專利名稱：一種l-賴氨酸聯(lián)產(chǎn)l-乳酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物化工領域中的氨基酸串聯(lián)生產(chǎn)有機酸的發(fā)酵方法，具體地說，涉及一種L-賴氨酸聯(lián)產(chǎn)L-乳酸的方法。
背景技術：
谷氨酸棒桿菌作為工業(yè)氨基酸(如谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸等)生產(chǎn)的主力軍，其中賴氨酸作為一種堿性必需氨基酸，廣泛應用于食品、飼料和醫(yī)藥工業(yè)中，在平衡氨基酸組成方面起著十分重要的作用。目前，賴氨酸工業(yè)生產(chǎn)以谷氨酸棒桿菌發(fā)酵法為主，好氧發(fā)酵結束后產(chǎn)生的大量菌體一般被用于蛋白飼料加工或者是直接被廢棄，存在一定的資源利用率低下，附加值不高。如果能夠?qū)⒑醚跎a(chǎn)L-賴氨酸的廢棄菌體經(jīng)過簡單的處理，直接用于厭氧生產(chǎn)L-乳酸，這種好氧、厭氧串聯(lián)培養(yǎng)模式能夠充分高效資源利用化，有效地解決L-賴氨酸生產(chǎn)后菌體的高附加值利用，以及厭氧生產(chǎn)L-乳酸菌體培養(yǎng)的高成本等問題。L-乳酸主要應用于食品工業(yè)、醫(yī)藥、化妝品等領域，也是生物可降解材料聚乳酸的單體之一。聚乳酸的生產(chǎn)和應用開發(fā)，為消滅“白色”污染產(chǎn)生劃時代意義，市場潛力巨大。發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸根據(jù)合成乳酸的代謝途徑及生成產(chǎn)物的不同，可將乳酸發(fā)酵分為同型、異型和混合型，但是發(fā)酵過程中的共性都是以高密度的菌體培養(yǎng)為前提，這需要消耗大量的能耗，特別是對于聚乳酸取代傳統(tǒng)塑料的生成成本成為很大的制約。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種L-賴氨酸聯(lián)產(chǎn)L-乳酸的方法。該方法回收生產(chǎn)L-賴氨酸的菌體，再次厭氧發(fā)酵來生產(chǎn)L-乳酸，操作簡單，設備要求不高，易于自動化控制，具有很好的經(jīng)濟效益。為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下:`
一種L-賴氨酸聯(lián)產(chǎn)L-乳酸的方法，該方法包括如下步驟:(I)將L-賴氨酸生產(chǎn)菌好氧培養(yǎng)48 72h (優(yōu)選60h)發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸；(2)離心收集好氧培養(yǎng)后的菌體,厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基重懸該菌泥,然后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，通入N2氣體維持罐內(nèi)正壓,28 34°C (優(yōu)選30°C)下,攪拌培養(yǎng)24 40小時,并維持厭氧發(fā)酵液的pH在6.5 7.5,發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。步驟(I)中，所述的L-賴氨酸生產(chǎn)菌為常規(guī)使用的谷氨酸棒桿菌，如谷氨酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum ATCC21300 和谷氨酸棒桿菌 Corynebacteriumglutamicum ATCC21513。步驟⑴中，所述的好氧培養(yǎng)條件為:好氧培養(yǎng)基包括如下組分:葡萄糖80g/L，K2HPO4.3H201.0g/L, KH2PO4L Og/L,MgSO4.7Η200.25g/L, (NH4) 2S0440g/L, Mn2+、Fe2+0.02g/L, ZnCl2lmg/L, CuSO40.2mg/L,生物素100 μ g/L, VB1200 μ g/L, CaC0330g/L, pH 為 7.0 ;培養(yǎng)溫度:28 34°C，優(yōu)選30°C ；
通氣比:0.5 1.5v/vm,優(yōu)選 lv/vm。步驟(I)中，所述的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分:葡萄糖40 80g/L，K2HPO4.3H200.5g/L, KH2PO40.5g/L, MgSO4.7H200.5g/L, Mn2+、Fe2+0.02g/L,生物素 100 μ g/L,維生素 B1200 μ g/L,初始 ρΗ7.0。步驟(2)中，使用碳酸鹽、氨水和堿液中的任意一種或幾種的組合維持厭氧發(fā)酵液的pH在6.5 7.5。本發(fā)明的L-賴氨酸生產(chǎn)菌在好氧發(fā)酵之前許經(jīng)過常規(guī)的種子培養(yǎng):將于固體LB平板上30°C培養(yǎng)20 24h，然后用接種環(huán)挑取3環(huán)菌至裝有30mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，30°C，200r/min培養(yǎng)12 14h，此時的菌體0D_值約為25-28，然后一般按照3 (v/V) %接種量將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基進行好氧發(fā)酵培養(yǎng)。其中所述的種子培養(yǎng)基包括如下組分:葡萄糖 20g/L，K2HPO4.3H201.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4.7H200.4g/L，尿素 2.5g/L，Mn2+、Fe2+0.02g/L，生物素 100 μ g/L, VB1200 μ g/L, pH 為 7.0。有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)勢。1、對本發(fā)明獲得的產(chǎn)物進行分析，谷氨酸棒桿菌在好氧條件下，積累18 22g/LL-賴氨酸；厭氧條件下，能顯著的積累L-乳酸，因此其產(chǎn)業(yè)化的經(jīng)濟效益是明顯的。2、利用本發(fā)明的方法，賴氨酸好氧發(fā)酵階段結束時產(chǎn)生大量的菌體，直接利用其厭氧生產(chǎn)L-乳酸，省去了厭氧過程菌體富集的過程，有效的利用了生物質(zhì)資源，降低了生產(chǎn)成本。厭氧發(fā)酵L-乳酸后的廢棄菌體，可再生產(chǎn)蛋白飼料、核酸等，繼續(xù)創(chuàng)造高附加值利潤。3、本發(fā)明的生產(chǎn)工藝較原有的單純好氧產(chǎn)氨基酸，厭氧產(chǎn)有機酸，菌體高效回收利用，無需添加格外的輔料 ，對環(huán)境無污染，是環(huán)境友好的工藝方法。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。以下實施例中，種子培養(yǎng)基包括如下組分:葡萄糖20g/L，K2HPO4.3H201.5g/L, KH2PO40.5g/L，MgSO4.7Η200.4g/L，尿素 2.5g/L，Mn2+、Fe2+0.02g/L，生物素 100 μ g/L, VB1200 μ g/L, pH 為
7.0。好氧培養(yǎng)基包括如下組分:葡萄糖80g/L，K2HPO4.3H201.0g/L, KH2PO4L Og/L,MgSO4.7H200.25g/L, (NH4) 2S0440g/L, Mn2+、Fe2+0.02g/L, ZnCl2lmg/L, CuSO40.2mg/L,生物素100 μ g/L, VB1200 μ g/L, CaC0330g/L, pH 為 7.0。厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分:葡萄糖40 80g/L，K2HPO4.3H200.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4.7Η200.5g/L, Mn2+、Fe2+0.02g/L，生物素 100 μ g/L，維生素 B1200 μ g/L，初始ρΗ7.0。所述的賴氨酸生產(chǎn)菌Corynebacterium glutamicum ATCC21300 和Corynebacterium glutamicum ATCC21513均為常規(guī)使用的谷氨酸棒桿菌,可市售獲得。實施例1:
將L-賴氨酸生產(chǎn)菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC21513)于固體LB平板上30°C培養(yǎng)20h，用接種環(huán)挑取3環(huán)菌至30mL種子培養(yǎng)基，30°C，200r/min培養(yǎng)12h，按接種量3 (v/v) %將種子液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基,30°C, 500r/min,通氣比為lv/vm,培養(yǎng)60h。好氧發(fā)酵結束后，5000r/min離心IOmin,收集菌體,用厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基(其中含40g/L葡萄糖)洗漆一次，然后重懸在厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，通入N20.2v/vm,轉(zhuǎn)速200r/min, 30°C培養(yǎng)24h。發(fā)酵結果，好氧階段L-賴氨酸產(chǎn)量為18.6g/L，厭氧階段L-乳酸產(chǎn)量為30.2g/L。實施例2:將L-賴氨酸生產(chǎn)菌(Corynebacterium glutamicum ATCC21300)于固體 LB 平板上30°C培養(yǎng)20h，用接種環(huán)挑取3環(huán)菌至30mL種子培養(yǎng)基，30°C，200r/min培養(yǎng)12h，按接種量3 (v/v) %將種子液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基，300C，200r/min,通氣比為lv/vm，培養(yǎng)60h。好氧發(fā)酵結束后，5000r/min離心IOmin,收集菌體,用厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基(其中含80g/L葡萄糖)洗漆一次，然后重懸在厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，通入N20.2v/vm,轉(zhuǎn)速200r/min,30°C培養(yǎng)40h。測定發(fā)酵產(chǎn)物，好氧階段L-賴氨酸產(chǎn)量為18.2g/L，厭氧階段L-乳酸產(chǎn)量為 64.8g/L。實施例3:
將L-賴氨酸生產(chǎn)菌(Corynebacterium glutamicum ATCC21513)于固體 LB 平板上30°C培養(yǎng)20h，用接種環(huán)挑取3環(huán)菌泥至30mL種子培養(yǎng)基，30°C，200r/min培養(yǎng)12h，按接種量3 (v/v) %將種子液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基，300C，500r/min,通氣比為lv/vm，培養(yǎng)72h，通氣比為lv/vm。好氧發(fā)酵結束后，5000r/min離心IOmin,收集菌體,用厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基(其中含60g/L葡萄糖)洗滌一次，然后重懸在厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，通入N20.2v/Vm，200r/min，3(TC培養(yǎng)40h。測定發(fā)酵產(chǎn)物，好氧階段L-賴氨酸產(chǎn)量為21.5g/L，厭氧階段L-乳酸產(chǎn)量為51.3g/L。實施例4:將L-賴氨酸生產(chǎn)菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC21300)于固體LB平板上30°C培養(yǎng)20h，用接種環(huán)挑取3環(huán)菌泥至30mL種子培養(yǎng)基，30°C，200r/min培養(yǎng)12h，按接種量3(v/v)%將種子液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，500r/min，通氣比為lv/vm，培養(yǎng)72h。好氧發(fā)酵結束后，5000r/min離心IOmin,收集菌體,用厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基(其中含40g/L葡萄糖)洗漆一次，然后重懸在厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，通入N20.2v/vm, 200r/min, 30°C培養(yǎng)40h。測定發(fā)酵產(chǎn)物，好氧階段L-賴氨酸產(chǎn)量為20.5g/L，厭氧階段L-乳酸32.7g/L。
權利要求
1.一種L-賴氨酸聯(lián)產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)將L-賴氨酸生產(chǎn)菌好氧培養(yǎng)48 72h發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸； (2)離心收集好氧培養(yǎng)后的菌體，厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基重懸該菌泥，然后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，通入N2氣體維持罐內(nèi)正壓，28 34°C下，攪拌培養(yǎng)24 40小時，并維持厭氧發(fā)酵液的pH在6.5 7.5，發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的L-賴氨酸聯(lián)產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的L-賴氨酸生產(chǎn)菌為常規(guī)使用的谷氨酸棒桿菌。
3.根據(jù)權利要求1所述的L-賴氨酸聯(lián)產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的好氧培養(yǎng)條件為: 好氧培養(yǎng)基包括如下組分:葡萄糖80g/L, K2HPO4.3Η201.0g/L, KH2PO4L Og/L,MgSO4.7Η200.25g/L, (NH4) 2S0440g/L, Mn2+、Fe2+0.02g/L, ZnCl2lmg/L, CuSO40.2mg/L,生物素100 μ g/L, VB1200 μ g/L, CaC0330g/L, pH 為 7.0 ;培養(yǎng)溫度:28 34°C ; 通氣比:0.5 1.5v/vm。
4.根據(jù)權利要求1所述的L-賴氨酸聯(lián)產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分:葡萄糖40 80g/L，K2HPO4.3H200.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4.7Η200.5g/L,Mn2+、Fe2+0.02g/L,生物素 100 μ g/L，維生素 B1200 μ g/L，初始 ρΗ7.0。
5.根據(jù)權利要求1所述的L-賴氨酸聯(lián)產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，步驟(2)中，使用碳酸鹽、氨水和堿液中的任意一種或幾種的組合維持厭氧發(fā)酵液的pH在6.5 7.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種L-賴氨酸聯(lián)產(chǎn)L-乳酸的方法，該方法包括如下步驟(1)將L-賴氨酸生產(chǎn)菌好氧培養(yǎng)48～72h發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸；(2)離心收集好氧培養(yǎng)后的菌體，厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基重懸該菌泥，然后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，通入N2氣體維持罐內(nèi)正壓，28～34℃下，攪拌培養(yǎng)24～40小時，并維持厭氧發(fā)酵液的pH在6.5～7.5，發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。對發(fā)酵后的產(chǎn)品進行分析，在好氧條件下谷氨酸棒桿菌能夠很好的積累L-賴氨酸，厭氧條件下積累大量L-乳酸。
文檔編號C12R1/15GK103184247SQ201310119660
公開日2013年7月3日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權日2013年4月8日
發(fā)明者孟虎 申請人:紹興市安杰生物科技有限公司