對(duì)于過(guò)酸的生產(chǎn)有用的酶的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本文提供了乙?；揪厶酋ッ讣捌渚哂羞^(guò)水解活性的變體，以用于從羧酸酯和過(guò)氧源來(lái)產(chǎn)生過(guò)氧羧酸。還提供了包括具有過(guò)水解活性的酶催化劑的多組分的過(guò)酸生成體系，以及使用本發(fā)明的酶催化劑來(lái)產(chǎn)生過(guò)氧羧酸的方法。具有過(guò)水解活性的多肽可被用于產(chǎn)生適合用于諸如清潔、消毒、衛(wèi)生處理、漂白、木漿加工、紙漿加工、和個(gè)人護(hù)理應(yīng)用的多種應(yīng)用的過(guò)氧羧酸。
【專(zhuān)利說(shuō)明】對(duì)于過(guò)酸的生產(chǎn)有用的酶
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的奪叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年3月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/618, 404的權(quán)益，所述文獻(xiàn) 全文以引用方式并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本公開(kāi)涉及過(guò)氧羧酸生物合成和酶催化領(lǐng)域。更具體地，提供了包括具有過(guò)水解 活性的酶催化劑的多組分的過(guò)酸生成體系。還提供了使用本發(fā)明的酶催化劑來(lái)產(chǎn)生過(guò)氧羧 酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0004] 過(guò)氧羧酸組合物可為有效的抗微生物劑。針對(duì)不希望有的微生物生長(zhǎng)，利用過(guò)氧 羧酸清潔、消毒和/或衛(wèi)生處理硬質(zhì)表面、紡織物、肉類(lèi)產(chǎn)品、活植物組織、醫(yī)療器械的方法 已得到描述（美國(guó)專(zhuān)利6, 545, 047 ;美國(guó)專(zhuān)利6, 183, 807 ;美國(guó)專(zhuān)利6, 518, 307 ;美國(guó)專(zhuān)利 申請(qǐng)公布2003-0026846 ;和美國(guó)專(zhuān)利5, 683, 724)。過(guò)氧羧酸也已被用于多種漂白應(yīng)用， 包括但不限于木漿漂白/去木質(zhì)化和衣物洗滌護(hù)理應(yīng)用（歐洲專(zhuān)利1040222B1 ;美國(guó)專(zhuān)利 5, 552, 018 ;美國(guó)專(zhuān)利3, 974, 082 ;美國(guó)專(zhuān)利5, 296, 161 ;和美國(guó)專(zhuān)利5, 364, 554)。在中性pH 下，在1分鐘至5分鐘的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，過(guò)氧羧酸的期望有效濃度可根據(jù)產(chǎn)品應(yīng)用而不同（例 如對(duì)于醫(yī)療器械消毒大約500ppm至lOOOppm，對(duì)于衣物洗滌漂白或消毒應(yīng)用大約30ppm至 80ppm)。
[0005] 結(jié)構(gòu)上被歸類(lèi)為糖酯酶家族7(CE_7)的成員的酶，已被用作過(guò)水解酶，于堿性 至酸性pH范圍（從大約pHIO至大約pH5)在水中催化過(guò)氧化氫（或替代性的過(guò)氧化物 試劑）與羧酸的烷基酯的反應(yīng)，以產(chǎn)生有效濃度的過(guò)氧羧酸，用于諸如消毒（例如醫(yī)療 器械、硬質(zhì)表面、紡織物）、漂白（例如木漿或紙漿加工/去木質(zhì)化、紡織物漂白和衣物 洗滌護(hù)理應(yīng)用）、和其它衣物洗滌護(hù)理應(yīng)用如脫色、除臭、和消毒的應(yīng)用、以及個(gè)人護(hù)理 應(yīng)用（美國(guó)專(zhuān)利7, 964, 378 ;7, 951，566 ;和7, 723, 083 ;授予DiCosimo等人的公布的美 國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2008-0176299 ;和授予Chisholm等人的公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2012-0317733 和2012-0328534)。CE-7酶類(lèi)已被發(fā)現(xiàn)具有針對(duì)酯類(lèi)尤其是醇、二醇和三醇的乙?；?酯類(lèi)的過(guò)水解的高的特異性活性。DiCosimo等人報(bào)道了來(lái)源于多個(gè)物種的具有改善的 性能的變體 CE-7 過(guò)水解酶（美國(guó)專(zhuān)利 7, 927, 854 ;7, 923, 233 ;7, 932, 072 ;7, 910, 347 ; 7, 960, 528 ;8, 062, 875 ;8, 206, 964 ;8, 389, 254 ;和 8, 389, 255 ;以及公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) 2011-0236336 和 2011-0236338)。
[0006] 先前報(bào)道的具有過(guò)水解活性的CE-7糖酯酶（野生型的和其變體）包含如Vincent 等人所定義的保守的結(jié)構(gòu)性"特征"基序（J. Mol. Biol.，330 :593-606(2003))。更具體地， 用于結(jié)構(gòu)上鑒定和定義CE-7糖酯酶家族成員CE-7特征基序包含三個(gè)保守子基序：1) 一 個(gè) "RGQ" 子基序 Argll8-Glyll9-Glnl20,2) -個(gè) "GXSQG" 子基序 Glyl86-Xaal87-Serl88 -Glnl89-Glyl90,和 3) -個(gè) "HE" 子基序 His303-Glu304(相對(duì)于海棲熱袍菌（Thermotoga maritima)參考序列SEQ ID NO :2的殘基編號(hào)和取向）。
[0007] 盡管大多數(shù)被分類(lèi)為CE-7糖酯酶的酶包含由Vincent等人定義的特征基 序，有多個(gè)不包含"HE"子基序的多肽序列被添加到糖酯酶的家族7(Cantarel等人， "The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy) ：an expert resource for Glycogenomics"，NAR，37 :D233-D238 (2009))。過(guò)水解活性在這個(gè)子群體內(nèi)的存在還未被報(bào) 道。
[0008] 過(guò)水解酶技術(shù)向一些應(yīng)用中的摻入可能需要新的過(guò)水解酶的鑒定。如此，仍然存 在鑒定包括具有顯著的過(guò)水解活性的多肽的另外的酶催化劑的需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 具有適合用于以有效濃度生產(chǎn)過(guò)酸的過(guò)水解活性的多種酶已被鑒定。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施例中，提供了酶催化的過(guò)酸生成體系，包括一組反應(yīng)組分，所述反應(yīng)組 分包含：
[0011] ⑴至少一種選自下列的底物：
[0012] ⑴一種或多種具有以下結(jié)構(gòu)的酯：
[0013] [XlmR5
[0014] 其中
[0015] X =式 R6-C(O)O 的酯基；
[0016] R6 =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈、支化或環(huán)狀烴基部分，其中 對(duì)于R6 = C2-C7, R6任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵；
[0017] R5 =任選地被羥基取代的CI-C6直鏈、支化或環(huán)狀烴基部分，或五元環(huán)狀雜芳族部 分，或六元環(huán)狀芳族或雜芳族部分；其中R5中的每個(gè)碳原子單獨(dú)地包含不超過(guò)一個(gè)羥基，或 不超過(guò)一個(gè)酯基或羧酸基；其中R 5任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵；
[0018] m = 1至1?5中碳原子數(shù)范圍內(nèi)的整數(shù)；并且其中所述酯在25°C下具有至少5ppm的 水中溶解度；
[0019] (ii) 一種或多種具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯：
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 一種生產(chǎn)過(guò)氧羧酸的方法，包括： (a) 提供一組包含以下物質(zhì)的反應(yīng)組分： (1)至少一種選自下列的底物： (i) 一種或多種具有以下結(jié)構(gòu)的酯： 卿5 其中 X =SR6-C(0)0 的酯基； R6 =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈、支化或環(huán)狀烴基部分，其中對(duì)于 R6 = C2-C7, R6任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； R5 =任選地被羥基取代的C1-C6直鏈、支化或環(huán)狀烴基部分，或五元環(huán)狀雜芳族部分， 或六元環(huán)狀芳族或雜芳族部分；其中R5中的每個(gè)碳原子單獨(dú)地包含不超過(guò)一個(gè)羥基，或不 超過(guò)一個(gè)酯基或羧酸基；其中R5任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； m = 1至R5中碳原子數(shù)范圍內(nèi)的整數(shù)；并且其中所述酯在25°C下具有至少5ppm的水 中溶解度； (ii) 一種或多種具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯：
其中& =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C21直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4單獨(dú)地為H或￥(0); (iii) 一種或多種下式的酯：
其中& =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2 = C1-C10直鏈或支鏈烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、（CH2CH20) n、* (CH2CH(CH3) -0)nH，并且 n 為 1 至 10 ; (iv) -種或多種?；膯翁恰Ⅴ；亩恰⒒蝓；亩嗵牵缓停╲) (i)至（iv)的任何組 合； ⑵過(guò)氧源；和 (3)包含多肽的酶催化劑，所述多肽具有過(guò)水解活性以及與SEQ ID NO :4中所示的氨 基酸序列具有至少80 %同一性的氨基酸序列，前提條件是結(jié)合至起催化作用的組氨酸的 C-末端側(cè)的氨基酸殘基不是谷氨酸； (b) 在合適的反應(yīng)條件下合并該組反應(yīng)組分，從而產(chǎn)生過(guò)氧羧酸；以及 (c) 任選地，稀釋步驟（b)中產(chǎn)生的過(guò)氧羧酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括以下步驟：d)使硬質(zhì)表面或無(wú)生命物體與步驟 (b)或步驟（c)中產(chǎn)生的過(guò)氧羧酸接觸；從而所述硬質(zhì)表面或所述無(wú)生命物體被消毒、漂 白、脫色、或它們的組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述無(wú)生命物體是醫(yī)療器械。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括以下步驟：d)使衣物制品或紡織物與步驟（b) 或步驟（c)中產(chǎn)生的過(guò)氧羧酸接觸；從而所述衣物制品或紡織物獲得有益效果。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述有益效果選自消毒、衛(wèi)生處理、漂白、脫色、除 臭、以及它們的組合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括以下步驟：d)使木漿或紙漿與步驟（b)或步驟 (c)中產(chǎn)生的過(guò)氧羧酸接觸；從而所述木漿或紙漿被漂白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述底物選自：甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘 油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯； 甘油三丁酸酯；葡糖五乙酸酯邛-D-半乳糖五乙酸酯、山梨醇六乙酸酯、蔗糖八乙酸酯、 木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙?；揪厶瞧乌?D-呋喃核糖-1，2, 3, 5-四乙酸酯； 三-0-乙酰基-D-半乳醛；三-0-乙?；?D-葡萄烯糖；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙 二醇、1，2-丁二醇、1，3- 丁二醇、2, 3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2, 5-戊二醇、1， 6_戊二醇、1，2-己二醇、2, 5-己二醇、1，6-己二醇的單酯或二酯；4-乙酰氧基苯甲酸；以及 它們的混合物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述底物是甘油三乙酸酯。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所產(chǎn)生的過(guò)氧羧酸為過(guò)乙酸、過(guò)丙酸、過(guò)丁酸、過(guò) 乳酸、過(guò)乙醇酸、過(guò)甲氧基乙酸、過(guò)-0-羥基丁酸、或它們的混合物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酶催化劑為微生物細(xì)胞、透化的微生物細(xì) 胞、微生物細(xì)胞提取物、部分純化的酶、或純化的酶的形式。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述氨基酸序列是SEQ ID N0 :14或16。
12. -種組合物，包含： (a) -組包含以下物質(zhì)的反應(yīng)組分： (1)至少一種選自下列的底物： (i) 一種或多種具有以下結(jié)構(gòu)的酯： 卿5 其中 X =SR6-C(0)0 的酯基； R6 =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈、支化或環(huán)狀烴基部分，其中對(duì)于 R6 = C2-C7, R6任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； R5 =任選地被羥基取代的C1-C6直鏈、支化或環(huán)狀烴基部分，或五元環(huán)狀雜芳族部分， 或六元環(huán)狀芳族或雜芳族部分；其中R5中的每個(gè)碳原子單獨(dú)地包含不超過(guò)一個(gè)羥基，或不 超過(guò)一個(gè)酯基或羧酸基；其中R5任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； m = 1至1?5中碳原子數(shù)范圍內(nèi)的整數(shù)；并且 其中所述酯在25°C下具有至少5ppm的水中溶解度； (ii) 一種或多種具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯：
其中Ri =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C21直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4單獨(dú)地為H或￥(0); (iii) 一種或多種下式的酯：
其中& =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2 = C1-C10直鏈或支鏈烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、（CH2CH20) n、* (CH2CH(CH3) -0)nH，并且 n 為 1 至 10 ; (iv) -種或多種?；膯翁恰Ⅴ；亩?、或酰化的多糖；和（v) (i)至（iv)的任何組 合； ⑵過(guò)氧源；和 (3)包含多肽的酶催化劑，所述多肽具有過(guò)水解活性以及與SEQ ID NO :4中所示的氨 基酸序列具有至少80 %同一性的氨基酸序列，前提條件是結(jié)合至起催化作用的組氨酸的 C-末端側(cè)的氨基酸殘基不是谷氨酸；和 (b)在合并（a)的該組反應(yīng)組分時(shí)形成的至少一種過(guò)氧羧酸。
13. -種過(guò)酸生成和遞送體系，包括： (a)第一隔室，所述第一隔室包含： (1) 包含多肽的酶催化劑，所述多肽具有過(guò)水解活性和與SEQ ID NO :4中所示的氨 基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，前提條件是結(jié)合至起催化作用的組氨酸的 C-末端側(cè)的氨基酸殘基不是谷氨酸； (2) 至少一種選自下列的底物： (i) 一種或多種具有以下結(jié)構(gòu)的酯： 卿5 其中 X =SR6-C(0)0 的酯基； R6 =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈、支化或環(huán)狀烴基部分，其中對(duì)于 R6 = C2-C7, R6任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； R5 =任選地被羥基取代的C1-C6直鏈、支化或環(huán)狀烴基部分，或五元環(huán)狀雜芳族部分， 或六元環(huán)狀芳族或雜芳族部分；其中R5中的每個(gè)碳原子單獨(dú)地包含不超過(guò)一個(gè)羥基，或不 超過(guò)一個(gè)酯基或羧酸基；其中R5任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； m = 1至1?5中碳原子數(shù)范圍內(nèi)的整數(shù)；并且 其中所述酯在25°C下具有至少5ppm的水中溶解度； (ii) 一種或多種具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯：
其中Ri =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C21直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4單獨(dú)地為H或￥(0); (iii) 一種或多種下式的酯：
其中& =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2 = C1-C10直鏈或支鏈烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、（CH2CH20) n、* (CH2CH(CH3) -0)nH，并且 n 為 1 至 10 ; (iv) -種或多種酰化的單糖、?；亩?、或?；亩嗵?；和（v) (i)至（iv)的任何組 合；和 ⑶任選的緩沖液；和 (b)第二隔室，所述第二隔室包含： (1) 過(guò)氧源； (2) 過(guò)氧化物穩(wěn)定劑；和 (3) 任選的緩沖液。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的過(guò)酸生成和遞送體系，其中所述底物包括甘油三乙酸酯。
15. -種分離的核酸分子，選自： (a) 編碼具有過(guò)水解活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO : 16的氨基酸序列； (b) 包含SEQ ID NO : 13或SEQ ID NO : 15的核酸序列的多核苷酸；和 (c) 與（a)或（b)的多核苷酸完全互補(bǔ)的多核苷酸。
16. -種載體，包含權(quán)利要求15所述的核酸分子。
17. -種重組DNA構(gòu)建體，包含可操作地連接至合適的調(diào)控序列的權(quán)利要求15所述的 核酸分子。
18. -種重組宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求17所述的重組DNA構(gòu)建體。
19. 一種用于表達(dá)多肽的方法，包括用權(quán)利要求17所述的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì) 胞。
20. -種具有過(guò)水解活性的分離的多肽，包含SEQ ID N0:14或SEQ ID N0:16的氨基 酸序列。
21. -種衣物洗滌護(hù)理組合物，包含： a)多肽，所述多肽具有過(guò)水解活性和與SEQ ID NO :4中所示的氨基酸序列具有至少 80%同一性的氨基酸序列，前提條件是結(jié)合至起催化作用的組氨酸的C-末端側(cè)的氨基酸 殘基不是谷氨酸； b) 至少一種選自下列的底物： (i) 一種或多種具有以下結(jié)構(gòu)的酯： 卿5 其中 X =SR6-C(0)0 的酯基； R6 =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈、支化或環(huán)狀烴基部分，其中對(duì)于 R6 = C2-C7, R6任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； R5 =任選地被羥基取代的C1-C6直鏈、支化或環(huán)狀烴基部分，或五元環(huán)狀雜芳族部分， 或六元環(huán)狀芳族或雜芳族部分；其中R5中的每個(gè)碳原子單獨(dú)地包含不超過(guò)一個(gè)羥基，或不 超過(guò)一個(gè)酯基或羧酸基；其中R5任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； m = 1至1?5中碳原子數(shù)范圍內(nèi)的整數(shù)；并且 其中所述酯在25°C下具有至少5ppm的水中溶解度； (ii) 一種或多種具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯：
其中& =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C21直鏈或支鏈烷基，并且R3和R4單獨(dú)地為H或￥(0); (iii) 一種或多種下式的酯：
其中& =任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直鏈或支鏈烷基，并且R2 = C1-C10直鏈或支鏈烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、（CH2CH20) n、* (CH2CH(CH3) -0)nH，并且 n 為 1 至 10 ; (iv) -種或多種?；膯翁?、?；亩?、或?；亩嗵?；和（v) (i)至（iv)的任何組 合；和 c) 過(guò)氧源；和 d) 至少一種表面活性劑。
22. -種個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品，包含具有過(guò)水解活性的多肽，所述多肽具有與SEQ ID NO :4中 所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，前提條件是結(jié)合至起催化作用的組 氨酸的C-末端側(cè)的氨基酸殘基不是谷氨酸。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品是洗發(fā)劑、爽身水、沐浴凝 膠、局部保濕劑、牙膏、牙膠、漱口水、含漱液、抗牙斑漱口液或局部清潔劑。
【文檔編號(hào)】C12N9/18GK104350153SQ201380028430
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
【發(fā)明者】M.S.佩恩, R.迪科西莫 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司