啟動(dòng)子）、或通 過添加果糖或藏糖中的任一種而誘導(dǎo)的cg2118基因的啟動(dòng)子或ptsS(cg2925)基因（W下 稱作PtsS基因）的啟動(dòng)子。
[0062] 當(dāng)本發(fā)明的微生物具有除了酶X W外的代謝化合物P的酶活性，在化合物P的制 備中該化合物的蓄積量有可能減少時(shí)，優(yōu)選通過誘變處理或重組DNA技術(shù)，使該微生物所 具有的化合物P的代謝酶中任意一個(gè)W上的代謝酶的活性缺損或降低。
[006引本發(fā)明的微生物優(yōu)選為屬于棒狀桿菌屬似巧^^/^弘^^扣'^/曲^短桿菌屬 脈沁riuffl)、節(jié)桿菌屬地-化TO知C沁r)、類諾卡氏菌屬（Abcar出oit/aceae)、微桿 菌屬泌/cro知C沁ritt?)、鏈霉屬菌（化re/7f(9化Fees)、擬無枝酸菌屬C^fco7<3崎7sis)、紅 球菌屬（化0沁COCC化)、動(dòng)球菌屬體ineococc化)、不動(dòng)桿菌屬C^cinez^i^cz^r)、假單 胞菌屬（/?^化/offlimas)、泛菌屬（化/7拉6<3)、克雷伯氏菌屬體7e如ie77a)和埃希氏菌屬 肢'cAericAia)中的任一個(gè)屬的原核生物。進(jìn)一步優(yōu)選，本發(fā)明的微生物為在氨基酸的發(fā)酵 生產(chǎn)中經(jīng)常使用的谷氨酸棒狀桿菌或性狀已詳細(xì)解析的大腸桿菌。
[0064] 使用了本發(fā)明的微生物的化合物P的制備方法例如可W列舉；通過在含有碳源的 培養(yǎng)基中、在抑制了啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)，來制備目標(biāo)化合物P的方法。在本 發(fā)明的微生物中，由于控制酶X的表達(dá)的啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄量被抑制物R抑制在低水平，所W 代謝物M的生產(chǎn)量受到限制，可W高效率地生產(chǎn)化合物P(圖4)。
[0065] 在本發(fā)明的制備方法中，由于控制酶X的表達(dá)的啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄量低而導(dǎo)致該微 生物的生長(zhǎng)緩慢時(shí)，還可W通過將化合物P的制備步驟分成培養(yǎng)前期和培養(yǎng)后期該兩期來 制備目標(biāo)化合物P。目P，在含有碳源的培養(yǎng)基中接種該微生物后，根據(jù)抑制物R的性質(zhì)添加 誘導(dǎo)物質(zhì)或者升高或降低培養(yǎng)溫度等W解除轉(zhuǎn)錄抑制，從而增加酶X的表達(dá)量，繼續(xù)培養(yǎng)。 之后，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)期恢復(fù)抑制物R的抑制，W抑制酶X的表達(dá)，從而可W增加化合物P的生 產(chǎn)量（圖5)。使用通過添加誘導(dǎo)物質(zhì)而誘導(dǎo)的啟動(dòng)子A時(shí)，通過調(diào)節(jié)該誘導(dǎo)物質(zhì)的添加量 使在培養(yǎng)后期該誘導(dǎo)物質(zhì)耗盡，可W恢復(fù)基于抑制物R的抑制。使用通過升高或降低培養(yǎng) 溫度而誘導(dǎo)的啟動(dòng)子A時(shí)，通過將培養(yǎng)溫度恢復(fù)至抑制物R產(chǎn)生抑制的溫度，可W恢復(fù)基于 抑制物R的抑制。
[0066] 優(yōu)選通過使用將抑制物R的表達(dá)置于誘導(dǎo)啟動(dòng)子B的控制下的本發(fā)明的微生物， 將化合物P的制備步驟分成培養(yǎng)前期和培養(yǎng)后期該兩期，來制備目標(biāo)化合物P。目P，在含有 碳源的培養(yǎng)基中接種該微生物使菌體增殖，之后根據(jù)誘導(dǎo)啟動(dòng)子B的性質(zhì)添加誘導(dǎo)物質(zhì)或 者升高或降低培養(yǎng)溫度，由此激活誘導(dǎo)啟動(dòng)子B，W增加抑制物R的生成量，從而抑制代謝 物M的生產(chǎn)，增加化合物P的生產(chǎn)量（圖6)。
[0067] 如上所述，當(dāng)采用利用了本發(fā)明的微生物的制備方法時(shí)，根據(jù)該微生物的增殖狀 態(tài)或化合物P對(duì)該微生物的影響，使用相同的微生物來改變培養(yǎng)方法，從而可W容易地使 化合物P的生產(chǎn)量最大化。
[0068] 作為碳源，只要是本發(fā)明的微生物所能利用的碳源，則可W使用任何的碳源。例 女口，可W使用；葡萄糖、藏糖、果糖等糖類；己醇、甲醇等醇類；構(gòu)稼酸、蘋果酸、玻巧酸等有 機(jī)酸類；甘油、廢糖蜜等。
[0069] 化合物P只要是由碳源生成生長(zhǎng)所必須的代謝物的生物合成途徑上的代謝物即 可，可W是任何的有機(jī)化合物。例如，可W列舉DHS、谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸等。
[0070] D服可W通過控制生成莽草酸（代謝物M)的莽草酸脫氨酶（酶幻的表達(dá)來生產(chǎn)。 DHS除了可W用作抗氧化劑W外（美國(guó)專利5, 821，266)，還可用作使用微生物來制備原兒 茶酸或莽草酸等時(shí)的原料。
[0(m] 作為有用氨基酸的谷氨酸可W通過控制生成N-己醜谷氨酸（代謝物M)的N-己 醜轉(zhuǎn)移酶（酶幻或生成Y-谷氨醜磯酸（代謝物M)的Y-谷氨醜激酶（酶幻的表達(dá)來 生產(chǎn)。
[0072] 作為有用氨基酸的天冬氨酸可W通過控制生成目-天冬氨醜磯酸（代謝物M)的 天冬氨酸激酶（酶幻或生成天冬醜胺（代謝物M)的天冬醜胺合成酶（酶幻的表達(dá)來生 產(chǎn)。
[0073] 作為有用氨基酸的絲氨酸可W通過控制生成甘氨酸（代謝物M)的絲氨酸輕甲基 轉(zhuǎn)移酶（酶幻或生成0-己醜絲氨酸（代謝物M)的絲氨酸轉(zhuǎn)移酶（酶幻的表達(dá)來生產(chǎn)。
[0074] 該里，作為更具體的例子，對(duì)來自高效率地生產(chǎn)D服的ATCC13032株的菌株進(jìn)行詳 述。需要說明的是，關(guān)于ATCC13032株的基因組序列，可W從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中也 (^tionalCenterforBiotechnologyInformation,W下簡(jiǎn)記為NCBI)的GenBank(W下 簡(jiǎn)記為GB)數(shù)據(jù)庫(kù)中，作為GB登錄號(hào)BX927147而獲得。另外，與其基本相同的基因組序列 也可W作為GB登錄號(hào)NC_003450而獲得，但在本說明書中，根據(jù)GB登錄號(hào)BX927147的核 巧酸編號(hào)和基因名稱而記作核巧酸的位置和基因名稱。
[00巧]來自生產(chǎn)D服的ATCC13032株的菌株是指具有下述性質(zhì)（aa)?（dd)的微生物。
[0076] (aa)在與從該菌株所能利用的碳源到DHS(化合物巧的生物合成有關(guān)的酶群中， 任意一個(gè)W上的酶的活性較野生株有所增強(qiáng)。
[0077] 化b)通過在編碼將D服轉(zhuǎn)換成莽草酸（代謝物M)的莽草酸脫氨酶（酶幻的蛋 白的野生型基因（基因X)的翻譯區(qū)或翻譯調(diào)節(jié)區(qū)、或者促進(jìn)該基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)中具有 1個(gè)W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突變，由DHS向莽草酸轉(zhuǎn)換的能力缺損或降低。就 ATCC13032株而言，作為編碼活性型莽草酸脫氨酶的基因，有aroE3(cgl835)基因（互補(bǔ)鏈 核巧酸編號(hào)1，726, 078?1，726, 908的DNA區(qū)）、aroEl(cgl283)基因（互補(bǔ)鏈核巧酸編號(hào) 1，182, 337 ?1，183, 143 的DNA區(qū)）和qsuD(cg0504)基因（核巧酸編號(hào) 446, 537 ?447, 388 的DNA區(qū)）該3種，但通過向在由D服向莽草酸轉(zhuǎn)換中發(fā)揮主要作用的aroE3基因中導(dǎo)入 突變，使該基因的活性型莽草酸脫氨酶的表達(dá)缺損或降低，也可W賦予性質(zhì)化。而且，除了 aroE3基因的突變W外，對(duì)于qsuD基因和/或aroEl基因，通過導(dǎo)入使該基因的活性型莽草 酸脫氨酶的表達(dá)缺損或降低的突變，也可W賦予性質(zhì)化。
[0078] (CC)通過不同于促進(jìn)上述基因X轉(zhuǎn)錄的本來的啟動(dòng)子、且轉(zhuǎn)錄被抑制物R的蛋白 抑制的啟動(dòng)子A來控制編碼活性型酶X的DNA的轉(zhuǎn)錄。
[0079] (dd)具有1拷貝W上的編碼抑制物R的蛋白的基因Z，該基因的轉(zhuǎn)錄受到該基因 的本來的啟動(dòng)子和/或不同于該啟動(dòng)子的誘導(dǎo)啟動(dòng)子B的控制。
[0080] 如上所述，作為抑制物R，可W使用通過添加阿魏酸、香草酸或香蘭素來解除抑制 的VanR抑制物、通過添加間苯二酷或2, 4-二輕基苯甲酸來解除抑制的化CR抑制物、或通 過添加4-二輕基苯甲酸來解除抑制的化aR抑制物。
[00則作為啟動(dòng)子A，作為在ATCC13032株內(nèi)被抑制物R抑制的啟動(dòng)子A，可W列舉讀到VanR抑制物的轉(zhuǎn)錄抑制的VanA啟動(dòng)子、受到化cR抑制物的轉(zhuǎn)錄抑制的rh地啟動(dòng)子、或者 受到化aR抑制物的轉(zhuǎn)錄抑制的pcal基因的啟動(dòng)子。
[0082] 作為啟動(dòng)子B，可W使用；通過添加阿魏酸、香草酸或香蘭素而誘導(dǎo)的VanA啟動(dòng) 子、通過添加間苯二酷或2, 4-二輕基苯甲酸而誘導(dǎo)的rhcH啟動(dòng)子、通過添加4-輕基苯甲 酸而誘導(dǎo)的pcal啟動(dòng)子、通過添加3-輕基苯甲酸而誘導(dǎo)的nagl啟動(dòng)子、通過添加苯甲酸 而誘導(dǎo)的benA啟動(dòng)子、或者通過添加果糖或藏糖中的任一種而誘導(dǎo)的cg2118基因的啟動(dòng) 子或PtsS啟動(dòng)子。
[0083] 通過將促進(jìn)編碼莽草酸脫氨酶（酶幻的蛋白的aroE3基因（基因X)轉(zhuǎn)錄的本來 的啟動(dòng)子區(qū)取代成性質(zhì)（CC)所述的啟動(dòng)子A的DNA，可W同時(shí)賦予性質(zhì)化b)和性質(zhì)（CC)。
[0084] 關(guān)于上述性質(zhì)（aa)的賦予，根據(jù)公知的經(jīng)驗(yàn)，只要導(dǎo)入強(qiáng)化由DAHP生成畑S的途 徑的突變、或增加DAHP的生成量的突變即可。
[00財(cái) DAHP通過3-脫氨奎尼酸合成酶轉(zhuǎn)換成3-脫氨奎尼酸（W下簡(jiǎn)記為D冊(cè))，D冊(cè)再 通過D冊(cè)脫水酶轉(zhuǎn)換成D服。因此，通過向編碼D冊(cè)合成酶的基因aroB(cgl827)基因 下稱作aroB基因）和/或編碼D冊(cè)脫水酶的aroD(cg0503)基因（W下稱作aroD基因）的 轉(zhuǎn)錄?翻譯調(diào)節(jié)區(qū)中導(dǎo)入突變，可W增強(qiáng)D冊(cè)合成酶和/或D冊(cè)脫水酶的表達(dá)量，增加D服 量。例如，通過將促進(jìn)aroB基因和/或aroD基因的轉(zhuǎn)錄的本來的啟動(dòng)子取代成啟動(dòng)子活 性強(qiáng)的化啟動(dòng)子，可W增加D服量。
[0086] 另外，還可W通過增加DAHP量來增加D服量。作為增加DAHP量的方法，可W列舉 下述方法；解除芳族氨基酸對(duì)DAHP合成酶的反饋抑制、增強(qiáng)DAHP合成酶的表達(dá)量、或者增 加作為DAHP合成酶底物的赤薛糖-4-磯酸（W下簡(jiǎn)記為E4巧或磯酸帰醇式丙麗酸（W下 簡(jiǎn)記為陽巧的量。
[0087]DAHP合成酶往往會(huì)受到色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的反饋抑制。已知通過向DAHP 合成酶中導(dǎo)入氨基取代突變等可W解除反饋抑制，因此向aroF(cgll29)基因（W下稱作 aroF基因）和aroG(cg2391)基因（W下稱作aroG基因）等DAHP合成酶基因中導(dǎo)入突變， 可W使DAHP量增加。
[008引作為增強(qiáng)DAHP合成酶的表達(dá)量的方法，可W列舉向編碼DAHP合成酶的基因的轉(zhuǎn) 錄?翻譯調(diào)節(jié)區(qū)導(dǎo)入突變的方法。例如，通過將促進(jìn)編碼DAHP合成酶的基因轉(zhuǎn)錄的本來的 啟動(dòng)子取代成化啟動(dòng)子，可W增加DAHP量。
[0089] 作為增加DAHP合成酶底物即E4P的量的方法，可W列舉：向編碼轉(zhuǎn)麗醇酶的 tkt(cgl774)基因（W下稱作tkt基因）、編碼轉(zhuǎn)酵醇酶的tal(cgl776)基因（W下稱作 cgl776基因）、或編碼葡萄糖-6-磯酸1-脫氨酶的ZWf(cgl778)基因等與戊糖磯酸途徑有 關(guān)的酶基因的轉(zhuǎn)錄?翻譯調(diào)節(jié)區(qū)導(dǎo)入突變W增強(qiáng)該基因的表達(dá)的方法。
[0090] 另外，作為增加DAHP合成酶底物即陽P的量的方法，可W列舉；向編碼陽P合成酶 的pps(cg0644)基因或編碼PEP駿激酶的pck(cg3169)基因的轉(zhuǎn)錄?翻譯調(diào)節(jié)區(qū)導(dǎo)入突變 W增強(qiáng)該基因的表達(dá)的方法。
[0091] 而且，通過向編碼丙麗酸激酶的pyk(cg2291)基因、編碼陽P駿化酶的 ppc(cgl787)基因、或編碼參與葡萄糖等糖的攝入的磯酸轉(zhuǎn)移酶的基因組（cg2117基因等） 的任一個(gè)基因的翻譯區(qū)或該基因的轉(zhuǎn)錄?翻譯調(diào)節(jié)區(qū)導(dǎo)入突變，并抑制PEP的轉(zhuǎn)換，也可W 增加陽P的量。
[0092] 可W向單獨(dú)的基因中導(dǎo)入突變W賦予上述性質(zhì)（aa)，但為了進(jìn)一步提高畑S的生 成量，優(yōu)選向上述基因中的多個(gè)基因中導(dǎo)入突變。
[0093] 來自具有上述的性質(zhì)（aa)?（dd)的ATCC13032株的菌株根據(jù)葡萄糖等碳源可W 生產(chǎn)D服。由于編碼D冊(cè)脫水酶的aroD基因與編碼將D服轉(zhuǎn)換成原兒茶酸的D服脫水酶的 qsuB(cg0502)基因（W下稱作qsuB基因）形成操縱子，所W為了賦予性質(zhì)（aa)而通過啟 動(dòng)子取代來增加aroD基因的表達(dá)時(shí)，qsuB基因的表達(dá)也增加，從而導(dǎo)致蓄積的一部分DHS 轉(zhuǎn)換成原兒茶酸。抑制向原兒茶酸轉(zhuǎn)換時(shí)，優(yōu)選向qsuB基因的翻譯區(qū)或該基因的轉(zhuǎn)錄?翻 譯調(diào)節(jié)區(qū)導(dǎo)入突變。
[0094] 當(dāng)本發(fā)明的微生物除了具有上述的4個(gè)性質(zhì)（a)?（d)還具有下述的性質(zhì)（e)時(shí)， 通過使用該微生物，將從碳源到生長(zhǎng)所必須的代謝物M的生物合成途徑上的化合物P轉(zhuǎn)換 成化合物Q，從而可W高效率地制備目標(biāo)化合物Q。
[0095] (e)通過在編碼由化合物P轉(zhuǎn)換成化合物Q的酶Y的蛋白的基因y的翻譯區(qū)、該 基因的翻譯調(diào)節(jié)區(qū)或促進(jìn)基因y轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)中具有1個(gè)W上的核巧酸的取代、缺失或 添加的突變，由化合物P到化合物Q的轉(zhuǎn)換能力增強(qiáng)、或者基因y的表達(dá)受到不同于野生型 的控制。
[0096]關(guān)于性質(zhì)（e)，由于在野生型的狀態(tài)下酶Y的表達(dá)量往往不充分，所W通過向該基 因y的翻譯調(diào)節(jié)區(qū)或促進(jìn)基因y轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)中導(dǎo)入1個(gè)W上的核巧酸的取代、缺失或 添加的突變，使酶Y的表達(dá)量增強(qiáng)、或者將基因y的轉(zhuǎn)錄置于不同于野生型啟動(dòng)子的控制的 控制下，從而可W賦予性質(zhì)（e)。另外，分支途徑的最初的酶往往會(huì)受到最終產(chǎn)物的反饋抑 巧||，所W通過向基因y的翻譯區(qū)內(nèi)導(dǎo)入突變來解除該反饋抑制，使酶Y的活性增強(qiáng)，從而也 可W賦予性質(zhì)（e)。
[0097] 優(yōu)選通過將促進(jìn)基因y轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的整個(gè)區(qū)域或一部分區(qū)域取代成不同于促 進(jìn)該基因轉(zhuǎn)錄的本來的啟動(dòng)子和啟動(dòng)子A的啟動(dòng)子C的DNA，可W賦予性質(zhì)（e)。
[0098] 作為啟動(dòng)子C，可W使用不同于基因y的本來的啟動(dòng)子、且不同于啟動(dòng)子A的啟動(dòng) 子。作為啟動(dòng)子C，還可W使用構(gòu)成的表達(dá)啟動(dòng)子，但優(yōu)選使用誘導(dǎo)啟動(dòng)子。作為誘導(dǎo)啟動(dòng) 子，還可W使用作為在上述性質(zhì)（d)的賦予中使用的啟動(dòng)子B的例子而列舉的啟動(dòng)子的任 意一種。
[0099]目P，作為啟動(dòng)子C，可W使用：A瞻菌體的pL啟動(dòng)子或pR啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、gal 操縱子的啟動(dòng)子、trp操縱子的啟動(dòng)子、或araBAD啟動(dòng)子等；或者通過添加阿魏酸、香草酸 或香蘭素而誘導(dǎo)的VanA啟動(dòng)子、通過添加間苯二酷或2, 4-二輕基苯甲酸而誘導(dǎo)的rh地 啟動(dòng)子、通過添加4-輕基苯甲酸而誘導(dǎo)的pcal啟動(dòng)子、通過添加3-輕基苯甲酸而誘導(dǎo)的 nagl啟動(dòng)子、通過添加苯甲酸而誘導(dǎo)的benA啟動(dòng)子、或通過添加果糖或藏糖中的任一種而 誘導(dǎo)的cg2118基因的啟動(dòng)子或PtsS啟動(dòng)子。
[0100] 在性質(zhì)（e)的賦予中使用的啟動(dòng)子C可W和在性質(zhì)（d)的賦予中使用的啟動(dòng)子B 相同。另外，該啟動(dòng)子C還可W是：受到基于控制該啟動(dòng)子B轉(zhuǎn)錄的蛋白的轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng) 子。
[0101] 由于本發(fā)明的微生物具有代謝化合物Q的酶活性，所W在化合物P的制備中該化 合物的蓄積量有可能減少的情況下，優(yōu)選通過誘變處理或重組DNA技術(shù)，使該微生物所具 有的化合物P的代謝酶中的任意一個(gè)W上的代謝酶的活性缺損或降低。
[0102] 使用了本發(fā)明的微生物的化合物Q的制備方法例如可W列舉；通過在含有碳源的 培養(yǎng)基中、在抑制了啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)，來制備化合物Q的方法。在本發(fā)明 的微生物中，由于控制酶X的表達(dá)的啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄量被抑制物R抑制在低水平，所W代謝 物M的生產(chǎn)量受到限制，可W由化合物P高效率地生產(chǎn)化合物Q(圖7)。
[0103] 在本發(fā)明的制備方法中，由于控制酶X表達(dá)的啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄量低而導(dǎo)致該微生 物生長(zhǎng)緩慢時(shí)，優(yōu)選通過將化合物Q的制備步驟分成培養(yǎng)前期和培養(yǎng)后期該兩期來制備化 合物Q。目P，將該微生物接種在含有碳源的培養(yǎng)基中，之后根據(jù)抑制物R的性質(zhì)通過添加 誘導(dǎo)物質(zhì)或升高或降低培養(yǎng)溫度等來解除轉(zhuǎn)錄抑制，從而增加酶X的表達(dá)量W繼續(xù)進(jìn)行培 養(yǎng)。之后，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)期恢復(fù)基于抑制物R的抑制，W抑制酶X的表達(dá)，從而可W增加由化 合物P生成化合物Q的量（圖8)。使用通過添加誘導(dǎo)物質(zhì)而誘導(dǎo)的啟動(dòng)子A時(shí)，調(diào)節(jié)該誘 導(dǎo)物質(zhì)的添加量，W使該誘導(dǎo)物質(zhì)在培養(yǎng)后期耗盡，從而可W恢復(fù)基于抑制物R的抑制。使 用通過升高或降低培養(yǎng)溫度而誘導(dǎo)的啟動(dòng)子A時(shí)，通過將培養(yǎng)溫度恢復(fù)至發(fā)生基于抑制物 R的抑制的溫度，可W恢復(fù)基于抑制物R的抑制。
[0104] 優(yōu)選使用將抑制物R的表達(dá)置于誘導(dǎo)啟動(dòng)子B的控制下的本發(fā)明的微生物，通過 將化合物Q的制備步驟分成培養(yǎng)前期和培養(yǎng)后期該兩期來制備化合物Q。目P，將該微生物接 種在含有碳源的培養(yǎng)基中使菌體增殖，之后根據(jù)誘導(dǎo)啟動(dòng)子B的性質(zhì)通過添加誘導(dǎo)物質(zhì)或 者升高或降低培養(yǎng)溫度來激活誘導(dǎo)啟動(dòng)子B，W增加抑制物R的生成量，從而可W抑制代謝 物M的生產(chǎn)，增加由化合物P生成化合物Q的量（圖9)。
[0105] 在本發(fā)明的制備方法中，當(dāng)化合物Q對(duì)本發(fā)明的微生物的增殖產(chǎn)生影響時(shí)，優(yōu)選 使用將酶Y的表達(dá)置于誘導(dǎo)啟動(dòng)子C的控制下的微生物，通過將化合物Q的制備步驟分成 培養(yǎng)前期和培養(yǎng)后期該兩期來制備化合物Q。目P，將該微生物接種在含有碳源的培養(yǎng)基中 使菌體增殖，之后根據(jù)誘導(dǎo)啟動(dòng)子C的性質(zhì)，通過添加誘導(dǎo)物質(zhì)或者升高或降低培養(yǎng)溫度 來激活誘導(dǎo)啟動(dòng)子C的轉(zhuǎn)錄，W增加酶Y的生成量，從而可W增加由化合物P生成化合物Q 的量（圖10)。而且，可W通過在培養(yǎng)后期激活誘導(dǎo)啟動(dòng)子C的轉(zhuǎn)錄W增加酶Y的生成量， 同時(shí)激活誘導(dǎo)啟動(dòng)子BW增加抑制物R的生成量，來抑制代謝物M的生產(chǎn)，增加由化合物P 生成化合物Q的量（圖11)。
[0106] 該種情況下，通過使啟動(dòng)子C和啟動(dòng)子B成為相同的啟動(dòng)子，可W在同一時(shí)期進(jìn)行 啟動(dòng)子C的誘導(dǎo)和啟動(dòng)子B的誘導(dǎo)。另外，當(dāng)從受到同一控制蛋白的轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子組 中選擇啟動(dòng)子C和啟動(dòng)子B時(shí)，即使各自是不同的啟動(dòng)子，也可W在同一時(shí)期進(jìn)行啟動(dòng)子C 的誘導(dǎo)和啟動(dòng)子B的誘導(dǎo)。
[0107] 如上所述，采用通過本發(fā)明的微生物進(jìn)行的制備方法時(shí)，根據(jù)該微生物的增殖狀 態(tài)或化合物Q對(duì)該微生物的影響，通過使用相同的微生物來改變培養(yǎng)方法，可W容易地使 化合物Q的生產(chǎn)量最大化。
[010引關(guān)于可W使用本發(fā)明的微生物來制備的化合物Q，在由碳源經(jīng)由化合物P生成生 長(zhǎng)所必須的代謝物M的生物合成途徑或代謝途徑中，只要可W由化合物P通過分支的途徑 生成化合物Q，則也可W制備任何的化合物。
[0109] 化合物P只要是由碳源生成生長(zhǎng)所必須的代謝物的生物合成途徑上的代謝物即 可，可W是任何的有機(jī)化合物。例如，可W列舉DHS、分支酸、預(yù)苯酸、2-氧代異戊酸、谷氨 酸、天冬氨酸、天冬氨酸目-半酵、高絲氨酸和絲氨酸等?；衔颭只要是通過用酶Y轉(zhuǎn)換 化合物P而獲得的物質(zhì)即可，可W是任何的有機(jī)化合物。例如，可W列舉原兒茶酸、氨茵 酸、4-輕基苯基丙麗酸、前酪氨酸、苯基丙麗酸、2-異丙基蘋果酸、額氨酸、Y-谷氨醜磯酸、 N-己醜谷氨酸、天冬醜胺、2, 3-二氨化巧二駿酸和0-己醜高絲氨酸等。
[0110] 當(dāng)化合物P為D服時(shí)，通過莽草酸脫氨酶（酶幻生成莽草酸（代謝物M)，但可W 通過D服脫水酶（酶Y)生產(chǎn)原兒茶酸（化合物巧。原兒茶酸除了作為醫(yī)藥、農(nóng)藥、香料等 的原料W外，還可用作使用微生物來制備被期待作為新的塑料原料的2-化喃麗-4, 6-二甲 酸時(shí)的原料。
[0111] 當(dāng)化合物P為分支酸時(shí)，通過分支酸變位酶（酶幻生成預(yù)苯酸（代謝物M)，但可 W通過氨茵酸合成酶（酶巧生產(chǎn)氨茵酸（化合物巧。氨茵酸成為作為芳族氨基酸的色氨 酸等的合成原料，當(dāng)該微生物具有色氨酸的生物合成途徑時(shí)，還可W直接生產(chǎn)色氨酸。
[0112] 當(dāng)化合物P為預(yù)苯酸時(shí)，通過預(yù)苯酸脫水酶（酶幻生成苯基丙麗酸（代謝物M)， 但本發(fā)明的微生物在大腸桿菌K-12株等中通過預(yù)苯酸脫氨酶（酶巧可W生產(chǎn)4-輕基苯 基丙麗酸（化合物曲。4-輕基苯基丙麗酸成為作為芳族氨基酸的酪氨酸的合成原料，當(dāng)該 微生物具有由4-輕基苯基丙麗酸生成酪氨酸的生物合成途徑時(shí)，還可W直接生產(chǎn)酪氨酸。
[0113]當(dāng)化合物P為預(yù)苯酸時(shí)，通過預(yù)苯酸脫水酶（酶幻生成苯基丙麗酸（代謝物M)，但 本發(fā)明的微生物在谷氨酸棒狀桿菌等中通過預(yù)苯酸轉(zhuǎn)氨酶（酶巧可W生產(chǎn)前酪氨酸（化 合物曲。前酪氨酸成為作為芳族氨基酸的酪氨酸的合成原料，當(dāng)該微生物具有由前酪氨酸 生成酪氨酸的生物合成途徑時(shí)，還可W直接生產(chǎn)酪氨酸。
[0114] 當(dāng)化合物P為預(yù)苯酸時(shí)，本發(fā)明的微生物在大腸桿菌K-12株等中通過預(yù)苯酸脫氨 酶（酶幻生成4-輕基苯基丙麗酸（代謝物M)，且本發(fā)明的微生物在谷氨酸棒狀桿菌等中 通過預(yù)苯酸脫氨酶（酶幻生成前酪氨酸（代謝物M)，但通過預(yù)苯酸脫水酶（酶巧可W生 產(chǎn)苯基丙麗酸（化合物曲。苯基丙麗酸成為作為芳族氨基酸的苯丙氨酸的合成原料，當(dāng)該 微生物具有苯丙氨酸的生物合成途徑時(shí)，還可W直接生產(chǎn)苯丙氨酸。
[0115] 當(dāng)化合物P為2-氧代異戊酸時(shí)，通過支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶（酶幻生成額氨酸 (代謝物M)，但通過2-異丙基蘋果酸合成酶（酶巧可W生產(chǎn)2-異丙基蘋果酸（化合物 Q)。2-異丙基蘋果酸成為亮氨酸的合成原料，當(dāng)該微生物具有亮氨酸的生物合成途徑時(shí)，還 可W直接生產(chǎn)亮氨酸。
[0116] 當(dāng)化合物P為2-氧代異戊酸時(shí)，通過2-異丙基蘋果酸合成酶（酶幻生成2-異 丙基蘋果酸（代謝物M)，但通過支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶（酶巧還可W生產(chǎn)額氨酸（化合物 曲。
[0117] 當(dāng)化合物P為谷氨酸時(shí)，通過氨基酸-N-己醜轉(zhuǎn)移酶（酶幻生成N-己醜谷氨酸 (代謝物M)，但通過Y-谷氨醜激酶（酶Y)可W生產(chǎn)Y-谷氨醜磯酸（化合物曲。Y-谷 氨醜磯酸成為脯氨酸的合成原料，當(dāng)該微生物具有脯氨酸的生物合成途徑時(shí)，還可W直接 生產(chǎn)脯氨酸。
[0118] 當(dāng)化合物P為谷氨酸時(shí)，通過Y-谷氨醜激酶（酶幻生成Y-谷氨醜磯酸（代謝 物M)，但通過氨基酸-N-己醜轉(zhuǎn)移酶（酶Y)可W生產(chǎn)N-己醜谷氨酸（化合物曲。N-己醜 谷氨酸成為精氨酸的合成原料，當(dāng)該微生物具有精氨酸的生物合成途徑時(shí)，還可W直接生 產(chǎn)精氨酸。
[0119] 當(dāng)化合物P為天冬氨酸時(shí)，通過天冬氨酸激酶（酶幻生成目-天冬氨醜磯酸（代 謝物M)，但通過天冬醜胺合成酶（酶Y)可W生產(chǎn)天冬醜胺（化合物曲。
[0120] 當(dāng)化合物P為天冬氨酸目-半酵時(shí)，通過高絲氨酸脫氨酶（酶幻生成高絲氨酸 (代謝物M)，但通過二輕基焦磯酸合成酶（酶巧可W生產(chǎn)2, 3-二氨化巧二駿酸（化合物 Q)。2, 3-二氨化巧二駿酸成為賴氨酸的合成原料，當(dāng)該微生物具有由2, 3-二氨化巧二駿酸 生成賴氨酸的生物合成途徑時(shí)，還可W直接生產(chǎn)賴氨酸。
[0121] 當(dāng)化合物P為高絲氨酸時(shí)，通過高絲氨酸激酶（酶幻生成高絲氨酸磯酸（代謝物 M)，但通過高絲氨酸己醜轉(zhuǎn)移酶（酶Y)可W生產(chǎn)0-己醜高絲氨酸（化合物曲。0-己醜高 絲氨酸成為甲硫氨酸的合成原料，當(dāng)該微生物具有甲硫氨酸的生物合成途徑時(shí)，還可W直 接生產(chǎn)甲硫氨酸。
[0122] 當(dāng)化合物P為高絲氨酸時(shí)，通過高絲氨酸己醜轉(zhuǎn)移酶（酶幻生成0-己醜高絲氨 酸（代謝物M)，但通過高絲氨酸激酶（酶幻可W生產(chǎn)高絲氨酸磯酸（化合物曲。高絲氨 酸磯酸成為蘇氨酸或異亮氨酸的合成原料，當(dāng)該微生物具有異亮氨酸的生物合成途徑時(shí)， 還可W直接生產(chǎn)蘇氨酸或異亮氨酸。
[0123]當(dāng)化合物P為絲氨酸時(shí)，通過絲氨酸輕甲基轉(zhuǎn)移酶（酶幻生成甘氨酸（代謝物M)， 但通過絲氨酸轉(zhuǎn)移酶（酶Y)可W生產(chǎn)0-己醜絲氨酸（化合物曲。0-己醜絲氨酸成為半脫 氨酸的合成原料，當(dāng)該微生物具有半脫氨酸的生物合成途徑時(shí)，還可W直接生產(chǎn)半脫氨酸。
[0124] 編碼與上述化合物Q的生產(chǎn)有關(guān)的酶Y的基因可W使用來自本發(fā)明的微生物的基 因，也可W使用來自不同于本發(fā)明的微生物的原核生物或真核生物的基因。例如，使用本發(fā) 明的微生物制備原兒茶酸時(shí)，由于ATCC13032株攜帶D服脫水酶基因，所W只要在原兒茶酸 的生產(chǎn)中使用該基因產(chǎn)物即可，但由于大腸桿菌K-12株未攜帶D服脫水酶基因，所W需要 使用來自其他微生物的DHS脫水酶基因。
[01巧]該里，作為更具體的例子，對(duì)高效率地生產(chǎn)原兒茶酸的菌株進(jìn)行詳述，所述原兒茶 酸可W通過對(duì)來自上述ATCC13032株的D服生產(chǎn)菌株賦予性質(zhì)（ee)來制備。
[0126] 來自生產(chǎn)原兒茶酸的ATCC13032株的菌株，是指除了具有上述的性質(zhì)（aa)?（dd) 還具有下述的性質(zhì)（ee)的微生物。
[0127] (ee)利用不同于促進(jìn)qsuB基因（基因y;核巧酸編號(hào)444, 184?446, 040)轉(zhuǎn)錄 的本來的啟動(dòng)子、并且不同于啟動(dòng)子A的啟動(dòng)子C來控制qsuB基因的轉(zhuǎn)錄，所述qsuB基因 編碼由D服轉(zhuǎn)換成原兒茶酸的D服脫水酶（酶Y)的蛋白 來自具有上述的性質(zhì)（aa)?（ee)的ATCC13032株的菌株根據(jù)葡萄糖等碳源可W生 產(chǎn)原兒茶酸，但由于該菌株具有原兒茶酸雙加氧酶，所W有可能分解所生成的原兒茶酸W 減少原兒茶酸的量。因此，優(yōu)選通過向編碼原兒茶酸4, 5-雙加氧酶?a亞單元.蛋白的 pcaG(cg2630)基因（互補(bǔ)鏈核巧酸編號(hào)2, 511，382?2, 511，996))和/或編碼原兒茶酸 4, 5-雙加氧酶?目亞單元?蛋白的PC址(cg2631)基因（互補(bǔ)鏈核巧酸編號(hào)2, 512, 008? 2, 512, 700)的翻譯區(qū)或該基因的轉(zhuǎn)錄?翻譯調(diào)節(jié)區(qū)中導(dǎo)入1個(gè)W上的核巧酸的取代、缺失 或添加的突變，使該酶所具有的分解活性缺損或降低。
[0128]另外，該菌株具有將原兒茶酸的5位氨氧化、并催化向沒食子酸轉(zhuǎn)換的對(duì)輕基苯 甲酸輕化酶，所W有可能將生成的一部分原兒茶酸轉(zhuǎn)換成沒食子酸。因此，通過向編碼對(duì)輕 基苯甲酸輕化酶?蛋白的PObB(cgl226)基因（互補(bǔ)鏈核巧酸編號(hào)1，126, 301?1，127, 488) 的翻譯區(qū)或該基因的轉(zhuǎn)錄?翻譯調(diào)節(jié)區(qū)中導(dǎo)入1個(gè)W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突 變，使該對(duì)輕基苯甲酸輕化酶所具有的氨氧化活性缺損或降低。
[0129] W下，在制備本發(fā)明的微生物時(shí)，對(duì)DNA克隆和突變導(dǎo)入株的制備方法進(jìn)行闡述。 需要說明的是，如上所述，如果本發(fā)明的微生物是屬于棒狀桿菌屬、短桿菌屬、節(jié)桿菌屬、 類諾卡氏菌屬、微桿菌屬、鏈霉菌屬、擬無枝酸菌屬、紅球菌屬、動(dòng)球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假 單胞菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬和埃希氏菌的微生物，則可W使用任一種微生物，但對(duì)向 ATCC13032株進(jìn)行突變導(dǎo)入的方法進(jìn)行詳細(xì)說明。需要說明的是，作為用于DNA克隆和導(dǎo)入 突變的宿主菌，主要使用大腸桿菌K-12株。
[0130] 上述的大腸桿菌K-12株和ATCC13032株分別通過通常用于培養(yǎng)大腸桿菌和棒狀 桿菌屬細(xì)菌的公知方法進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)后，利用公知的方法（例如化rrentprotocolsin molecularbiology中記載的方法）分離、純化該微生物的染色體DM。利用限制酶消化法、 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)法、或使用了合成DNA的雜交法等，可W由該染色體DNA獲得包含編碼 上述啟動(dòng)子或代謝酶等的DNA的片段。
[013。 作為用于連接DNAW進(jìn)行DNA克隆或突變導(dǎo)入的大腸桿菌用載體，只要是在大腸 桿菌K-12株等中能夠自主復(fù)制的載體，則可W使用質(zhì)粒載體、瞻菌體載體等任一種，具體 而言，可W使用pUC19 [Gene, 33，103 (1985)]、pUC18、地R322 等。
[0132]用作上述載體的宿主的大腸桿菌，只要是屬于大腸桿菌的微生物，則均可使用，具 體而言，可W列舉大腸桿菌巧scherichiacoli)XLl-BlueMRF'[義I' 3夕,一シ公司制 造、Strategies, 5, 81 (1992)]、大腸桿菌JM109、大腸桿菌I3L21 等。
[0133] 向?qū)儆诎魻顥U菌屬、短桿菌屬、節(jié)桿菌屬、類諾卡氏菌屬、微桿菌屬、鏈霉菌屬、擬 無枝酸菌屬、紅球菌屬、動(dòng)球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬和埃希 氏菌屬的微生物中導(dǎo)入上述DNA時(shí)，使用在該些微生物中能夠進(jìn)行自主復(fù)制的載體。優(yōu)選 可W使用在任一種該微生物和大腸桿菌K-12株該兩種微生物中能夠自主復(fù)制的穿梭載 體，向作為宿主的該微生物中導(dǎo)入重組DNAd
[0134] 作為在棒狀桿菌屬細(xì)菌中能夠自主復(fù)制的穿梭載體，可W列舉pAM330(參照日本 特開昭58-67699號(hào)公報(bào)）、P歷1519 (參照日本特開昭58-77895號(hào)公報(bào)）等。另外，從該 些載體中取出具有在棒狀桿菌內(nèi)能夠自主復(fù)制質(zhì)粒的能力的DNA片段，將其插入大腸桿 菌-棒狀桿菌用穿梭載體中時(shí)，可W用作在大腸桿菌和棒狀桿菌兩者中能夠自主復(fù)制的載 體。例如，通過在作為大腸桿菌用載體的抑56298(夕力3W才公司制造）中插入谷氨酸 棒狀桿菌ATCC13058株所具有的質(zhì)粒PHM1519的復(fù)制區(qū)作為用于在棒狀桿菌屬株中復(fù)制質(zhì) 粒的復(fù)制區(qū)，可W構(gòu)建該穿梭載體?？蒞保持該穿梭載體。ATCC13032株和谷氨酸棒狀桿菌 ATCC13058株可W從獨(dú)立行政法人?制品評(píng)價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)?生物遺傳資源部口（W下簡(jiǎn) 記為NITC)獲得。
[013引作為DNA的導(dǎo)入方法，只要是向上述宿主細(xì)胞中導(dǎo)入DNA的方法，則均可使用，例 女口，可W列舉使用巧離子的方法〔Proc.化tl.Acad.Sci.USA, 69，2110 (1972))、電穿 孔法〔NucleicAcidsRes., 16，6127 (1988))等。向谷氨酸棒狀桿菌中導(dǎo)入DNA還可W 通過vanderRest等人的方法〔Appl.Microbiol.Biotechnol., 52, 541 (1999))來進(jìn) 行。
[0136] 可W從如上操作獲得的轉(zhuǎn)化體中提取DNA，確定該DNA中所含的本發(fā)明的DNA的核 巧酸序列。確定核巧酸序列時(shí)可W使用通常采用的核巧酸序列分析方法、例如雙脫氧法〔Proc. Acad. Sci. USA, 74，5463 (1977))或3730x1型DNA測(cè)定儀（7 F .W才合義，厶乂公司制造）等核巧酸序列分析裝置。
[0137] 另外，根據(jù)上述確定的DNA的核巧酸序列，通過使用パ一*才，才W才合義 ，厶《公司制造的8905型DNA合成裝置等進(jìn)行化學(xué)合成，也可W制備目標(biāo)DNA。
[0138] 具有目標(biāo)表型的菌株可W通過使用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基脈或己基甲賴酸 等突變劑的處理或照射UV或放射線等的突變處理、或自然突變等導(dǎo)入突變而獲得?；蛘撸?克隆該菌株的導(dǎo)入突變的區(qū)的DNA，在試管內(nèi)（體外）向DNA中導(dǎo)入突變。當(dāng)導(dǎo)入大的取代 突變時(shí)，在構(gòu)建在該菌株內(nèi)能夠復(fù)制的載體上擔(dān)載了應(yīng)該取代的DNA的質(zhì)粒后，將該質(zhì)粒 導(dǎo)入該菌株中，或者還可W通過該質(zhì)粒與染色體DNA之間的同源重組導(dǎo)入取代突變。關(guān)于 導(dǎo)入的突變的種類，只要體現(xiàn)出目標(biāo)表型，則可W是核巧酸取代突變、缺失突變、插入突變 或與大的DNA片段的取代突變的任意一種，并且關(guān)于突變的大小，當(dāng)為1個(gè)核巧酸W上時(shí)， 也可W是任何大小的突變。W下，只要沒有特別說明，則突變的導(dǎo)入方法采用上述方法。
[0139]在本發(fā)明的微生物中，當(dāng)需要通過除啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄控制蛋白W外的手段來調(diào)節(jié)基 因的表達(dá)量時(shí)，可W通過調(diào)整核糖體結(jié)合序列與翻譯起始密碼子之間的距離、改變翻譯起 始密碼子周圍的序列、或者改變翻譯區(qū)內(nèi)的核巧酸序列等來調(diào)節(jié)該基因的翻譯起始效率。
[0140]將如此操作而獲得的用于導(dǎo)入突變的DNA插入通常在大腸桿菌內(nèi)能夠復(fù)制的質(zhì) 粒中，之后利用上述的DNA導(dǎo)入法導(dǎo)入作為宿主菌的谷氨酸棒狀桿菌中。當(dāng)該質(zhì)粒是溫度 敏感性載體時(shí)，通過高溫培養(yǎng)選擇，選出一次交叉型同源重組體；而當(dāng)該質(zhì)粒具有在宿主菌 內(nèi)能夠表達(dá)的卡那霉素耐性等抗生素耐性標(biāo)志物時(shí)，通過該抗生素耐性選擇，選出一次交 叉型同源重組體。為了獲得在與該DNA片段相同的染色體區(qū)通過二次交叉型同源重組取代 了該DNA的突變株時(shí)，通?？蒞采用WJager等人〔J. Bacteriol.174，5462 (1992))開 發(fā)的使用枯草芽抱桿菌妨株的果聚糖藏糖酶基因（sacB基因）的 方法。采用藏糖耐性選擇。采用本方法時(shí)，表達(dá)枯草芽抱桿菌168株的sacB基因的谷氨酸 棒狀桿菌在含有藏糖的培養(yǎng)基中死亡，所W通過藏糖耐性選擇可W獲得通過二次交叉型同 源重組失去了果聚糖藏糖酶基因的突變株。
[0141]本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)可W在含有碳源、氮源、無機(jī)鹽、各種維生素等的普通的營(yíng) 養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行，作為碳源，例如使用葡萄糖、藏糖、果糖等糖類、己醇、甲醇等醇類、構(gòu)稼 酸、蘋果酸、玻巧酸等有機(jī)酸類、甘油、廢糖蜜等。作為氮源，例如將氨、硫酸饋、氯化饋、硝酸 饋、尿素等分別單獨(dú)或混合使用。另外，作為無機(jī)鹽，例如使用磯酸一氨鐘、磯酸二氨鐘、硫 酸鎮(zhèn)等。此外，可W在培養(yǎng)基中添加蛋白腺、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白氨基酸、 生物素等各種維生素等營(yíng)養(yǎng)素。
[0142] 培養(yǎng)通常在通氣攬拌、振蕩等需氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度只要是本發(fā)明的微生物 能夠生長(zhǎng)的溫度即可，沒有特別限定，另外，對(duì)培養(yǎng)過程中的抑也沒有特別限定，只要是本 發(fā)明的微生物能夠生長(zhǎng)的抑即可。培養(yǎng)中的抑調(diào)節(jié)可W通過添加酸或堿來進(jìn)行。
[0143] 關(guān)于培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液中的目標(biāo)有機(jī)化合物，根據(jù)需要，可W通過離也分離等 從該培養(yǎng)液中除去菌體等不溶成分后，例如通過將基于己酸己醋等有機(jī)溶劑的提取法、使 用活性炭的方法、使用離子交換樹脂的方法、晶析法、鹽析等沉淀法、蒸觸法等方法單獨(dú)或 組合，來采集目標(biāo)有機(jī)化合物。 實(shí)施例
[0144]W下，通過實(shí)施例，對(duì)作為本發(fā)明的微生物的、高效率地生產(chǎn)作為化合物P的DHS 的ATCC13032株的菌株的制作和利用該微生物進(jìn)行的D服的制備方法進(jìn)行具體闡述。另 夕F，通過實(shí)施例，對(duì)作為本發(fā)明的微生物的、高效率地生產(chǎn)作為化合物Q的原兒茶酸的 ATCC13032株的菌株的制作和利用該微生物進(jìn)行的原兒茶酸的制備方法進(jìn)行具體闡述。需 要說明的是，本發(fā)明并不限于該些實(shí)施例。
[0145] 實(shí)施例1.Pben-vanR株與N甜AaroE3AqsuBAqsuD株的D服生產(chǎn)性比較 如下操作，用化的發(fā)酵缸培養(yǎng)下述菌株：通過qsuB基因的符合讀框缺失突變，失去了 從D服向原兒茶酸轉(zhuǎn)換的能力，且aroE3基因的表達(dá)被處于benA啟動(dòng)子控制下的VanR基 因所編碼的VanR抑制物抑制的化en-vanR株（參考例11) ;W及通過qsuB基因和qsuD基 因和aroE3基因的符合讀框缺失突變，失去了從D服向莽草酸轉(zhuǎn)換的能力和從D服向原兒 茶酸轉(zhuǎn)換的能力的N甜AaroE3AqsuBAqsuD株（參考例10)，進(jìn)行D服的生產(chǎn)性試驗(yàn)。需 要說明的是，由于與由DAHP合成DHS有關(guān)的4種基因（aroF、aroG、aroB和aroD基因）的 轉(zhuǎn)錄被化啟動(dòng)子控制，所W與野生株相比該些菌株的D服生成量增加。
[0146] 作為該些菌株的W前的培養(yǎng)和前培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，使用CGXII培養(yǎng)基（20g/L的硫 酸饋、5g/L的尿素、Ig/L的磯酸二氨鐘、Ig/L的磯酸氨二鐘、0. 25g/L的硫酸鎮(zhèn)走水合物、 lOmg/L的氯化巧、lOmg/L的硫酸亞鐵走水合物、lOmg/L的硫酸猛五水合物、Img/L的硫酸鋒 走水合物、0. 2mg/L的硫酸銅、0. 02mg/L的氯化媒六水合物、0. 2mg/L的生物素、20g/L的葡 萄糖、30mg/L的原兒茶酸、抑7. 0)。將該些菌株的1%的W前的培養(yǎng)液接種在前培養(yǎng)液中， 之后在3(TC下培養(yǎng)24小時(shí)。用CGXII培養(yǎng)基稀釋使前培養(yǎng)液在600nm的吸光度達(dá)到3. 0， 之后只取1%到化發(fā)酵缸（工株式會(huì)社制造BMS-03NP2)內(nèi)的0.化本培養(yǎng)用培養(yǎng)基 中。作為本培養(yǎng)用培養(yǎng)基，使用含有2.Ig/L的構(gòu)稼酸酢和1.Og/L的硫酸鐵? 7馬0的作為 CGXII培養(yǎng)基的CGCF培養(yǎng)基。W下，只要沒有特別說明，則D服W及原兒茶酸的生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)利 用該方法來進(jìn)行。
[0147] 需要說明的是，由于N甜AaroE3AqsuBAqsuD株在CGXII培養(yǎng)基和CGCF培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)極差，所W在該些培養(yǎng)基中添加0. 5g/L的色氨酸、0. 4g/L的苯丙氨酸、0. 45g/L的酪 氨酸、17mg/L的莽草酸、45mg/L的維生素K2和14mg/L的對(duì)氨基苯甲酸進(jìn)行培養(yǎng)。在本培 養(yǎng)開始后的適當(dāng)時(shí)期采集培養(yǎng)液，用5%的己膳水溶液稀釋至1000倍，利用高效液相色譜法 (Waters公司、LCTPremierXE)在表1的分離條件下進(jìn)行分析，之后根據(jù)W濃度已知的D服 水溶液值服從Sigma公司購(gòu)入）為對(duì)照的D服峰的面積比來計(jì)算。W下，D服的定量利用 該方法進(jìn)行測(cè)定。
[014引關(guān)于化en-vanR株，在本培養(yǎng)開始時(shí)添加終濃度為5mM的苯甲酸，38小時(shí)后W 4.Og/小時(shí)的比例添加葡萄糖，再培養(yǎng)48小時(shí)。另一方面，關(guān)于N甜AaroE3AqsuBAqsuD 株，在本培養(yǎng)開始后45. 5小時(shí)的時(shí)刻W6.Og/小時(shí)的比例添加葡萄糖，再培養(yǎng)16. 5小時(shí)。 Pben-vanR株和N甜AaroE3AqsuBAqsuD株的D服的生產(chǎn)量分別在培養(yǎng)開始后第86小時(shí) 和第62小時(shí)達(dá)到最大，該些菌株的D服的最大生產(chǎn)量分別為15. 4g/L和7. 7g/L。由該結(jié) 果可知；與在含有芳族氨基酸等的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的N甜AaroE3AqsuBAqsuD株相比，通過 VanR抑制物可W人為控制aroE基因表達(dá)的化en-vanR株即使在不含芳族氨基酸等的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，其D服的生產(chǎn)性也優(yōu)異。
[0149][表1]

【權(quán)利要求】
1. 原核生物，該原核生物具有下述的（a)?（d)所述的所有性質(zhì)，以調(diào)節(jié)將由碳源生 成生長(zhǎng)所必須的代謝物M的生物合成途徑中作為中間代謝物的化合物P轉(zhuǎn)換成代謝物M的 酶X的表達(dá)量，從而使化合物P蓄積， (a) 在與從該原核生物所能利用的碳源到化合物P的生物合成有關(guān)的酶組中，任意一 個(gè)以上的酶的活性較該原核生物的野生株有所增強(qiáng)； (b) 通過在編碼酶X的蛋白的野生型基因x的翻譯區(qū)、該基因的翻譯調(diào)節(jié)區(qū)或促進(jìn)基 因x轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)中具有1個(gè)以上的核苷酸的取代、缺失或添加的突變，酶X的活性缺損 或降低； (c) 利用與促進(jìn)上述基因x轉(zhuǎn)錄的本來的啟動(dòng)子不同、且轉(zhuǎn)錄被抑制物R的蛋白抑制 的啟動(dòng)子A來控制編碼活性型酶X的DNA的轉(zhuǎn)錄； (d) 具有1拷貝以上的編碼抑制物R的蛋白的基因z，該基因的轉(zhuǎn)錄被該基因的本來的 啟動(dòng)子和/或不同于該啟動(dòng)子的誘導(dǎo)啟動(dòng)子B控制。
2. 權(quán)利要求1所述的原核生物，其特征在于：性質(zhì)（b)所述的促進(jìn)基因x轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng) 子區(qū)中的取代突變是將該啟動(dòng)子的整個(gè)區(qū)域或一部分區(qū)域取代成性質(zhì)（c)所述的啟動(dòng)子A 的DNA的突變。
3. 權(quán)利要求1或2所述的原核生物，其特征在于：在上述原核生物所具有的代謝化合 物P的酶中，酶X以外的任意一個(gè)以上的代謝酶的活性缺損或降低。
4. 權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的原核生物，其特征在于：上述啟動(dòng)子B是通過添加 選自阿魏酸、香草酸、香蘭素、苯甲酸、3-羥基苯甲酸、間苯二酚、4-羥基苯甲酸、2, 4-二羥 基苯甲酸、果糖和蔗糖的化合物而誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
5. 權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的原核生物，其特征在于：編碼上述抑制物R的蛋白 的基因z為谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032株的vanR(cg2615)基因、pcaR(cg2624)基因、或 rhcR(cgl308)基因。
6. 權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的原核生物，其特征在于：上述啟動(dòng)子A為谷氨酸 棒狀桿菌ATCC13032株的vanA(cg2616)基因的啟動(dòng)子、pobA(cgl226)基因的啟動(dòng)子、 pcaH(cg2631)基因的啟動(dòng)子、或rhcH(cgl309)基因的啟動(dòng)子。
7. 化合物P的制備方法，其特征在于：在抑制了啟動(dòng)子A轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)下、在碳源的存在 下培養(yǎng)權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的原核生物。
8. 化合物P的制備方法，其特征在于：在抑制了啟動(dòng)子A轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)下、在碳源的存在 下培養(yǎng)權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的原核生物，之后施加誘導(dǎo)啟動(dòng)子B轉(zhuǎn)錄的處理，使抑 制物R的蛋白表達(dá)量增加，從而減少代謝物M的生成量。
9. 化合物P的制備方法，其特征在于：在解除了啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄抑制的狀態(tài)下、在碳源 的存在下培養(yǎng)權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的原核生物，之后施加誘導(dǎo)啟動(dòng)子B轉(zhuǎn)錄的處 理，使抑制物R的蛋白表達(dá)量增加，從而減少代謝物M的生成量。
10. 權(quán)利要求7?9中任一項(xiàng)所述的化合物P的制備方法，其特征在于，上述化合物P 和上述代謝物M的組合為下述（f)?（i)中的任意一個(gè)： (f) 化合物P為3-脫氫莽草酸、代謝物M為莽草酸； (g) 化合物P為谷氨酸、代謝物M為N-乙酰谷氨酸或Y-谷氨酰磷酸； (h) 化合物P為天冬氨酸、代謝物M為0 -天冬氨酰磷酸； (i) 化合物P為絲氨酸、代謝物M為甘氨酸。
11. 權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的原核生物，其特征在于：除了具有（a)?（d)所述 的性質(zhì)以外，還具有下述的性質(zhì)（e)，以通過酶Y將蓄積的化合物P轉(zhuǎn)換成化合物Q， (e)通過在編碼酶Y的蛋白的基因y的翻譯區(qū)、該基因的翻譯調(diào)節(jié)區(qū)或促進(jìn)基因y轉(zhuǎn) 錄的啟動(dòng)子區(qū)中具有1個(gè)以上的核苷酸的取代、缺失或添加的突變，由化合物P向化合物Q 轉(zhuǎn)換的能力增強(qiáng)、或者基因y的表達(dá)受到不同于野生型的控制。
12. 權(quán)利要求11所述的原核生物，其特征在于：在上述原核生物所具有的代謝化合物 Q的酶中，任意一個(gè)以上的代謝酶的活性缺損或降低。
13. 權(quán)利要求11或12所述的原核生物，其特征在于：性質(zhì)（e)所述的促進(jìn)基因y轉(zhuǎn)錄 的啟動(dòng)子區(qū)中的取代突變是將該啟動(dòng)子的整個(gè)區(qū)域或一部分區(qū)域取代成不同于促進(jìn)該基 因轉(zhuǎn)錄的本來的啟動(dòng)子和啟動(dòng)子A的啟動(dòng)子C的DNA的突變。
14. 權(quán)利要求13所述的原核生物，其特征在于：上述啟動(dòng)子C與啟動(dòng)子B相同、或者上 述啟動(dòng)子C受到控制啟動(dòng)子B轉(zhuǎn)錄的蛋白的轉(zhuǎn)錄控制。
15. 權(quán)利要求13或14所述的原核生物，其特征在于：上述啟動(dòng)子C為誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
16. 權(quán)利要求15所述的原核生物，其特征在于：上述啟動(dòng)子C是通過添加選自阿魏酸、 香草酸、香蘭素、苯甲酸、3-羥基苯甲酸、間苯二酚、4-羥基苯甲酸、2, 4-二羥基苯甲酸、果 糖和蔗糖的化合物而誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
17. 化合物Q的制備方法，其特征在于：在抑制了啟動(dòng)子A轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)下、在碳源的存 在下培養(yǎng)權(quán)利要求11?16中任一項(xiàng)所述的原核生物。
18. 化合物Q的制備方法，其特征在于：在抑制了啟動(dòng)子A轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)下、在碳源的存 在下培養(yǎng)權(quán)利要求11?16中任一項(xiàng)所述的原核生物，之后施加誘導(dǎo)啟動(dòng)子B轉(zhuǎn)錄的處理， 使抑制物R的蛋白表達(dá)量增加，從而減少代謝物M的生成量，并增加化合物Q的生成量。
19. 化合物Q的制備方法，其特征在于：在解除了啟動(dòng)子A的轉(zhuǎn)錄抑制的狀態(tài)下、在碳 源的存在下培養(yǎng)權(quán)利要求11?16中任一項(xiàng)所述的原核生物，之后施加誘導(dǎo)啟動(dòng)子B轉(zhuǎn)錄 的處理，使抑制物R的蛋白表達(dá)量增加，從而減少代謝物M的生成量，并增加化合物Q的生 成量。
20. 權(quán)利要求17?19中任一項(xiàng)所述的化合物Q的制備方法，其特征在于：在碳源的存 在下培養(yǎng)權(quán)利要求11?16中任一項(xiàng)所述的原核生物，之后施加誘導(dǎo)上述啟動(dòng)子C轉(zhuǎn)錄的 處理，使上述酶Y的表達(dá)量增加，從而增加化合物Q的生成量。
21. 權(quán)利要求17?20中任一項(xiàng)所述的化合物Q的制備方法，其特征在于，上述化合物 P、上述化合物Q和上述代謝物M的組合為下述（j)?（w)中的任意一個(gè)： (j) 化合物P為3-脫氫莽草酸、化合物Q為原兒茶酸、代謝物M為莽草酸； (k) 化合物P為分支酸、化合物Q為氨茴酸、代謝物M為預(yù)苯酸； (l) 化合物P為預(yù)苯酸、化合物Q為4-羥基苯基丙酮酸、代謝物M為苯基丙酮酸； (m) 化合物P為預(yù)苯酸、化合物Q為前酪氨酸、代謝物M為苯基丙酮酸； (n) 化合物P為預(yù)苯酸、化合物Q為苯基丙酮酸、代謝物M為4-羥基苯基丙酮酸或前 酪氨酸； (〇)化合物P為2-氧代異戊酸、化合物Q為2-異丙基蘋果酸、代謝物M為纈氨酸； (P)化合物P為2-氧代異戊酸、化合物Q為纈氨酸、代謝物M為2-異丙基蘋果酸； (q) 化合物P為谷氨酸、化合物Q為Y-谷氨酰磷酸、代謝物M為N-乙酰谷氨酸； (r) 化合物P為谷氨酸、化合物Q為N-乙酰谷氨酸、代謝物M為Y-谷氨酰磷酸； (s) 化合物P為天冬氨酸、化合物Q為天冬酰胺、代謝物M為天冬氨酰磷酸； (t) 化合物P為天冬氨酸0 -半醛、化合物Q為2, 3-二氫吡啶二羧酸、代謝物M為高 絲氨酸； (u) 化合物P為高絲氨酸、化合物Q為0-乙酰高絲氨酸、代謝物M為高絲氨酸磷酸； (v) 化合物P為高絲氨酸、化合物Q為高絲氨酸磷酸、代謝物M為0-乙酰高絲氨酸； (w) 化合物P為絲氨酸、化合物Q為0-乙酰絲氨酸、代謝物M為甘氨酸。
22. 權(quán)利要求21的（j)所述的原兒茶酸的制備方法，其特征在于：上述酶X為莽草酸 脫氫酶，并且上述酶Y為3-脫氫莽草酸脫水酶。
23. 權(quán)利要求22所述的原兒茶酸的制備方法，其特征在于，選自編碼原兒茶酸2, 3-雙 加氧酶的基因、編碼原兒茶酸3, 4-雙加氧酶的基因、編碼原兒茶酸4, 5-雙加氧酶的基因 和編碼原兒茶酸脫碳酸酶的基因的至少一個(gè)基因的性質(zhì)為：通過向該基因的翻譯區(qū)或其轉(zhuǎn) 錄?翻譯調(diào)節(jié)區(qū)中導(dǎo)入1個(gè)以上的核苷酸的取代、缺失或添加的突變，原兒茶酸的代謝活性 缺損或降低。
24. 權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11?16中任一項(xiàng)所述的原核生物，該原核 生物為谷氨酸棒狀桿菌或大腸桿菌。
【文檔編號(hào)】C12P7/42GK104379729SQ201380032679
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月3日
【發(fā)明者】飯?zhí)锛孜? 巖崎卓己, 西達(dá)也 申請(qǐng)人:株式會(huì)社吉那里斯