編碼fasciated ear4(fea4)的核苷酸序列及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)莖端分生組織尺寸的方法和組合物。提供了用于調(diào)節(jié)fea4序列在宿主植物或植物細(xì)胞中的表達(dá)以調(diào)節(jié)諸如改變的尺寸和器官(包括植物種子)數(shù)的農(nóng)學(xué)特性的方法。
【專利說明】編碼FASCIATED EAR4(FEA4)的核苷酸序列及其使用方法
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求提交于2012年3月14日的美國臨時申請61/610730和提交于2013 年1月31日的美國臨時申請61/759342的權(quán)益，每個申請全部內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0003] 政府I持
[0004] 本文所述發(fā)明受政府整體或部分支持，美國批準(zhǔn)號為0604923,由國家科學(xué)基金 會（National Science Foundation)以植物基因組研宄項目贈款計劃（Plant Genome Research Project Grants Program)資助。美國政府在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本發(fā)明涉及植物基因操縱領(lǐng)域，尤其是植物中基因活性和發(fā)育的操縱。

【背景技術(shù)】
[0006] 葉和產(chǎn)生分枝與花的腋生分生組織以規(guī)則型式起始于莖端分生組織（SAM)。莖端 分生組織頂端的細(xì)胞用作干細(xì)胞，其分裂以連續(xù)置換子細(xì)胞至周圍區(qū)域，其中它們進(jìn)入分 化的葉或花原基。分生組織從而能夠在發(fā)育期間通過平衡細(xì)胞增殖與細(xì)胞進(jìn)入新的原基來 調(diào)節(jié)它們的大小。SAM提供植物體的所有地上部分。干細(xì)胞調(diào)節(jié)的中心概念通過CLAVATA/ WUSCHEL(CLV/WUS)基因的信號途徑是已知的。在擬南芥（Arabidopsis)中的CLV1、CLV2、 或CLV3活性損失引起未分化細(xì)胞在莖頂端的積聚，指示CLV基因一起促進(jìn)干細(xì)胞及時轉(zhuǎn) 移到分化途徑中，或抑制干細(xì)胞分裂，或以上兩者（Fletcher等人，（1999)Science 283: 1911-1914 ;Taguchi_Shiobare 等人，（2001)Genes and Development 15 :2755-5766;和 Trotochaud 等人，（1999)Plant Cell 11 :393-405 ;Merton 等人，（1954)Am.J.Bot. 41: 726-32，以及 Szymkowiak 等人，（1992)Plant Cell 4 :1089-100 ;Yamamoto 等人，（2000) Biochim.Biophys. Acta. 1491 :333-40)。CLV1/2 的玉米直系同源物是 TDl 和 FEA2,它們已 經(jīng)被報道了（Taguchi-Shiobara 等人，（2001) Genes Dev. 6515 :2755-66)。期望能夠控制苗 和花分生組織的尺寸和外觀，從而提供提高的葉、花、和果實的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明的目的是 為了提供用于調(diào)節(jié)分生組織發(fā)育的新型方法和組合物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在一個實施例中，本發(fā)明提供產(chǎn)生具有下降的內(nèi)源Fea4表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物的方 法，該方法包括以下步驟：（a)將重組構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組構(gòu)建體 包含可操作地連接至啟動子的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列的表達(dá)降低內(nèi)源 Fea4的 表達(dá)；(b)在步驟（a)之后，由可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物在其 基因組中包含重組DNA構(gòu)建體；以及（c)選擇（b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物包含重 組DNA構(gòu)建體且在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出下降的Fea4。
[0008] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供產(chǎn)生具有下降的內(nèi)源Fea4表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物的 方法，該方法包括以下步驟：（a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組 DNA構(gòu)建體包含以有義或反義取向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多核 苷酸，其中多核苷酸包含：（i) SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列；（ii)基于Clustal W比對 方法，在與SEQ ID NO :1或2進(jìn)行比較時具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列；（iii) SEQ ID NO :1或2的至少100個連續(xù)的核苷酸的核苷酸序列；（iv)能夠在嚴(yán)格條件下與（i) 的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或（V)經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中該前體已經(jīng)經(jīng)修飾 以用設(shè)計用于產(chǎn)生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替換miRNA編碼區(qū)；(b)在步驟 (a) 之后，由所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中 包含重組DNA構(gòu)建體；以及（c)選擇（b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物包含重組DNA構(gòu) 建體且在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出下降的Fea4表達(dá)。
[0009] 本發(fā)明的一個實施例是產(chǎn)生具有改變的農(nóng)學(xué)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包 括以下步驟：(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包 含可操作地連接至至少一個調(diào)控序列的分離的多核苷酸，其中多核苷酸編碼多肽的片段或 變體，基于Clustal W比對方法，該多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :3進(jìn)行比較時 具有至少80%的序列同一性，其中片段或變體賦予在可再生的植物細(xì)胞中的顯性負(fù)表型； (b) 在步驟（a)之后，由可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基 因組中包含重組DNA構(gòu)建體；以及（c)選擇（b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物包含重組 DNA構(gòu)建體且在與不包含重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一種選自下列 的農(nóng)學(xué)特性的改變：穗分生組織尺寸、籽粒行數(shù)、葉數(shù)、花序數(shù)、在花序內(nèi)的分枝、花數(shù)、果實 數(shù)、種子數(shù)、植物高度、生物量和產(chǎn)量。
[0010] 本發(fā)明的另一個實施例是上述方法，其中部分（a)的多肽在具有fea4突變體基因 型的植物品系中的表達(dá)能夠部分或全部恢復(fù)野生型表型。
[0011] 本發(fā)明的一個實施例是鑒定fea4的較弱等位基因的方法，該方法包括以下步驟： (a)對突變體玉米植物的群體進(jìn)行基因篩選；(b)鑒定表現(xiàn)出比fea4無效植物更弱的fea4 表型的一個或多個突變體玉米植物；以及（c)從具有更弱的fea4表型的突變體玉米植物中 鑒定弱fea4等位基因。
[0012] 本發(fā)明的一個實施例是鑒定fea4的較弱等位基因的方法，該方法包括以下步驟： (a)利用SEQ ID N0:1或2進(jìn)行基因改組；(b)將來自步驟（a)的經(jīng)改組的序列轉(zhuǎn)化到可再 生的植物細(xì)胞的群體中；(c)由步驟（b)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的可再生的植物細(xì)胞的群體再生經(jīng)轉(zhuǎn)化 的植物的群體；（d)針對弱fea4表型，篩選來自步驟（c)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的群體；以及（e) 從表現(xiàn)出弱fea4表型的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中鑒定弱fea4等位基因。
[0013] 本發(fā)明的一個實施例是其中內(nèi)源Fea4基因表達(dá)相對于對照植物被抑制的植物。 本發(fā)明的另一個實施例是制備所述植物的方法，該方法包括以下步驟：(a)向內(nèi)源Fea4基 因中引入突變；以及（b)檢測該突變，其中該突變對于抑制內(nèi)源Fea4基因的表達(dá)是有效的。 在一個實施例中，（a)和（b)的步驟是使用定向誘導(dǎo)基因組局部突變（TILLING)方法來完 成的。在另一個實施例中，該突變是位點特異性突變。
[0014] 本發(fā)明的一個實施例是表現(xiàn)出相對于野生型植物更弱的fea4表型的植物。另一 個實施例是制備所述植物的方法，其中該方法包括以下步驟：(a)將轉(zhuǎn)座子引入到包含內(nèi) 源Fea4基因的種質(zhì)中；(b)獲取步驟（a)的種質(zhì)的子代；（c)以及鑒定步驟（b)的子代植 物，其中轉(zhuǎn)座子已經(jīng)插入到內(nèi)源Fea4基因，并且觀察到Fea4表達(dá)的下降。步驟（a)還可包 括通過轉(zhuǎn)化來將轉(zhuǎn)座子引入到種質(zhì)的可再生植物細(xì)胞以及由可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn) 基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含轉(zhuǎn)座子。
[0015] 在一個實施例中，提供了上述方法，其中所述方法還包括以下步驟：（a)將重組構(gòu) 建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組構(gòu)建體包含通過上述方法鑒定的弱fea4等位 基因；(b)在步驟（a)之后，由可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在 其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體；以及（c)選擇（b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物包含 重組DNA構(gòu)建體且在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出弱fea4表 型。
[0016] 另一個實施例是產(chǎn)生具有改變的農(nóng)學(xué)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括（a) 將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含以有義或反義取 向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多核苷酸，其中多核苷酸包含：（i) SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列；（ii)基于Clustal W比對方法，在與SEQ ID NO :1或2進(jìn) 行比較時具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列；（iii) SEQ ID NO :1或2的至少100個 連續(xù)的核苷酸的核苷酸序列；（iv)能夠在嚴(yán)格條件下與（i)的核苷酸序列雜交的核苷酸序 列；或（V)經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中該前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設(shè)計用于產(chǎn)生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替換miRNA編碼區(qū)；(b)在步驟（a)之后，由可再生的植物細(xì)胞再 生出轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體；以及（c)選擇（b)的 轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物包含重組DNA構(gòu)建體且在與不包含重組DNA構(gòu)建體的對照植 物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一種選自下列的農(nóng)學(xué)特性的改變：增大的穗分生組織、籽粒行數(shù)、 種子數(shù)、植物高度、生物量和產(chǎn)量。另一個實施例是通過這種方法產(chǎn)生的植物。
[0017] -個實施例是在植物中表達(dá)異源多核苷酸的方法，該方法包括（a)用重組DNA構(gòu) 建體轉(zhuǎn)化可再生的植物細(xì)胞，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至第二多核苷酸的異 源多核苷酸，其中第二多核苷酸是Fea4啟動子；(b)在步驟（a)之后，由可再生的植物細(xì) 胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體；以及（c)選擇 (b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物包含重組DNA構(gòu)建體，并且進(jìn)一步地，其中異源多核苷 酸在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。另一個實施例是在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述 重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至第二多核苷酸的異源多核苷酸，，其中第二多核苷酸 是Fea4啟動子，并且其中異源多核苷酸在植物中表達(dá)。
[0018] 另一個實施例是鑒定具有至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變的第一玉米植物或第一玉米 種質(zhì)的方法，該方法包括在第一玉米植物或第一玉米種質(zhì)中檢測至少一種與所述表型相關(guān) 聯(lián)的標(biāo)記基因座的多態(tài)性，其中標(biāo)記基因座編碼多肽，所述多肽包含選自下列的氨基酸序 列：a)與SEQ ID NO :3具有至少90%且小于100%的序列同一性的氨基酸序列，其中在與對 照植物進(jìn)行比較時，所述多肽在植物或其植物部分中的表達(dá)引起至少一種選自下列的農(nóng)學(xué) 特性的改變：穗分生組織尺寸、籽粒行數(shù)、花序數(shù)、在花序內(nèi)的分枝、花數(shù)、果實數(shù)和種子數(shù)， 其中對照植物包含SEQ ID NO :3。
[0019] 本發(fā)明包括包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體，該分離的多核苷酸 以有義或反義取向可操作地連接至莖端分生組織特異性的或莖端分生組織優(yōu)選的啟動子。
[0020] 本發(fā)明包括載體，細(xì)胞、植物或種子，其包含本發(fā)明所述的任何重組DNA構(gòu)建體 中。
[0021 ] 本發(fā)明涵蓋通過本文所述方法產(chǎn)生的植物。
[0022] 本發(fā)明也包括包含上文所描述的重組DNA構(gòu)建體的再生的、成熟的和能繁殖的轉(zhuǎn) 基因植物、從其產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子、Tl和后續(xù)的世代。所述轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞、組織、植物 和種子可以包含至少一種所關(guān)注的重組DNA構(gòu)建體。
[0023] 在一個實施例中，植物選自：擬南芥、番前、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小 麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
[0024] 在一個實施例中，包含本發(fā)明所描述的重組構(gòu)建體的植物是單子葉植物。在另一 個實施例中，包含本發(fā)明所描述的重組構(gòu)建體的植物是玉米植物。

【專利附圖】

【附圖說明】 [0025] 和序列表
[0026] 根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可以更全面地理解本發(fā)明，以下的詳 細(xì)描述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。此序列表中以單個字母表示核苷酸，以 三個字母表不氨基酸，如 Nucleic Acids Researchl3 :3021-3030(1985)和 Biochemical Journal 219(No. 2) :345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，它們以引用方 式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循37C. F. R. § 1. 822所示 的規(guī)定。
[0027] 圖IA示出fea4在染色體6上的位點。圖IB示出fea4中的位點特異性突變和Mu 轉(zhuǎn)座子插入位點。圖IC示出FEA4蛋白質(zhì)內(nèi)的域。
[0028] 圖2A示出fea4突變的營養(yǎng)表型。圖2B比較野生型（左側(cè)）與fea4突變體（右 偵D的雄穗。圖2C比較野生型（左側(cè)）與fea4突變體（右側(cè)）的穗。圖2D和圖2C分別 示出fea4和野生型的不成熟穗的SEM圖片。
[0029] 圖3A不出fea4、ramosa2和fea4/ramosa2雙突變體的糖和雄糖表型。圖3B不 出fea4、ramosal和fea4/ramosal雙突變體的糖和雄糖表型。圖30不出fea4、ramosa3和 fea4/ramosa3雙突變體的穗和雄穗表型。
[0030] 圖4A示出在fea4和CLAVATA2直系同源物fea2之間的雙突變體的穗表型。圖4B 示出fea4/fea2雙突變體的營養(yǎng)表型。
[0031] 圖5示出fea4途徑的擬建模型。
[0032] 圖6A示出fea4突變體在A619背景下的雄蕊。圖6B給出在fea4突變系中的雄 蕊數(shù)頻率。圖6C示出野生型（WT)A619的雄蕊。圖6D給出在WT系中的雄蕊數(shù)頻率。
[0033] 圖7比較無 FEA4轉(zhuǎn)基因（左側(cè)）的fea4/fea4純合系與已經(jīng)用FEA4編碼序列與 黃色熒光蛋白質(zhì)（YFP)的翻譯融合在天然啟動子控制下轉(zhuǎn)化過的fea4/fea4純合系。
[0034] 圖8A-8D示出分別來自野生型、fea2、fea4和fea4/fea2突變系的F2植物的分生 組織。圖8E示出每個系以毫米表示的分生組織尺寸。
[0035] 序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R. § 1.821-1. 825所列出的關(guān)于專利申 請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三字 母表示氨基酸，如 Nucleic Acids Res. 13 :3021-3030 (1985)和 Biochemical J. 219 (2): 345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，它們以引用方式全文并入本文。用于 核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循如37C. F. R. § 1. 822所示的規(guī)定。
[0036] SEQ ID NO :1是基因組野生型Fea4基因的核苷酸序列。
[0037] SEQ ID NO :2是野生型Fea4的編碼區(qū)的核苷酸序列。
[0038] SEQ ID NO :3是野生型FEA4蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0039] SEQ ID NO :4是基因組突變體fea4-0等位基因的核苷酸序列。
[0040] SEQ ID NO :5是突變體fea4-0等位基因的編碼區(qū)的核苷酸序列。
[0041] SEQ ID NO :6是由突變體fea4-0等位基因編碼的氨基酸序列。
[0042] SEQ ID NO :7是基因組突變體fea4-rel*09-5171等位基因的核苷酸序列。
[0043] SEQ ID NO :8是突變體fea4-rel*09-5171等位基因的編碼區(qū)的核苷酸序列。
[0044] SEQ ID NO :9是由突變體fea4-rel*09-5171等位基因編碼的氨基酸序列。
[0045] SEQ ID NO :10是擬南芥PERIANTHIA(PAN)基因的基因組AT1G68640基因座的核 苷酸序列。
[0046] SEQ ID NO :11是AT1G68640基因座的cDNA的核苷酸序列。
[0047] SEQ ID NO :12是由AT1G68640基因座編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0048] SEQIDN0:13是編碼Sbl0g009592·l(-種來自高粱的FEA4同源物）的核苷酸 序列。
[0049] SEQ ID NO :14是Sbl0g009592. 1 ( -種來自高粱的FEA4同源物）的氨基酸序列。
[0050] SEQ ID NO :15是編碼L0C_0s06gl5480. 1 ( -種來自稻的FEA4同源物）的核苷酸 序列。
[0051] SEQ ID NO :16是L0C_0s06gl5480. 1(-種來自稻的FEA4同源物）的氨基酸序列。
[0052] SEQ ID NO : 17是FEA4啟動子的核苷酸序列。
[0053] SEQ ID NO :18是編碼YFP-FEA4融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0054] SEQ ID NO :19是編碼RFP-FEA4融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0055] SEQ ID NO :20 是 FEA43' -UTR 的核苷酸序列。
[0056] 序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R. § 1.821-1. 825所列出的關(guān)于專利申 請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。
[0057] 此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Res. 13 :3021-3030(1985)和 Biochemical J. 219(No. 2) :345-373(1984)所描述的 IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，它們以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù) 的符號和格式遵循如37C. F. R. § 1. 822所示的規(guī)定。

【具體實施方式】
[0058] 本文中所列出的每篇參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容均全文以引用方式并入本文。
[0059] 除非上下文另外明確規(guī)定，否則如本文和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式"一 個"、"一種"以及"所述"包括復(fù)數(shù)涵義。因此，例如，"一株植物（a plant)"的涵義包括多 株此類植物，"一個細(xì)胞（acell) "的涵義包括一個或多個細(xì)胞以及它們?yōu)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員 所知的等同物，諸如此類。
[0060] 如本文所用：
[0061] 術(shù)語"單子葉植物"和"單子葉的植物"本文互換使用。本發(fā)明的單子葉植物包括 禾本科植物。
[0062] 術(shù)語"雙子葉植物"和"雙子葉的植物"本文互換使用。本發(fā)明的雙子葉植物包括 以下家族：十字花科植物、豆科植物、和茄科植物。
[0063] 術(shù)語"全長互補序列"和"全長的互補序列"本文互換使用，指給定核苷酸序列的 互補序列，其中所述互補序列和核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補的。
[0064] "轉(zhuǎn)基因"指其基因組因異源核酸（諸如重組DNA構(gòu)建體）的存在而發(fā)生改變的任 何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初 的轉(zhuǎn)基因事件通過有性雜交或無性繁殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"不涵蓋 通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重 組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組（染色體基因組或染色體外基因組） 改變。
[0065] "基因組"在用于植物細(xì)胞時不僅涵蓋存在于細(xì)胞核中的染色體DNA，而且還包括 存在于細(xì)胞的亞細(xì)胞組分（例如線粒體、質(zhì)粒）中的細(xì)胞器DNA。
[0066] "植物"包括整個植物、植物器官、植物組織、種子和植物細(xì)胞以及同一植物的子 代。植物細(xì)胞無限制地包括來自種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子 體、孢子體、花粉和小孢子的細(xì)胞。
[0067] "子代"包括植物的任何后續(xù)世代。
[0068] "轉(zhuǎn)基因植物"包括在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。舉例來說，異源多核 苷酸被穩(wěn)定地整合到基因組內(nèi)，以使得該多核苷酸傳給連續(xù)幾代。異源多核苷酸可以單獨 地或作為重組DNA構(gòu)建體的一部分整合到基因組中。
[0069] "性狀"指植物或特定植物材料或細(xì)胞的生理學(xué)、形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、或物理學(xué)特 征。在某些情況下，這種特征是人眼可見的，例如種子或植物大小，或能夠通過生物化學(xué)技 術(shù)測量，例如檢測種子或葉片的蛋白質(zhì)、淀粉、或油含量，或通過觀察代謝或生理過程，如通 過測量缺水耐受性或特定鹽或糖濃度的耐受性，或通過觀察一個或多個基因的表達(dá)水平， 或通過農(nóng)學(xué)觀察如滲透脅迫耐受性或產(chǎn)量。
[0070] "農(nóng)學(xué)特性"是可測量的參數(shù)，包括但不限于低溫脅迫下的穗分生組織尺寸、雄穗 尺寸、綠度、產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總 植物含氮量、果實含氮量、種子含氮量、營養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織 游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實蛋 白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒 伏、植物高度、穗高、穗長耐鹽性、早期幼苗活力和出苗。
[0071 ] 針對序列而言的"異源"意指來自外來物種的序列，或如果來自相同物種，則指通 過蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列。
[0072] "多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"或"核酸片段"可互換使用，并且指作為 單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸 (通常以它們的5'-單磷酸形式存在）通過它們的單字母命名指代如下："A"是指腺苷酸 或脫氧腺苷酸（分別用于RNA或DNA)，"C"是指胞苷酸或脫氧胞苷酸，"G"是指烏苷酸或脫 氧烏苷酸，"U"是指尿苷酸，"T"是指脫氧胸苷酸，"R"是指嘌呤（A或G)，"Y"是指嘧啶（C 或T)，"K"是指G或T，"H"是指或C或T，" I "是指肌苷，"N"是指任何核苷酸。
[0073] "多肽"、"肽"、"氨基酸序列"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚 合物。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類 似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語"多肽"、"肽"、"氨基酸 序列"和"蛋白質(zhì)"還可包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的 γ羧化、羥化和ADP-核糖基化。
[0074] "信使RNA(mRNA) "指無內(nèi)含子并且可由細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。
[0075] "cDNA"指與mRNA模板互補并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可以 是單鏈的或可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。
[0076] "編碼區(qū)"是指當(dāng)轉(zhuǎn)錄、加工、和/或翻譯時導(dǎo)致多肽序列產(chǎn)生的多核苷酸序列。
[0077] "表達(dá)序列標(biāo)簽"（"EST"）是得自cDNA文庫的DNA序列，并且因此是已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄 的序列。EST通常通過cDNA插入序列單程測序獲取。將完整的cDNA插入序列稱為"全長插 入序列"（"FIS"）。"重疊群"序列是由選自，但不限于EST、FIS和PCR序列的兩個或更多 個序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白質(zhì)的序列稱為"完全基因序列"（"CGS"）， 該序列能得自FIS或重疊群。
[0078] "成熟"蛋白質(zhì)指經(jīng)翻譯后加工的多肽；S卩，已經(jīng)去除了存在于初級翻譯產(chǎn)物中的 任何前肽或原肽的多肽。
[0079] "前體"蛋白質(zhì)指mRNA的翻譯初級產(chǎn)物；S卩，具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和 原肽可以是并且不限于細(xì)胞內(nèi)定位信號。
[0080] "分離的"指物質(zhì)，例如核酸和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán)境中 通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或說是該物質(zhì)被從所述組分移出。分離的多核苷酸可 從它們天然存在于其中的宿主細(xì)胞純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得分 離的多核苷酸。該術(shù)語也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸。
[0081] "重組體"是指例如通過化學(xué)合成或通過用基因工程技術(shù)操縱分離的核酸片段來 實現(xiàn)的兩個原本分離的序列片段的人工組合。"重組體"也包括指已經(jīng)通過引入異源核酸而 進(jìn)行了修飾的細(xì)胞或載體，或源于經(jīng)這樣修飾的細(xì)胞的細(xì)胞，但不涵蓋由天然發(fā)生的事件 (如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座）對細(xì)胞或載體的改變，例如沒有蓄意人為干擾而發(fā) 生的那些。
[0082] "重組DNA構(gòu)建體"指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此，重 組DNA構(gòu)建體可包含源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來源但以不同于通 常天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。
[0083] 術(shù)語"入門克隆"和"入門載體"本文可互換使用。
[0084] "調(diào)控序列"或"調(diào)控元件"可互換使用，并且指位于編碼序列的上游（5'非編碼 序列）、中間或下游C非編碼序列），并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或 翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化 識別序列。術(shù)語"調(diào)控序列"和"調(diào)控元件"在本文中可互換使用。
[0085] "啟動子"指能夠控制另一核酸片段轉(zhuǎn)錄的核酸片段。
[0086] "在植物中有功能的啟動子"指能夠控制植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子，無論其是否 來源于植物細(xì)胞。
[0087] "組織特異性啟動子"和"組織優(yōu)選啟動子"可以互換使用，并且指主要但非必須專 一地在一種組織或器官中表達(dá)，但是也可以在一種特定細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。
[0088] "發(fā)育調(diào)控啟動子"指其活性由發(fā)育事件決定的啟動子。
[0089] 術(shù)語"可操作地連接"指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個核酸片段的功能 受到另一個核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動子能夠調(diào)控核酸片段的轉(zhuǎn)錄時，該啟動子與該核 酸片段進(jìn)行了可操作地連接。
[0090] "表達(dá)"指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。例如，核酸片段的表達(dá)可以指核酸片段的轉(zhuǎn)錄（如生 成mRNA或功能RNA的轉(zhuǎn)錄）和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)。
[0091] "過表達(dá)"是指基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因生物中超過在來自相同實驗的沉默分離（或非轉(zhuǎn) 基因）生物中的水平的生產(chǎn)。
[0092] "表型"是指細(xì)胞或生物體的可檢測的特征。
[0093] 有關(guān)將核酸片段（例如重組DNA構(gòu)建體）插入細(xì)胞內(nèi)的"引入"意指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn) 化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸片段可整 合進(jìn)細(xì)胞的基因組（如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)，轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子或瞬時表 達(dá)（如轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0094] "經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"是將核酸片段（如重組DNA構(gòu)建體）引入其中的任何細(xì)胞。
[0095] 在此所用的"轉(zhuǎn)化"指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時轉(zhuǎn)化兩者。
[0096] "穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"指將核酸片段引入宿主生物體的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。一旦 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸片段穩(wěn)定地整合進(jìn)宿主生物體和任何連續(xù)世代的基因組中。
[0097] "瞬時轉(zhuǎn)化"指將核酸片段引入宿主生物體的核中或包含DNA的細(xì)胞器中，引起基 因表達(dá)而無基因穩(wěn)定遺傳。
[0098] 術(shù)語"雜交的"或"雜交"指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合（例如細(xì)胞、種子或植 物）。該術(shù)語包括有性雜交（一株植物被另一株植物授粉）和自交（自花授粉，例如當(dāng)花粉 和胚珠來自相同植物時）。術(shù)語"雜交"指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合行為。
[0099] "有利等位基因"為位于特定基因座、賦予或有助于所期望的表型的等位基因，所 述表型例如提高的細(xì)胞壁消化性，或作為另外一種選擇，為允許具有降低的細(xì)胞壁消化性 的植物的鑒定的等位基因，其中所述植物可從育種計劃或種植中被篩除（"反選擇"）。標(biāo) 記的有利等位基因是與有利表型共分離的標(biāo)記等位基因，或作為另外一種選擇，與不利植 物表型共分離，從而提供鑒定植物的有益效果。
[0100] 術(shù)語"引入"指將核酸（例如表達(dá)構(gòu)建體）或蛋白質(zhì)提供至細(xì)胞中的手段。引入 包括指將核酸整合到真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸可整合到細(xì)胞的基因組內(nèi)，并且 包括指將核酸或蛋白質(zhì)暫時提供給細(xì)胞。引入包括指穩(wěn)定的或瞬時的轉(zhuǎn)化方法以及有性雜 交。因此，將核酸片段（例如重組DNA構(gòu)建體/表達(dá)構(gòu)建體）插入細(xì)胞內(nèi)的情況下的"引 入"意指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在 該細(xì)胞中核酸片段可以整合進(jìn)細(xì)胞的基因組（如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)、轉(zhuǎn)變 成自主的復(fù)制子或瞬時表達(dá)（例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0101] "抑制DNA構(gòu)建體"是在轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組時，導(dǎo)致該植物中的靶基因 "沉默"的重組DNA構(gòu)建體。對該植物來說，該靶基因可以是內(nèi)源的或是轉(zhuǎn)基因的。如本文針 對靶基因所使用的，"沉默"通常指在由靶基因表達(dá)的mRNA或蛋白質(zhì)/酶的水平上的抑制， 和/或在酶活性或蛋白質(zhì)功能性的水平上的抑制。本文中可交換使用的術(shù)語"抑制"、"抑制 性"以及"沉默"包括減小、降低、減退、下降、抑制、消除或防止。"沉默"或"基因沉默"不確 定機理并且包括但不限于反義、共抑制、病毒-抑制、發(fā)夾抑制、莖-環(huán)抑制、基于RNAi的方 法以及基于小RNAi的方法。沉默靶向編碼區(qū)或非編碼區(qū)，例如內(nèi)含子、5'-UTR和3'-UTR、 或以上二者。
[0102] 抑制DNA構(gòu)建體可以包含源自所關(guān)注的靶基因的區(qū)域并且可以包含所關(guān)注的靶 基因的有義鏈（或反義鏈）的核酸序列的全部或部分。取決于所要利用的方法，該區(qū)域可與 所關(guān)注基因的有義鏈（或反義鏈）的全部或部分100%相同或具有小于100%同一性的同 一性（如具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、 62 %,63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %, 77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的同一性）。
[0103] 抑制DNA構(gòu)建體是本領(lǐng)域所熟知的，一旦選定所關(guān)注的靶基因就很容易構(gòu)建，并 且包括但不限于共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體、病毒-抑制構(gòu)建體、發(fā)夾抑制構(gòu)建體、莖-環(huán)抑 制構(gòu)建體、產(chǎn)生雙鏈RNA的構(gòu)建體，以及更通常的是，RNAi (RNA干擾）構(gòu)建體和小RNA構(gòu)建 體，例如siRNA(短干擾RNA)構(gòu)建體和miRNA (微RNA)構(gòu)建體。
[0104] "反義抑制"指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的反義RM轉(zhuǎn)錄物。"反義RNA" 指與靶初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補，并阻斷分離的靶核酸片段表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物 (美國專利號：5, 107, 065)。反義RNA可與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即Y非編碼序列、 3'非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列互補。
[0105] "共抑制"指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物。"有義" RNA 指包括mRNA并且可在細(xì)胞內(nèi)或體外翻譯成蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物。此前，已通過著眼于以 有義取向過表達(dá)與內(nèi)源mRNA具有同源性的核酸序列（其導(dǎo)致與過表達(dá)的序列具有同源性 的所有RNA降低）設(shè)計出了植物中的共抑制構(gòu)建體（參見Vaucheret等人，Plant J. 16 : 651-659(1998);和Gura，Nature 404:804-808(2000))。共抑制構(gòu)建體可包含來自編碼區(qū) 或非編碼區(qū)的序列，例如內(nèi)含子、5' -UTR和3' -UTR、或以上二者。
[0106] 另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導(dǎo)對近端mRNA編碼序列的抑制（于 1998年8月20日公開的PCT專利公開WO 98/36083)。
[0107] RNA干擾是指由短干擾性RNA(SiRNA)介導(dǎo)的動物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默 的過程（Fire等人，Nature 391 :806(1998))。在植物中的對應(yīng)過程通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉 默（PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也稱為阻抑作用（quelling)。據(jù)信轉(zhuǎn)錄后基因沉默過 程是用于防止外來基因表達(dá)的進(jìn)化保守的細(xì)胞防御機制，并且通常由不同植物區(qū)系和門所 共享（Fire 等人，Trends Genet. 15 :358(1999)) 〇
[0108] 小RNA在控制基因表達(dá)中起重要作用。很多發(fā)育過程（包括開花）的調(diào)節(jié)是由小 RNA控制的。現(xiàn)在有可能通過使用在植物中產(chǎn)生小RNA的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體來以工程手段改變 植物基因的基因表達(dá)。
[0109] 小RNA似乎是通過與互補RNA或DNA靶序列堿基配對來行使功能的。當(dāng)與RNA結(jié) 合時，小RNA或引發(fā)靶序列的RNA裂解或引發(fā)翻譯抑制。當(dāng)與DNA靶序列結(jié)合時，據(jù)信小RNA 可介導(dǎo)靶序列的DNA甲基化。無論具體機制是什么，這些事件的后果是基因表達(dá)受到抑制。
[0110] 微RNA(miRNA)是長度為約19至約24個核苷酸（nt)的已經(jīng)在動物和植物中鑒 定出的非編碼 RNA(Lagos-Quintana 等人，Science 294:853-858(2001)，Lagos-Quintana 等人，Curr. Biol. 12 :735-739(2002) ;Lau 等人，Science 294 :858-862(2001) ;Lee 和 Ambros，Science 294:862-864(2001) ;Llave 等人，Plant Cell 14:1605-1619(2002); Mourelatos 等人，Genes. Dev. 16 :720-728 (2002) ;Park 等人，Curr. Biol. 12 : 1484-1495(2002) ;Reinhart 等人，Genes. Dev. 16:1616-1626(2002))。它們是由大小為大 約70至200nt的較長的前體轉(zhuǎn)錄物加工生成的，并且這些前體轉(zhuǎn)錄物能夠形成穩(wěn)定的發(fā)夾 結(jié)構(gòu)。
[0111] 微RNA(miRNA)看起來通過與位于由這些基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物中的互補序列結(jié)合來 調(diào)節(jié)靶基因?？雌饋碛锌赡躮iRNA可進(jìn)入至少兩條靶基因調(diào)控途徑：（1)翻譯抑制；（2) RNA 裂解。進(jìn)入RNA裂解途徑的微RNA與在動物中RNA干擾（RNAi)期間以及在植物中轉(zhuǎn)錄后 基因沉默（PTGS)期間產(chǎn)生的21-25nt短干擾RNA(SiRNA)類似，并且可能整合進(jìn)與在RNAi 情況中觀察到的復(fù)合物類似或相同的RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC)內(nèi)。
[0112] 術(shù)語"基因座"一般是指攜帶一個基因或可能兩個或更多個基因的基因限定的染 色體區(qū)域，所述兩個或更多個基因的連接如此緊密，以至于它們遺傳上表現(xiàn)為引起某種表 型的單個基因座。當(dāng)本文用于Fea4時，"Fea4基因座"應(yīng)是指攜帶Fea4基因（包括它的相 關(guān)聯(lián)調(diào)控序列）的染色體的限定區(qū)域。
[0113] "基因"應(yīng)是指基因座內(nèi)的特定基因編碼區(qū)，包括它的相關(guān)聯(lián)調(diào)控序列。本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，相關(guān)聯(lián)的調(diào)控序列將在距Fea4編碼序列約4kb的距離內(nèi)，具有啟 動子定位的上游。
[0114] "種質(zhì)"指個體（例如一個植物）、一組個體（例如一個植物品系、品種或家族）、或 來源于一個品系、品種、物種、或培養(yǎng)物的克隆的或從其中得到的遺傳物質(zhì)。種質(zhì)可為生物 或細(xì)胞的部分，或可從生物或細(xì)胞中分離得到。種質(zhì)通常提供遺傳物質(zhì)與特異性分子構(gòu)成， 該分子構(gòu)成提供生物或細(xì)胞培養(yǎng)物的一些或全部遺傳性狀的物理基礎(chǔ)。如本文所用，種質(zhì) 包括可從中生長出新植物的細(xì)胞、種子或組織，或植物部分如葉、莖、花粉、或細(xì)胞，它們能 夠被培養(yǎng)成整個植物。
[0115] 序列比對和百分比同一性可用設(shè)計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定，這 些方法包括但不限于LASERGENE?生物信息計算包（DNASTAR? Inc.，Madis〇n，Wl) 的Megalign:R程序。除非另外說明，本文提供的序列的多重比對用Clustal W比對方法。
[0116] Clustal W 比對方法（描述于 Higgins 和 Sharp，CABI0S. 5 :151-153(1989); Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8 :189-191(1992))可見于 L.ASERGIZN1E、i! 生物信息學(xué)計算軟件包（DNASTAR? Inc.，Madison，Wis.)的 MegAlign?V6· 1 程序。 用于多重比對的默認(rèn)參數(shù)對應(yīng)于GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 0. 2, Delay Divergent Sequences = 30%,DNA Transition Weight = 0. 5,Protein Weight Matrix = Gonnet系列，DNA Weight Matrix = IUB。用于成對比對的默認(rèn)參數(shù)是比對方式=緩慢-準(zhǔn) 確（SloW-Accurate)，Gap Penalty = 10. 0, Gap Length = 0· 10, Protein Weight Matrix =Gonnet 250 和 DNA Weight Matrix = IUB。
[0117] 用Clustal W程序比對序列后，可以通過查看同一程序中的"序列距離"表來獲得 "百分比同一性"和"趨異"值；除非另外說明，本文提供的和申明的百分比同一性和趨異度 是以該方式計算的。
[0118] 本發(fā)明包括如下分離的多核苷酸和多肽：
[0119] 分離的多核苷酸，其包含：⑴編碼多肽的核酸序列，基于Clustal W比對方法，所 述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :3、6、9、12、14或16進(jìn)行比較時具有至少50%、 51 %,52 %,53 %,54 %,55 %,56 %,57 %,58 %,59 %,60 %,61 %,62 %,63 %,64 %,65 %, 66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %,77 %,78 %,79 %,80 %, 81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %, 96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或（^)(1)的核酸序列的全長互補序列，其 中所述全長互補序列和（i)的核酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成，并且是100%互補的。任 一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體（包括抑制DNA構(gòu)建體）。所 述多肽優(yōu)選地為FEA4多肽。所述多肽優(yōu)選地具有FEA4活性。
[0120] 分離的多肽，基于Clustal W比對方法，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :3、6、9、12、14 或 16 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、 58 %,59 %,60 %,61 %,62 %,63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %, 73 %,74 %,75 %,76 %,77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %, 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一 性。所述多肽優(yōu)選地為FEA4多肽。所述多肽優(yōu)選地具有FEA4活性。
[0121] 分離的多核苷酸，其包含：⑴基于Clustal W比對方法，在與SEQ ID NO :1、2、4、 5、7、8、10、11、13或15進(jìn)行比較時具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、 58 %,59 %,60 %,61 %,62 %,63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %, 73 %,74 %,75 %,76 %,77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %, 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一 性的核酸序列；或（ii) (i)的核酸序列的全長互補序列。任一上述分離的多核苷酸可用于 本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體（包括抑制DNA構(gòu)建體）。所述多肽優(yōu)選地為FEA4多肽。所 述多肽優(yōu)選地具有FEA4活性。
[0122] 分離的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴(yán)格條件下與包含 SEQIDN0:1、2、4、5、7、8、10、11、13或15的全長互補序列的DNA分子雜交。所述多肽優(yōu)選 地為FEA4多肽。所述多肽優(yōu)選地具有FEA4活性。
[0123] 分離的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自下列的至少一種 方法改變一個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID N0:l、2、4、5、7、8、10、ll、13或15:缺失、替 換、添加和插入。所述多肽優(yōu)選地為FEA4多肽。所述多肽優(yōu)選地具有FEA4活性。
[0124] 分離的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO :1、2、4、 5、7、8、10、11、13或15的等位基因。
[0125] 在一個實施例中，本發(fā)明包括重組DNA構(gòu)建體（包括抑制DNA構(gòu)建體）。重組DNA 構(gòu)建體（包括抑制DNA構(gòu)建體）可包含本發(fā)明的多核苷酸，其以有義或反義取向可操作地 連接至至少一個調(diào)控序列（例如在植物中有功能的啟動子）。多核苷酸可包含SEQ ID NO: 1、2、4、5、7、8、10、11、13或15的100、200、300、400、500、600、700、800、900或 1000個連續(xù)的 核苷酸。多核苷酸可編碼本發(fā)明的多肽。
[0126] 本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻(xiàn) 中有更全面的描述：Sambrook，J·，F(xiàn)ritsch，E.F.和 Maniatis，T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual ;CoId Spring Harbor Laboratory Press ：Cold Spring Harbor， 1989 (下文稱為 "Sambrook"）。
[0127] 本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)很好地理解，不同的啟動子可在不同的組織或細(xì)胞類型 中，或在不同的發(fā)育階段，或響應(yīng)不同的環(huán)境條件而引導(dǎo)基因的表達(dá)。
[0128] 可用于本發(fā)明的啟動子包括但不限于莖端分生組織特異性的啟動子和莖端分生 組織優(yōu)選的啟動子。玉米knottedl啟動子和來自已知在玉米SAM中表達(dá)的基因的啟動子可 用于表達(dá)本發(fā)明公開的多核苷酸。此類基因的例子包括但不限于Zm phabulosa、terminal earKrough sheath2、rolled leaf!、zybl4、narrow sheath (Ohtsu, K.等人，（2007)Plant Journal 52,391-404)。來自其它物種的這些基因的直系同源物的啟動子也可用于本發(fā)明。
[0129] 來自SAM優(yōu)選表達(dá)的基因的擬南芥啟動子的例子包括但不限于clv3、 aintegumenta-like (ail5、ail6、 和 ail7)和 terminal ear likel、clavatal、wus、 shootmeristemless、terminal flower I (Yadav 等人，(2009) Proc Natl Acad Sci USA. March 24)〇
[0130] PCT公開WO 2004/071467和美國專利7, 129, 089描述通過以獨特組合將單個啟動 子、基因和轉(zhuǎn)錄終止子連接在一起來合成多個啟動子/基因/終止子盒組合。一般來講，側(cè) 接合適啟動子的NotI位點用于克隆期望基因?？墒褂肞CR擴增，用經(jīng)設(shè)計用于在基因5' 和3'端處引入NotI位點的寡核苷酸將NotI位點加到受關(guān)注的基因上。然后用NotI消化 所得PCR產(chǎn)物，并將其克隆到合適的啟動子/NotI/終止子盒中。雖然將基因克隆進(jìn)表達(dá)盒 常利用NotI限制性酶完成，本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識到能夠利用多種限制性酶獲得期望的 盒。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會知道可利用其它克隆技術(shù)，包括但不限于基于PCR的或基于 重組的技術(shù)生成合適的表達(dá)盒。
[0131] 此外，WO 2004/071467和美國專利7, 129, 089描述了為了獲得所需表型表達(dá)，還 將單個啟動子/基因/轉(zhuǎn)錄終止子盒與合適的選擇性標(biāo)記盒以獨特組合和取向連接到一 起。雖然這主要使用不同的限制性酶位點來完成，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可認(rèn)識到可利用多 種技術(shù)來獲得所需的啟動子/基因/轉(zhuǎn)錄終止子組合或取向。這樣做可獲得莖端分生組織 特異性的啟動子/基因/轉(zhuǎn)錄終止子盒的任何組合和取向。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可認(rèn)識到 這些盒可位于單個DNA片段上或在多個片段上，該處基因共表達(dá)是多個DNA片段共轉(zhuǎn)化的 結(jié)果。
[0132] fasciated ear4 (fea4)以前稱為 feal905 (Pautler 等人，摘要來自第 52 屆 Annual Maize Genetics Conference ;2010 年 3 月 18-21 日，Trento, Italy)，是一種新的玉米帶化 穗突變體。在這種突變體中的主要缺陷是帶化的穗和增厚的雄穗，這是由于增大的花序分 生組織導(dǎo)致。附加的生殖表型包括長雄穗分枝數(shù)的降低。營養(yǎng)表型如半矮桿和較短的、較 寬的葉片可存在于某些環(huán)境條件下，例如短日照。
[0133] 術(shù)語"帶化"來自拉丁文fascis，意指束（帶），描述由增生引起的植物外形的變 化。
[0134] 術(shù)語"野生型fea4基因"、"fea4wt基因"、"Fea4基因"和"FEA4基因"本文互換使 用。
[0135] 通過篩選EMS誘變的自交玉米群體以獲取具有帶化穗的突變體，發(fā)現(xiàn)了 fea4。突 變的遺傳背景是A619自交系，但是表型在漸滲到多個其它自交系時也是不同的。
[0136] fea4通過基因分型來自F2作圖群體的大約500個突變體對染色體6的長臂作圖。 給一個候選基因測序，該基因編碼432個氨基酸的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，揭示了 C至T的堿基 轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生提前終止密碼子。C至T(G至A)的突變是用EMS進(jìn)行化學(xué)誘變的結(jié)果。鑒定了 具有終止密碼子的第二等位基因 fea4-rel*09-5171，證實已經(jīng)分離了正確的基因。
[0137] FEA4是擬南芥基因 PERIANTHIA(PAN)直系同源的，其具有花器官數(shù)方面的缺陷。 pan突變體在外輪中具有五個花瓣和五個萼片，而不是四個（Running，MP，Meyerowitz， EM. 1996Development 122 :1261-9 ;Chuang，C.等人，1999Genes and Development 13: 333-344)。當(dāng)在短日照條件下生長時（大約8小時光照，以及16小時黑暗），pan突變體 展示不確定的花分生組織，導(dǎo)致產(chǎn)生多個異常的花器官（Maier，A.等人，2009Development 136 :1613-1620)〇
[0138] FEA4在未成熟的穗和雄穗原基中根據(jù)RNA-seq轉(zhuǎn)錄學(xué)圖譜表達(dá)。該表達(dá)在穗頂 端（花序分生組織）最高并且在穗的中部和基部降低。此外，表達(dá)隨著雄穗原基的尺寸增 加（2-7mm)而降低。
[0139] 我們對于fea2/fea4雙突變體的分析表明fea4可與CLAVATA2/WUSCHEL途徑平行 作用。
[0140] 具有fea4突變的植物，其中該突變導(dǎo)致Fea4功能的喪失或Fea4表達(dá)的消除，也 稱為" fea4植物"或" fea4無效植物"。" fea4無效植物"表現(xiàn)出" fea4表型"或" fea4無 效表型"。fea4植物在花序和花梗發(fā)育期間發(fā)育出較大的分生組織，并且穗花序分生組織顯 示嚴(yán)重的帶化，表明Fea4通常用于限制這些分生組織的生長。
[0141] 具有弱fea4突變的植物，其中該突變導(dǎo)致Fea4功能的部分喪失或Fea4表達(dá)的部 分消除，也稱為"具有弱fea4表型的fea4植物"。"弱fea4植物"表現(xiàn)出"弱fea4表型"。具 有弱fea4等位基因的fea4植物表現(xiàn)出與fea4無效植物相似、但是程度更低的表型。具有 弱fea4等位基因的fea4植物也可表現(xiàn)出部分fea4無效表型，S卩，可能不表現(xiàn)出全部fea4 無效特性。本文所述的"弱fea4等位基因"是fea4變體或SEQ ID NO :1或2的變體，它們 賦予植物弱fea4表型。
[0142] 具有fea4突變的植物表現(xiàn)出"無效fea4表型"或"弱fea4表型"，本文將該植物 稱為具有"突變fea4表型"的植物。
[0143] 如本文所用，術(shù)語"顯性負(fù)突變"是指具有改變的基因產(chǎn)物的突變，該基因產(chǎn)物的 作用拮抗野生型等位基因。這些突變通常導(dǎo)致改變的分子功能（常常是失活的）并且特征 在于"顯性負(fù)"表型。賦予"顯性負(fù)表型"的基因變體、突變基因或等位基因?qū)①x予宿主細(xì) 胞"無效"或"突變"表型，甚至在野生型等位基因的存在下依然如此。
[0144] 如本文所用，具有"FEA4活性"的多肽（或多核苷酸）是指當(dāng)在"fea4突變系"中 表達(dá)時，表現(xiàn)出"fea4突變體表型"的多肽（或多核苷酸），其能夠部分或完全拯救fea4突 變體表型。
[0145] 術(shù)語"基因改組"和"定向進(jìn)化"本文互換使用。"基因改組"方法包括反復(fù)進(jìn)行DNA 改組，然后通過適當(dāng)?shù)暮Y選和/或選擇以生成具有改變的生物活性的Fea4核酸變體或其部 分（Castle 等人，（2004) Science 304(5674) :1151-4 ;美國專利 5,811,238 和 6, 395, 547)。
[0146] "TILLING"或"定向誘導(dǎo)基因組局部突變（Targeting Induced Local Lesions IN Genomics) "是指一種誘變技術(shù)，其用于產(chǎn)生和/或鑒定、并且最終分離具有調(diào)控表達(dá)和/ 或活性的特定核酸的誘變變體（McCallum等人，（2000)，Plant Physiology 123 :439-442 ; McCallum等人，（2000)Nature Biotechnology 18 :455-457 ;和 Colbert 等人，（2001)Plant Physiology 126 :480-484)〇
[0147] TILLING組合高密度點突變，快速靈敏地檢測突變。通常使用甲磺酸乙酯（EMS)誘 變植物種子。EMS烷基化烏嘌呤，這通常導(dǎo)致錯配。例如，將種子浸泡在約10-20mM的EMS 溶液中約10至20小時；洗滌種子并隨后播種。將這一代植物稱為Ml。Ml植物隨后自體繁 殖。存在于形成生殖組織的細(xì)胞中的突變被下一代繼承（M2)。通常篩選M2植物以獲得期 望基因和/或特定表型的突變。
[0148] TILLING也允許選擇攜帶突變體的植物。這些突變體可表現(xiàn)出在強度或位置 或時間上改變的表達(dá)（如果突變影響例如啟動子）。這些突變體甚至可表現(xiàn)出比天然 形式的基因表現(xiàn)出的FEA4活性更低的活性。TILLING組合高密度誘變與高通量篩選方 法。TILLING 中的步驟通常為：（a) EMS 誘變（Redei G P和Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua N H，Schell J 編輯，Singapore，World Scientific Publishing Co,第 16-82 頁；Feldmann 等人，（1994) In Meyerowitz E M，Somerville C R 編輯，Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 第 137-172 頁；Lightner J 和 Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater，J Salinas 編輯， Methods on Molecular Biology，第 82 卷，Humana Press，Totowa，N.J.，第 91-104 頁）； (b)DNA制備和個體集合；（c)受關(guān)注區(qū)域的PCR擴增；(d)變性和退火以允許形成異源雙 鏈核酸分子；（e)DHPLC，其中在集合中存在的異源雙鏈核酸分子在色譜中檢測為額外的峰； ⑴鑒定單個突變體；以及（g)對突變PCR產(chǎn)物測序。TILLING方法是本領(lǐng)域為人們所熟知 的（美國專利US8, 071，840)。
[0149] 也可使用其它突變方法以將突變引入Fea4基因。用于將基因突變引入植物基因 并選擇具有期望性狀的植物的方法是熟知的。例如，種子或其它植物材料可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 用突變化學(xué)物質(zhì)處理。此類化學(xué)物質(zhì)包括但不限于以下物質(zhì)：硫酸二乙酯、乙烯亞胺、和 N-亞硝基-N-乙基脲。作為另外一種選擇，可利用電離輻射，其來自輻射源如X-射線或γ 射線。
[0150] 可使用用于檢測Fea4基因中的突變的其它檢測方法，例如毛細(xì)管電泳（例 如恒定變性毛細(xì)管電泳和單鏈構(gòu)象多態(tài)性）。又如，可利用錯配修復(fù)酶學(xué)檢測異源雙 鏈核酸分子（例如來自芹菜的CELI內(nèi)切核酸酶）。CELI識別錯配并精確地切開錯 配的3'側(cè)。錯配的精確堿基位點可通過用錯配修復(fù)酶切割，隨后進(jìn)行例如變性凝 膠電泳來確定。參見例如 Oleykowski 等人，（1998) "Mutation detection using a novel plant endonuclease"Nucleic Acid Res。26:4597-4602;以及Colbert 等人， (2001) "High-Throughput Screening for Induced Point MurationsT3Iant Physiology 126 :480-484。
[0151] 包含突變fea4基因的植物可與其它植物雜交以將突變引入另一個植物。這可使 用標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)完成。
[0152] 同源重組允許將選擇的核酸在限定的選擇位點引入基因組。同源重組已經(jīng)在 植物中展不。參見例如 Puchta 等人，（1994)，Experientia 50 :277-284 ;SWoboda 等 人，（1994)，EMBO J. 13 :484-489 ;0ffringa 等人，（1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 : 7346-7350 ;Kempin 等人，（1997)Nature 389 :802-803 ;以及 Terada 等人，（2002)Nature Biotechnology，20(10) :1030-1034)〇
[0153] 用于在植物中進(jìn)行同源重組的方法已經(jīng)不僅對模型植物進(jìn)行了描述（Offringa 等人，（1990)EMB0 J. October ;9 (10) :3077-84)，而且對作物植物例如稻進(jìn)行了描述 (Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S. Nat Biotechnol. 2002 ;Iida 和 Terada :Curr Opin Biotechnol. 2004 年 4 月；15 (2) :1328)。靶向核酸（其可為如前文所 定義的FEA4核酸或其變體）不需要分別靶向FEA4基因的基因座，但是可被引入例如高表 達(dá)區(qū)。靶向核酸可為弱fea4等位基因或顯性負(fù)等位基因，它們用于替換內(nèi)源基因或此外可 被引入內(nèi)源基因。
[0154] 轉(zhuǎn)座元件可基于它們的轉(zhuǎn)座模式歸類為兩大類。這些稱為I類和II類；它們均 具有作為誘變劑和遞送載體的用途。I類轉(zhuǎn)座元件通過RNA中間體轉(zhuǎn)座并利用反轉(zhuǎn)錄酶， 即，它們是逆轉(zhuǎn)錄因子。存在至少三種類型的I類轉(zhuǎn)座元件，例如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、反座子、 SINE樣元件。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子通常含有LTR、和編碼病毒外殼蛋白質(zhì)（gag)與逆轉(zhuǎn)錄酶的基 因、RnaseH、整合酶和聚合酶（pol)基因。已經(jīng)描述了植物物種中的多個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。此 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子經(jīng)由RNA中間體在由轉(zhuǎn)座子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶H催化的反應(yīng)中移動 和易位。例子分成Tyl-copia和Ty3_gypsy組以及分成SINE樣和LINE樣類別（Kumar和 Bennetzen(1999)Annual Review of Genetics 33:479)。此外，DNA 轉(zhuǎn)座元件如 Ac、Taml 和En/Spm也存在于廣泛多種植物種類中，并且可在本發(fā)明中利用。轉(zhuǎn)座子（和IS元件） 是用于將突變引入植物細(xì)胞的常見工具。
[0155] 植物構(gòu)造由分生活性的精確控制而決定。正或負(fù)維持信號的不平衡可導(dǎo)致帶化分 生組織表型。fea4是具有由于極度增大的花序分生組織導(dǎo)致的帶化穗的和雄穗的半矮桿 突變體。營養(yǎng)分生組織的尺寸也增大，導(dǎo)致突變體的高度減小以及其它營養(yǎng)階段缺陷。我 們將fea4對包含大約30個基因的染色體6的2. 7Mbp區(qū)域作圖。在這個區(qū)間中的bZIP轉(zhuǎn) 錄因子包含在參考等位基因中EMS誘導(dǎo)的提前終止密碼子。初始鑒定為ram〇sa2修飾基因 的第二等位基因也包含提前終止密碼子，證實了該基因的同一性。隨后，我們從EMS和轉(zhuǎn)座 子誘變庫中分離了附加的等位基因。系統(tǒng)發(fā)育分析表明Fea4與擬南芥基因 PERIANTHIA直 系同源，該基因具有類似的，但是嚴(yán)重程度較低的功能喪失表型。我們進(jìn)行原位雜交以確定 Fea4在發(fā)育的不同階段的表達(dá)模式。在營養(yǎng)階段，F(xiàn)ea4在SAM的周邊區(qū)域以及不成熟葉片 的脈管系統(tǒng)中特異性表達(dá)。Fea4明顯地不存在于SAM頂端的干細(xì)胞巢中，不存在于初生葉 原基（PO)中，并且在PO下的域中大量富集。這種周邊區(qū)域表達(dá)模式存在于檢查的各個胚 期中，并且持續(xù)直至SAM發(fā)生花轉(zhuǎn)換。在轉(zhuǎn)換至繁殖期后，F(xiàn)ea4在雄穗和穗的整個花序分 生組織中表達(dá)，并且也在小穗對、小穗、和花分生組織中表達(dá)。類似于在SAM中觀察到的模 式，F(xiàn)ea4在生殖分生組織中的初始后來器官形成位點處下調(diào)。YFP-FEA4翻譯融合蛋白質(zhì)在 天然Fea4啟動子控制下的表達(dá)重演了原位雜交觀察到的表達(dá)模式。在被檢查分生組織從 胚到花序的所有階段觀察到、并且還在圍繞SAM的幼葉中檢測到強的核表達(dá)。我們已經(jīng)通 過RNA-seq轉(zhuǎn)錄學(xué)圖譜描繪出在突變體的Imm穗中相對于野生型的轉(zhuǎn)錄變化，并且正在開 始探宄潛在的目標(biāo)。遺傳分析表明Fea4功能平行于fea2_tdl (CLAVATA)途徑，說明它定義 一種在分生組織尺寸調(diào)節(jié)中的新途徑。
[0156] 實施例:
[0157] 在一個實施例中，可用于本發(fā)明方法的fea4變體是一種或多種以下FEA4核酸變 體：⑴Fea4核酸序列（SEQ ID NO :1或2)的部分；（ii)能夠與Fea4核酸序列（SEQ ID NO : 1或2)雜交的核酸序列；（iii)Fea4核酸序列（SEQ ID NO :1或2)的拼接變體；（iv)Fea4 核酸序列（SEQ ID NO :1或2)的天然存在的等位基因變體；（V)通過基因改組獲取的fea4 核酸序列；（vi)通過定點誘變獲取的fea4核酸序列；（vii)通過TILLING方法獲取并鑒定 的fea4變體。
[0158] 在一個實施例中，內(nèi)源Fea4的表達(dá)水平可在植物細(xì)胞中通過反義構(gòu)建體、有義構(gòu) 建體、RNA沉默構(gòu)建體、RNA干涉作用、人工小RNA和基因組缺失而降低。基因組缺失的例子 包括但不限于轉(zhuǎn)座子、tilling、同源重組誘導(dǎo)的缺失。
[0159] 在一個實施例中，可使用經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中該前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用 設(shè)計用于產(chǎn)生指向Fea4的miRNA的序列替換miRNA編碼區(qū)；前體也在主鏈序列中進(jìn)行修飾 以響應(yīng)miRNA編碼區(qū)中的改變。
[0160] 在一個實施例中，在本發(fā)明方法中使用的Fea4核酸變體是通過基因改組獲取的 核酸變體。
[0161] 在一個實施例中，也可利用TILLING(定向誘導(dǎo)基因組局部突變）將基因修飾引入 玉米Fea4基因的基因座。
[0162] 在一個實施例中，可利用定點誘變生成Fea4核酸的變體?？衫枚喾N方法實現(xiàn)定 點誘變；最常用的方法是基于PCR的方法（美國專利7956240)。
[0163] 在一個實施例中，也可利用同源重組失活或降低內(nèi)源Fea4基因在植物中的表達(dá)。
[0164] 同源重組可通過特定靶向體內(nèi)的Fea4基因用于誘導(dǎo)定向基因修飾。體外制備在 fea4基因序列（例如本文提供的那些）的選擇部分（包括5'上游、3'下游、和基因間區(qū)） 中的突變并且利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將它們引入期望的植物。在引入的突變fea4基因和目標(biāo)內(nèi)源 FEA4基因之間的同源重組將導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物中野生型基因的定向取代，導(dǎo)致Fea4表達(dá)或 活性的抑制。
[0165] 在一個實施例中，催化RNA分子或核糖酶也可用于抑制FEA4基因的表達(dá)。設(shè)計特 定地與事實上的任何目標(biāo)RNA配對并在特定位置裂解磷酸雙酯骨架，從而功能上失活目標(biāo) RNA的核糖酶是可能的。在進(jìn)行這種裂解時，核糖酶不發(fā)生自體改變，并且因此能夠循環(huán)利 用并裂解其它分子。在反義RNA中包括核糖酶序列賦予它們RNA裂解活性，從而提高構(gòu)建體 的活性。已經(jīng)鑒定了多類核糖酶。例如，一類核糖酶來源于多個小的環(huán)形RNA，它們能夠自 體裂解并在植物中復(fù)制。該RNA能夠單獨復(fù)制（類病毒RNA)或用輔助病毒（衛(wèi)星RNA)復(fù) 制。RNA的例子包括來自鱷梨日斑病類病毒的RNA和來自煙草環(huán)斑病毒、紫花苜蓿暫時性線 條病毒、絨毛煙斑駁病毒、茛菪斑駁病毒和地三葉草斑駁病毒的衛(wèi)星RNA。已經(jīng)描述了目標(biāo) RNA特異性核糖酶的設(shè)計和使用。參見例如Haseloff等人，（1988) Nature，334 :585-591。
[0166] 用于失活Fea4基因的另一種方法是通過抑制表達(dá)的有義抑制。引入其中相對 于啟動子以有義取向配置的核酸的表達(dá)盒已經(jīng)顯示為一種用于阻止期望靶基因轉(zhuǎn)錄的 有效方法（Napoli 等人，（1990)，The Plant Cell2 :279-289;和美國專利US5034323、 US5231020、和 US5283184)。
[0167] 在一個實施例中，F(xiàn)ea4基因也可通過例如基于轉(zhuǎn)座子的基因失活而被失活。
[0168] 在一個實施例中，失活步驟包括在Fea4基因序列中制造一個或多個突變，其中在 Fea4基因序列中的一個或多個突變包括一個或多個轉(zhuǎn)座子插入，從而與相應(yīng)的對照植物相 比失活Fea4基因。例如，該突變可包括在Fea4基因中的純合缺失，或一個或多個突變包括 在Fea4基因中的雜合缺失。
[0169] 將這些可移動的遺傳因子例如通過有性雜交遞送至細(xì)胞，選擇轉(zhuǎn)座并且篩選所得 插入突變體，例如用于獲得所關(guān)注的表型。包含缺失Fea4基因的植物可與野生型植物雜 交。取決于將進(jìn)行雜交的物種，可使用多種標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)中的任何一種。在分離或重組植 物的基因組中的TN(轉(zhuǎn)座子）位置可通過已知方法來確定，例如如本文所述的側(cè)接區(qū)域測 序。例如，植物的PCR反應(yīng)可用于擴增序列，其隨后可進(jìn)行診斷測序以確認(rèn)它的起源。任選 地，篩選插入突變體以獲得期望的表型，例如抑制Fea4的表達(dá)或活性，或改變農(nóng)學(xué)特性。 [0170]
[0171] 本發(fā)明將在下面的實例中進(jìn)一步說明，其中份數(shù)和百分比是以重量計并且度數(shù)是 攝氏度，除非另外說明。應(yīng)該理解，盡管這些實例說明了本發(fā)明的實施例，但僅是以例證的 方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的基本特征， 并且在不脫離其實質(zhì)和范圍的情況下，能夠?qū)Ρ景l(fā)明做出各種變化和修改以使其適用于各 種用法和條件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種 修改形式對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。這些修改形式也旨在涵蓋于所附權(quán)利 要求書的范圍內(nèi)。
[0172] 實例 1
[0173] 克降玉米fea4基因
[0174] fea4-0等位基因在EMS誘變的A619自交群體的M2篩選中被發(fā)現(xiàn)。
[0175] 兩個F2作圖群體通過雜交fea4_0(A619)與B73和W23自交系而形成。突變定位 至2. 7Mbp的區(qū)域（圖1A)，其包含大約30個注釋基因。在這個區(qū)域中的候選基于它在發(fā)育 的穗原基中的表達(dá)進(jìn)行選擇。對候選bZIP轉(zhuǎn)錄因子的測序揭示EMS誘導(dǎo)的（C至T)的轉(zhuǎn) 變，產(chǎn)生提前終止密碼子（圖1B)。第二等位基因 fea4-rel*09-5171也包含提前終止密碼 子，證實了該基因的同一性。隨后，獲取在FEA4中的11個TUSC插入突變體，它們當(dāng)前是顯 型的。兩個終止密碼子位于bZIP域之后，但是在兩個富含谷氨酰胺的區(qū)域之前（圖1C)。 這些C-末端基序已經(jīng)顯示對于通過谷氧還蛋白調(diào)節(jié)TGA-類bZIP蛋白質(zhì)來說是重要的。
[0176] 實例 2
[0177] 玉米突奪體fea4表塑
[0178] fea4是半矮桿隱性突變體，具有顯著帶化的穗和雄穗。營養(yǎng)表型包括較短的、較 寬的葉片和減小的植物高度（圖2A)。這關(guān)聯(lián)莖端分生組織（SAM)?33%的尺寸增加。在 繁殖轉(zhuǎn)換后，fea4突變體生成厚的雄穗與提高的小穗密度以及增加的花序軸直徑（圖2B)。 突變體產(chǎn)生難以置信的帶化穗，其比野生型更短并且更無組織（圖2C)。未成熟穗的SEM分 析揭示主要缺陷是極度增大的花序分生組織（圖2D)，而較高次序的繁殖分生組織看起來 不受影響。圖2E示出具有緊湊錐形的花序分生組織的野生型穗（比例尺=Imm)。
[0179] 實例 3
[0180] 在分牛組織尺寸和分牛組織確宙件之間的相互作用
[0181] fea4的兩個等位基因來自ramosa2 (ra2)修飾基因篩選。分離F2群體（圖3A)顯 示ra2抑制fea4的帶化表型并導(dǎo)致穗花序分生組織的重復(fù)分枝或分枝。
[0182] 圖3B不出fea4和ramosal的雙突變體。Ramosal看起來抑制fea4,表明fea4作 用于這個小穗對分生組織確定性的決定者的上游。
[0183] fea4和ramosa3的雙突變體看起來是完全疊加的，指示這些因子可以獨立的途徑 作用（圖3C)。
[0184] 實例 4
[0185] ffea2/fea4雙突奪體分析
[0186] fea4和CLAVATA2直系同源物的雙突變體展示在繁殖（圖4A)和營養(yǎng)發(fā)育（圖4B) 中的協(xié)同缺陷。這可解釋為意指fea4功能平行于干細(xì)胞巢控制途徑，可能位于中心區(qū)域之 外。
[0187] 實例 5
[0188] fea4基因的表達(dá)分析
[0189] 我們進(jìn)行原位雜交以確定Fea4在發(fā)育的不同階段的表達(dá)模式。在營養(yǎng)階段，F(xiàn)ea4 在SAM的周邊區(qū)域以及不成熟葉片的脈管系統(tǒng)中特異性表達(dá)。Fea4明顯地不存在于SAM 頂端的干細(xì)胞巢中，不存在于初生葉原基（PO)中，并且在PO下的域中大量富集。這種周邊 區(qū)域表達(dá)模式存在于檢查的各個胚期中，并且持續(xù)直至SAM發(fā)生花轉(zhuǎn)換。在轉(zhuǎn)換至繁殖期 后，F(xiàn)ea4在雄穗和穗的整個花序分生組織中表達(dá)，并且也在小穗對、小穗、和花分生組織中 表達(dá)。類似于在SAM中觀察到的模式，F(xiàn)ea4在生殖分生組織中的初始后來器官形成位點處 下調(diào)。
[0190] 實例 6
[0191] 從FEA4啟動子表汰昔色熒光融合蛋白質(zhì)
[0192] 制備重組DNA構(gòu)建體以允許體內(nèi)定位FEA4,其已經(jīng)用黃色熒光蛋白質(zhì)（YFP)進(jìn)行 了標(biāo)記。構(gòu)建體以5'至3'的取向包含以下元件：1)FEA4啟動子；2)YFP-FEA4融合蛋白質(zhì) 編碼區(qū)；和3)FEA43'UTR。產(chǎn)生包含這種重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因玉米植物。YFP-FEA4翻 譯融合蛋白質(zhì)在天然啟動子控制下的表達(dá)重演了原位雜交觀察到的表達(dá)模式。在被檢查分 生組織從胚到花序的所有階段觀察到、并且還在圍繞SAM的幼葉中檢測到強的核表達(dá)。
[0193] 實例 7
[0194] 在fea4棺物中降低的雄蕊數(shù)
[0195] 分析花器官在A619背景下的fea4突變體植物。計算在fea4突變體的50個小花 中和在野生型A619親緣種的50個小花中的花器官數(shù)（雄蕊）。在野生型樣本中100%的 小花包含3個雄蕊，而23%的突變體小花僅包含2個雄蕊（圖6A-圖6D)。
[0196] 實例 8
[0197] YFP-FEA4融合構(gòu)律體櫬救fea4突奪體
[0198] 為了檢查FEA4蛋白質(zhì)產(chǎn)物的亞細(xì)胞和組織水平上的定位，構(gòu)建翻譯融合物，其包 含在天然啟動子控制下融合到FEA4編碼序列上的黃色熒光蛋白質(zhì)（YFP)。構(gòu)建體以5'至 3'的取向包含以下元件：1)FEA4啟動子；2)YFP-FEA4融合蛋白質(zhì)編碼區(qū)；和3)FEA43'UTR。 將這個構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到HiII自交玉米背景中，并且回交到fea4突變體中兩次以評估互補。這 個轉(zhuǎn)基因的存在足以拯救在兩個獨立事件中的突變體表型，指示融合蛋白質(zhì)在植物中的功 能（η =在分離家族中的40個植物）。這個實驗提供了對引起突變體表型的基因同一性的 獨立確認(rèn)。它也確認(rèn)Ikb啟動子和下游的UTR序列驅(qū)動在所需域中的表達(dá)。另外，這個實 驗顯示YFP標(biāo)記不干擾FEA4蛋白質(zhì)的功能。
[0199] 實例 9
[0200] fea4和fea2協(xié)同相互作用以棹制分牛組織尺寸
[0201] 分離 fea4 和 fasicated ear2 (fea2)形成 F2 群體；fea2 是 CLAVATA2 的玉米直系 同源物。雙突變體展示在營養(yǎng)和繁殖結(jié)構(gòu)中廣泛的協(xié)同表型。
[0202] 為了定量基因相互作用，我們基因分型來自分離家族的植物，并且測量莖端分生 組織（SAM)在種植后14天時的尺寸。SAM尺寸在fea2和fea4單突變體中相對于野生型增 加大約30%，并且在fea2/fea4雙突變體中增加122%。結(jié)果示于表1中。
[0203] 表 1
[0204]
[0205] 實例 10

【權(quán)利要求】
1. 一種產(chǎn)生具有下降的內(nèi)源Fea4表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括： a. 將重組構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組構(gòu)建體包含可操作地連接至啟 動子的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列的表達(dá)降低內(nèi)源Fea4的表達(dá)； b. 在步驟（a)之后，由所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及 c. 選擇（b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組構(gòu)建體且在與不包含所 述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出下降的Fea4表達(dá)。
2. -種產(chǎn)生具有下降的內(nèi)源Fea4表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括： a. 將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含以有義或 反義取向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸 包含： i. SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列； ii基于Clustal W比對方法，在與SEQ ID NO :1或2進(jìn)行比較時具有至少90 %的序列 同一性的核苷酸序列； iii. SEQ ID NO :1或2的至少100個連續(xù)的核苷酸的核苷酸序列； iv. 能夠在嚴(yán)格條件下與（i)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或 V.經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中所述前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設(shè)計用于產(chǎn)生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替換所述miRNA編碼區(qū)； b. 在步驟（a)之后，使轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含 所述重組DNA構(gòu)建體；以及 c. 選擇（b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組DNA構(gòu)建體且在與不包 含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出下降的Fea4表達(dá)。
3. -種產(chǎn)生具有改變的農(nóng)學(xué)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括： a. 將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地 連接至至少一個調(diào)控序列的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽的片段或變體， 基于Clustal W比對方法，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :3進(jìn)行比較時具有 至少80%的序列同一性，其中所述片段或所述變體賦予在所述可再生的植物細(xì)胞中的顯性 負(fù)表型； b. 在步驟（a)之后，由所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及 c. 選擇（b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組DNA構(gòu)建體且在與不包 含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一種選自下列的農(nóng)學(xué)特性的改 變：穗分生組織尺寸、籽粒行數(shù)、葉數(shù)、花序數(shù)、在所述花序內(nèi)的分枝、花數(shù)、果實數(shù)、種子數(shù)、 植物高度、生物量和產(chǎn)量。
4. 一種鑒定fea4的弱等位基因的方法，所述方法包括以下步驟： a. 對突變體玉米植物的群體進(jìn)行基因篩選； b. 鑒定表現(xiàn)出比fea4無效植物更弱的fea4表型的一個或多個突變體玉米植物；以及 c. 從所述具有更弱的fea4表型的突變體玉米植物中鑒定所述弱fea4等位基因。
5. -種鑒定fea4的弱等位基因的方法，所述方法包括以下步驟： a. 使用編碼SEQ ID NO :3、或與SEQ ID NO :3至少70%相同的蛋白質(zhì)、或其片段的一 種或多種核苷酸序列進(jìn)行基因改組； b. 將來自步驟（a)的經(jīng)改組的序列轉(zhuǎn)化到可再生的植物細(xì)胞的群體中； c. 由步驟（b)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的可再生的植物細(xì)胞的群體再生出經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的群體； d. 針對弱fea4表型，篩選來自步驟（c)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的群體；以及 e. 從所述表現(xiàn)出弱fea4表型的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中鑒定所述弱fea4等位基因。
6. -種植物，其中所述內(nèi)源Fea4基因的表達(dá)相對于對照植物是降低的。
7. -種植物，所述植物相對于野生型植物表現(xiàn)出弱fea4表型。
8. -種制備權(quán)利要求6所述的植物的方法，所述方法包括以下步驟： a. 向所述內(nèi)源Fea4基因中引入突變；以及 b. 檢測所述突變。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中步驟（a)和（b)是使用定向誘導(dǎo)基因組局部突變 (TILLING)方法來完成的，并且其中所述突變對于降低所述內(nèi)源Fea4基因的表達(dá)或其活性 是有效的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述突變是位點特異性突變。
11. 一種制備權(quán)利要求6所述的植物的方法，其中所述方法包括以下步驟： a. 將轉(zhuǎn)座子引入到包含內(nèi)源Fea4基因的種質(zhì)中； b. 獲取步驟（a)的種質(zhì)的子代；以及 c. 鑒定步驟（b)的子代植物，其中所述轉(zhuǎn)座子已經(jīng)插入到所述內(nèi)源Fea4基因，并且觀 察到Fea4表達(dá)的降低。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟（a)還包括通過轉(zhuǎn)化來將所述轉(zhuǎn)座子引入 到所述種質(zhì)的可再生的植物細(xì)胞中以及由所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中 所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述轉(zhuǎn)座子。
13. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述方法還包括以下步驟： i.將重組構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組構(gòu)建體包含通過權(quán)利要求4或 5所述的方法鑒定的弱fea4等位基因； ii在步驟（i)之后，由所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及 iii.選擇（ii)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組DNA構(gòu)建體且在與不 包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出弱fea4表型。
14. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中部分（a)的多肽在具有所述fea4突變體基 因型的植物品系中的表達(dá)能夠部分或全部恢復(fù)所述野生型表型。
15. -種產(chǎn)生具有改變的農(nóng)學(xué)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括以下步驟： a.將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含以有義或 反義取向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸 包含： i. SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列； ii基于Clustal W比對方法，在與SEQ ID NO :1或2進(jìn)行比較時具有至少90%的序列 同一性的核苷酸序列； iii. SEQ ID NO :1或2的至少100個連續(xù)的核苷酸的核苷酸序列； iv. 能夠在嚴(yán)格條件下與（i)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或 V.經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中所述前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設(shè)計用于產(chǎn)生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替換所述miRNA編碼區(qū)； b. 在步驟（a)之后，由所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及 c. 選擇（b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組DNA構(gòu)建體且在與不包 含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一種選自下列的農(nóng)學(xué)特性的改 變：增大的穗分生組織、籽粒行數(shù)、種子數(shù)、植物高度、生物量和產(chǎn)量。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-5或8-15中任一項所述的方法，其中所述植物選自：擬南芥、番 茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
17. -種植物，所述植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含 以有義或反義取向或以上兩種取向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多 核苷酸，其中所述多核苷酸包含： a. SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列； b. 基于Clustal W比對方法，在與SEQ ID NO :1或2進(jìn)行比較時具有至少90%的序列 同一性的核苷酸序列； c. 能夠在嚴(yán)格條件下與（a)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或 d. 經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中所述前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設(shè)計用于產(chǎn)生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替換所述miRNA編碼區(qū)；并且 其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一 種選自下列的農(nóng)學(xué)特性的改變：增大的穗分生組織、籽粒行數(shù)、種子數(shù)、植物高度、生物量和 產(chǎn)量。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的植物，其中所述植物選自：擬南芥、番茄、玉米、大豆、向日 葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。
19. 權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述的植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重 組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含以有義或反義取向可操作地連接至在植物中有功 能的啟動子的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含： a. SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列； b. 基于Clustal W比對方法，在與SEQ ID NO :1或2進(jìn)行比較時具有至少90%的序列 同一性的核苷酸序列； c. SEQ ID NO :1或2的至少100個連續(xù)的核苷酸的核苷酸序列；或 d. 經(jīng)修飾的植物miRNA前體，其中所述前體已經(jīng)經(jīng)修飾以用設(shè)計用于產(chǎn)生指向SEQ ID NO :1或2的miRNA的序列替換所述miRNA編碼區(qū)；并且 其中由所述種子產(chǎn)生的植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時 表現(xiàn)出至少一種選自下列的農(nóng)學(xué)特性的改變：增大的穗分生組織、籽粒行數(shù)、種子數(shù)、植物 高度、生物量和產(chǎn)量。
20. -種在植物中表達(dá)異源多核苷酸的方法，所述方法包括： a.用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化可再生的植物細(xì)胞，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接 至第二多核苷酸的異源多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是Fea4啟動子； b. 在步驟（a)之后，由所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及 c. 選擇（b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組DNA構(gòu)建體，并且進(jìn)一步 地，其中所述異源多核苷酸在所述轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述植物選自：擬南芥、番茄、玉米、大豆、向日 葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。
22. -種植物，所述植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含 可操作地連接至第二多核苷酸的異源多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是Fea4啟動子，并 且其中所述異源多核苷酸在所述植物中表達(dá)。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的植物，其中所述植物選自：擬南芥、番茄、玉米、大豆、向日 葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。
24. 權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重 組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至第二多核苷酸的異源多核苷酸，其 中所述第二多核苷酸是Fea4啟動子序列，并且其中所述異源多核苷酸在由所述種子產(chǎn)生 的植物中表達(dá)。
25. -種鑒定具有至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變的第一玉米植物或第一玉米種質(zhì)的方法， 所述方法包括在所述第一玉米植物或所述第一玉米種質(zhì)中檢測至少一種與所述至少一種 農(nóng)學(xué)特性相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記基因座的多態(tài)性，其中所述標(biāo)記基因座編碼多肽，所述多肽包含選 自下列的氨基酸序列：a)與SEQ ID NO :3具有至少90%且小于100%的序列同一性的氨基 酸序列，其中在與對照植物進(jìn)行比較時，所述多肽在植物或其植物部分中的表達(dá)引起至少 一種選自下列的農(nóng)學(xué)特性的改變：穗分生組織尺寸、籽粒行數(shù)、花序數(shù)、在所述花序內(nèi)的分 枝、花數(shù)、果實數(shù)和種子數(shù)，其中所述對照植物包含SEQ ID NO :3。
【文檔編號】C12N15/82GK104519735SQ201380014054
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月14日
【發(fā)明者】M. 艾倫 S., P. 賈克森 D., 科馬特蘇 M., 保爾特勒 M., 沙凱 H., 沃爾布雷奇特 E., 維克斯 R. 申請人:納幕爾杜邦公司, 冷泉港實驗室, 衣阿華州立大學(xué)研究基金公司