用于提高堿性蛋白酶的溶解度的方法
【專利摘要】提供在液體洗滌劑中表現(xiàn)出提高的溶解度的堿性蛋白酶。由SEQ?ID?NO:2所表示的氨基酸序列或與其具有80％或更多序列同一性的氨基酸序列組成的突變堿性蛋白酶，其中選自SEQ?ID?No:2所表示的氨基酸序列的預(yù)定位置或與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基被取代。
【專利說明】用于提高堿性蛋白酶的溶解度的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及用于提高堿性蛋白酶在液體洗滌劑中的溶解度的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白酶已經(jīng)在工業(yè)領(lǐng)域使用很長一段時間，并應(yīng)用到極為廣泛種類的產(chǎn)品，例如 包括織物洗滌劑的洗滌劑、纖維改良劑、皮革處理劑、化妝品、沐浴鹽、食品改良劑和醫(yī)藥產(chǎn) 品。其中，工業(yè)上最大量地制造的是用于洗滌劑的蛋白酶。例如，通常已知的是Alcalase、 Savinase (注冊商標(biāo)；Novozymes)、Maxacal (注冊商標(biāo)；Genencor)、BLAP (注冊商標(biāo)； Henkel))和 KAP(Kao Corp.)。
[0003] 將蛋白酶添加到洗滌劑的目的是使主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成的、附著到衣物材料上的污 漬分解為低分子物質(zhì)，從而加速表面活性劑的增溶。然而，污漬實(shí)際上是復(fù)合物，其不僅含 有蛋白質(zhì)，而且含有多個組分，包括組合的有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)物質(zhì)（例如源自皮脂的脂質(zhì)和 固體顆粒）。然后，已經(jīng)開發(fā)出對復(fù)合污漬（即不僅含有蛋白質(zhì)，而且含有皮脂和其他物質(zhì)） 表現(xiàn)出優(yōu)異洗滌性能的分子量為約43, 000的堿性蛋白酶并申請了專利（參見專利文件1)。 該堿性蛋白酶與枯草桿菌蛋白酶（其為常規(guī)已知的源自芽孢桿菌屬細(xì)菌的絲氨酸蛋白酶） 不同，具有不同的分子量、初級結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)，并且與枯草桿菌蛋白酶尤其不同的是堿性 蛋白酶具有極強(qiáng)的抗氧化性。因此，提議將堿性蛋白酶分類到新的枯草桿菌蛋白酶亞族中 (非專利文件1)。
[0004] 洗滌劑可基于其形式而分為粉末洗滌劑和液體洗滌劑。液體洗滌劑與粉末洗滌劑 相比具有優(yōu)異的溶解性。液體洗滌劑具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槲聪♂尩囊后w洗滌劑可以直接施用于 污漬上。另外，近來，通過使用一半量而與常規(guī)液體洗滌劑起等同作用的液體洗滌劑（所謂 的濃縮液體洗滌劑）已市售可得。由于這樣的濃縮液體洗滌劑包含在小容器內(nèi)，其不需要 大的儲存空間或大量用于運(yùn)輸?shù)娜剂?。除了這些優(yōu)點(diǎn)之外，基于洗滌機(jī)制的徹底重新考慮， 一些產(chǎn)品顯示出改善的漂洗性能。以這種方式，可以減少洗衣所需的時間，并且可以節(jié)省所 需的水。
[0005] 為了恒定地保持含酶液體洗滌劑的預(yù)定的酶活性，需要使液體洗滌劑中溶解的酶 例如蛋白酶穩(wěn)定。此外，為了增強(qiáng)洗滌劑的去污力，期望的是將酶盡可能多地加入到洗滌劑 中。然而，眾所周知，技術(shù)上難以穩(wěn)定地將酶與液體洗滌劑混合。例如，在常溫下將酶儲存 在液體中容易引起蛋白質(zhì)的變性。此外，表面活性劑、脂肪酸、溶劑和其他物質(zhì)包含在液體 洗滌劑中并且其pH為弱堿性。因此，液體洗滌劑對于酶是極其嚴(yán)酷的環(huán)境條件。此外，蛋 白酶是蛋白水解酶。因?yàn)樵撎卣?，蛋白酶遭受自身消化，這進(jìn)一步使得難以將蛋白酶穩(wěn)定地 儲存在液體洗滌劑中。此外，濃縮液體洗滌劑（與常規(guī)液體洗滌劑相比是濃縮的）的低水 含量使得難以溶解大量的酶。
[0006] 作為在液體洗滌劑中穩(wěn)定地保持酶活性的技術(shù)，已知的是添加酶穩(wěn)定劑，例如鈣 離子、硼砂、硼酸、硼化合物、羧酸如甲酸、和多元醇。此外，已經(jīng)研究了通過抑制蛋白酶活性 來克服自身消化。已經(jīng)報道了通過4-取代的苯基硼酸（專利文件2)和通過某種肽醛和硼 組合物（專利文件3)可逆抑制蛋白酶而使蛋白酶穩(wěn)定的方法。而且，據(jù)報道，用右旋糖酐 化學(xué)改性的蛋白酶的穩(wěn)定性可以在含有表面活性劑的水溶液中得到改善（非專利文件2)。 此外，關(guān)于表面活性劑穩(wěn)定性提高的蛋白酶突變體也是已知的（專利文件4至6)。
[0007] 相比之下，目前還沒有開發(fā)出用于提高酶關(guān)于液體洗滌劑的溶解度的技術(shù)。
[0008] 引用列表
[0009] 專利文件
[0010] [專利文件 1]W0"/18218A
[0011] [專利文件 2] JP-A-11-507680
[0012] [專利文件 3] JP-A-2000-506933
[0013] [專利文件 4] JP-A-2009-034062
[0014] [專利文件 5] JP-A-2009-034063
[0015] [專利文件 6]W〇2〇10/l26l56A
[0016] 非專利文件
[0017] [非專利文件 1] Saeki 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun.，279, 313-319, 2000.
[0018] [非專利文件 2]Cosmetics&Toiletries magazine, 111，p79_88, 1996.


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 更具體地，在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供提高堿性蛋白酶在液體洗滌劑中的溶 解度的方法，該方法包括，在由SEQ ID N0:2所表示的氨基酸序列或與其具有80%或更多 同一性的氨基酸序列組成的堿性蛋白酶中，將選自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表 1-1和表1-2的列（i)中所述的位置或與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基的至少一個氨基 酸殘基用表1-1和表1-2的列（ii)中所述的氨基酸殘基取代。
[0020] [表 1-1]
[0021]

【權(quán)利要求】
1. 一種提高堿性蛋白酶在液體洗滌劑中的溶解度的方法，所述方法包括，在由SEQ ID N0:2所表示的氨基酸序列或與其具有80%或更多同一性的氨基酸序列組成的堿性蛋白酶 中，將選自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表1-1和表1-2的列（i)中所述的位置或 與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基用表1-1和表1-2的列（ii)中 所述的氨基酸殘基取代。 [表 1-1]

2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述同一性為90%或更高。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的30位、 68位和255位或與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基是下面示出的氨基酸殘基： 30位或與其相對應(yīng)的位置：天冬氨酸； 68位或與其相對應(yīng)的位置：組氨酸；以及 255位或與其相對應(yīng)的位置：絲氨酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列 的表2的列（i)中所述的位置或與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基是表2的列（ii)中所 述的氨基酸殘基。 [表2]

5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一個氨基酸殘基包括選自 (A) 405位、（B) 81位、（C) 40位、（D) 191位和（E) 59位或與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基 的至少一個氨基酸殘基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一個氨基酸殘基包括選自 (A) 405位、（B) 81位、（C) 40位、（D) 191位和（E) 59位或與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基 的至少兩個氨基酸殘基。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中選自（A)405位、（B)81位、（C)40位、 (D) 191位和（E) 59位或與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基的所述至少一個氨基酸殘基被 下面所述的氨基酸殘基取代： (A) 405位或與其相對應(yīng)的位置：亮氨酸或色氨酸； (B) 81位或與其相對應(yīng)的位置：亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或色氨酸； (C) 40位或與其相對應(yīng)的位置：異亮氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸； (D) 191位或與其相對應(yīng)的位置：亮氨酸或纈氨酸；以及 (E) 59位或與其相對應(yīng)的位置：纈氨酸、異亮氨酸或亮氨酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述液體洗滌劑是包括40?90質(zhì) 量％的表面活性劑的濃縮液體洗滌劑。
9. 一種突變堿性蛋白酶，其由SEQ ID N0:2所表示的氨基酸序列或與其具有80%或 更多同一'I"生的氨基酸序列組成，其中選自SEQ ID No:2所表不的氨基酸序列的表3-1和表 3-2的列（i)中所述的位置或與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基是 表3-1和表3-2的列（ii)中所述的氨基酸殘基。 [表 3-1]


10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的突變堿性蛋白酶，其中所述同一性為90%或更高。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的突變堿性蛋白酶，其中SEQ ID N〇:2所表示的氨基酸 序列的30位、68位和255位或與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基是下面示出的氨基酸殘 基： 30位或與其相對應(yīng)的位置：天冬氨酸； 68位或與其相對應(yīng)的位置：組氨酸；以及 255位或與其相對應(yīng)的位置：絲氨酸。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的突變堿性蛋白酶，其中SEQ ID N〇:2所表示 的氨基酸序列的表4的列（i)中所述的位置或與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基是表4的 列（ii)中所述的氨基酸殘基。

13. 根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項(xiàng)所述的突變堿性蛋白酶，其中所述至少一個氨基酸 殘基包括選自（A'）405位、（B'）81位、（C'）40位、（D'）191位和（E'）59位或與其相對應(yīng)的 位置處的氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基。
14. 根據(jù)權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所述的突變堿性蛋白酶，其中所述至少一個氨基酸 殘基包括選自（A'）405位、（B'）81位、（C'）40位、（D'）191位和（E'）59位或與其相對應(yīng)的 位置處的氨基酸殘基的至少兩個氨基酸殘基。
15. 根據(jù)權(quán)利要求9至14中任一項(xiàng)所述的突變堿性蛋白酶，其中選自（A'）405位、 (B'）81位、（C'）40位、（D'）191位和（E'）59位或與其相對應(yīng)的位置處的氨基酸殘基的所述 至少一個氨基酸殘基被下面所述的氨基酸殘基取代： (A'）405位或與其相對應(yīng)的位置：亮氨酸或色氨酸； (B'）81位或與其相對應(yīng)的位置：亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或色氨酸； (C'）40位或與其相對應(yīng)的位置：異亮氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸； (D'）191位或與其相對應(yīng)的位置：亮氨酸或纈氨酸；以及 (E'）59位或與其相對應(yīng)的位置：纈氨酸、異亮氨酸或亮氨酸。
16. -種編碼根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的突變堿性蛋白酶的基因。
17. -種包括根據(jù)權(quán)利要求16所述的基因的重組載體。
18. -種包括根據(jù)權(quán)利要求17所述的重組載體的轉(zhuǎn)化體。
19. 一種使用根據(jù)權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生突變堿性蛋白酶的方法。
20. -種包括根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的突變堿性蛋白酶的液體洗滌劑組合 物。
【文檔編號】C12N9/52GK104204201SQ201380014362
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月10日
【發(fā)明者】東畑正敏, 西村祐美, 和田恭尚, 佐伯勝久, 奧田光美 申請人:花王株式會社