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用于增加編碼的治療性蛋白表達(dá)的包含或編碼組蛋白莖環(huán)和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化...的制作方法

文檔序號:466862閱讀:358來源:國知局
用于增加編碼的治療性蛋白表達(dá)的包含或編碼組蛋白莖環(huán)和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種核酸序列,所述核酸序列包含或編碼:編碼區(qū),所述編碼區(qū)編碼至少一種包含治療性蛋白或其片段、變體或衍生物的肽或蛋白,至少一個組蛋白莖環(huán)和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號。此外,本發(fā)明提供所述核酸用于增加所編碼的肽或蛋白的表達(dá)(特別是用于基因治療)的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了其用于制備藥物組合物的應(yīng)用,所述藥物組合物例如,用于基因治療,特別是用于治療需要使用治療性肽或蛋白(優(yōu)選如本文定義)的疾病。本發(fā)明還描述了利用包含或編碼組蛋白莖環(huán)和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號的核酸增加包含治療性蛋白或其片段、變體或衍生物的肽或蛋白的表達(dá)的方法。
【專利說明】用于增加編碼的治療性蛋白表達(dá)的包含或編碼組蛋白莖環(huán) 和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號的核酸
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸序列,所述核酸序列包含或編碼:編碼區(qū),所述編碼區(qū)編碼至 少一種包含治療性蛋白或其片段、變體或衍生物的肽或蛋白,至少一個組蛋白莖環(huán)和聚腺 苷酸序列或聚腺苷酸化信號。此外,本發(fā)明提供所述核酸用于增加所編碼的肽或蛋白的表 達(dá)(特別是用于基因治療)中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了其用于制備藥物組合物的應(yīng)用,所 述藥物組合物例如,用于基因治療,特別是用于治療需要使用治療性肽或蛋白(優(yōu)選如本 文定義)的疾病。本發(fā)明還描述了利用包含或編碼組蛋白莖環(huán)和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸 化信號的核酸增加包含治療性蛋白或其片段、變體或衍生物的肽或蛋白的表達(dá)的方法。
[0002] 基因治療意指使用核酸作為藥劑來治療疾病。其名稱來源于這樣的觀點:核酸可 以用來補充或改變個體細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá),作為治療法來治療疾病。最常見形式的基因治 療涉及使用編碼功能性、治療性蛋白的核酸,以替代突變的基因。其他形式涉及突變的直接 校正,或使用編碼治療性蛋白藥物的核酸來提供治療。
[0003] 基因治療是已經(jīng)在疾病的治療和預(yù)防中得到證明的分子醫(yī)學(xué)方法,并且通常表現(xiàn) 出對日常醫(yī)學(xué)實踐、特別是對本文提及疾病的治療的相當(dāng)大的作用?;蛑委熓腔趯⒑?酸引入到患者細(xì)胞或組織中然后處理由已經(jīng)引入到細(xì)胞或組織中的核酸編碼的信息,也就 是說,處理所需要的多肽的(蛋白)表達(dá)。
[0004] 基因治療可以對多種遺傳或獲得性疾病、特別是傳染病、腫瘤(例如,癌癥或腫瘤 疾病)、血液和血液形成器官的疾病、內(nèi)分泌、營養(yǎng)和代謝病、神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、循環(huán)系統(tǒng)的 疾病、呼吸系統(tǒng)的疾病、消化系統(tǒng)的疾病、皮膚和皮下組織的疾病、肌肉骨骼系統(tǒng)和結(jié)締組 織的疾病和生殖泌尿系統(tǒng)的疾病是有益的。
[0005] 在基因治療方法中,典型地是使用DNA,盡管在最近的開發(fā)過程中RNA也是已知 的。重要的是,在所有這些基因治療方法中,不管是使用DNA、病毒RNA還是mRNA,mRNA作 用為所編碼的蛋白的序列信息的信使。
[0006] 通常,認(rèn)為RNA是不穩(wěn)定分子:RNA酶是普遍存在的,并且眾所周知其是難于滅活 的。此外,與DNA相比,RNA還是更化學(xué)不穩(wěn)定的。因此,可能令人驚訝的是,真核細(xì)胞中 mRNA的"默認(rèn)狀態(tài)"特征在于相對的穩(wěn)定性,并且需要特定的信號來加速個體mRNAs的分 解。關(guān)于這一發(fā)現(xiàn)的主要原因似乎是細(xì)胞內(nèi)mRNA分解幾乎專門由核酸外切酶催化。然而, 真核mRNAs的末端是通過下述特定的末端結(jié)構(gòu)及其相締合的蛋白針對這些酶進行保護的: 在5'端的m7GpppN CAP和典型地在3'端的聚腺苷酸序列。由此認(rèn)為這兩種末端修飾的去 除是mRNA分解的速度限制。盡管穩(wěn)定元件已經(jīng)表征為α-珠蛋白mRNA的3'UTR,但是影 響真核mRNAs的更新的RNA序列典型地通過加速脫腺苷作用而作用為分解的啟動劑(在 Meyer,S.,C.Temme,等人·(2004), Crit Rev Biochem Mol Biol (生物化學(xué)分子生物學(xué)重 要綜述)39 (4) :197-216.中綜述)。
[0007] 如上文提及的,真核mRNAs的5'端典型地在轉(zhuǎn)錄后修飾,以攜帶甲基化的CAP結(jié) 構(gòu),例如,m7GpppN。除了在RNA剪接、穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運中的作用,在翻譯起始過程中,CAP結(jié)構(gòu)顯 著增強40S核糖體亞基向mRNA的5'端的募集。后一種功能需要由真核起始因子復(fù)合物 eIF4F來識別該CAP結(jié)構(gòu)。聚腺苷酸序列另外通過增加40S亞基到mRNAs的募集而刺激翻 譯,這是一種需要聚腺苷酸結(jié)合蛋白(PABP)的干預(yù)的作用。PABP,最近又證明與eIF4G物理 相互作用,eIF4G是CAP-結(jié)合的eIF4F復(fù)合物的一部分。因此,假設(shè)了對加帽的、聚腺苷化 的 mRNAs 的翻譯起始的閉環(huán)模型(Michel,Y.M.,D.Poncet,等人·(2000),J Biol Chem(生 物化學(xué)雜志)275 (41) :32268-76.)。
[0008] 幾乎所有的真核mRNAs的末端都是通過遍在切割/聚腺苷化機制添加在其3'末 端的聚腺苷酸序列。在3'末端存在聚腺苷酸序列是真核mRNAs的最顯著的特征之一。在 切割后,除了復(fù)制依賴性組蛋白轉(zhuǎn)錄物之外,大部分前mRNAs都獲得聚腺苷化的尾部。在這 種情形中,3'末端加工是促進mRNAs從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)并且影響mRNAs的穩(wěn)定性和翻 譯的核共轉(zhuǎn)錄過程。該3'末端的信息以由切割/聚腺苷化機制引導(dǎo)的兩步反應(yīng)發(fā)生,并且 取決于在mRNA前體(前mRNAs)中存在兩種序列元件:高度保守的核苷酸六聚體AAUAAA(聚 腺苷酸化信號)和下游的富含G/U的序列。在第一步中,前mRNAs在這兩個元件之間被切 割開。在與第一步緊密偶聯(lián)的第二步中,剛形成的3'端通過添加由200-250個腺苷酸組成 的聚腺苷酸序列而延伸,所述聚腺苷酸序列基本上影響mRNA代謝的所有方面,包括mRNA輸 出、穩(wěn)定性和翻譯(Dominski,Z.和 W.F.Marzluff (2007),Gene (基因)396(2) :373-90.)。
[0009] 這一法則唯一已知的例外是復(fù)制依賴性組蛋白mRNAs,其末端是組蛋白莖環(huán)而 不是聚腺苷酸序列。示例性的組蛋白莖環(huán)序列記述在Lopez等人.(Ddivila L0pez,M., &Samuelsson,Τ· (2008),RNA(紐約,Ν· Υ·),14(1),1-10. doi :10. 1261/rna. 782308.)中。
[0010] 組蛋白前mRNAs中的莖環(huán)典型地接著富含嘌呤的序列,其稱為組蛋白下游元件 (HDE)。這些前mRNAs在細(xì)胞核中在該莖環(huán)下游的大約5個核苷酸處由單次內(nèi)切核酸水解切 割而進行加工,該單次內(nèi)切核酸水解切割由U7 snRNP通過U7 snRNA與HDE的堿基配對進 行催化。包含組蛋白莖環(huán)結(jié)構(gòu)和組蛋白下游元件(HDE) (U7 snRNP的結(jié)合位點)的3'-UTR 序列通常稱為組蛋白3' -加工信號(例如,參見Chodchoy,N.,N.B.Pandey,等人.(1991). Mol Cell Biol (分子細(xì)胞生物學(xué))11(1) :497-509.)。
[0011] 由于需要將剛合成的DNA包裝成染色質(zhì),組蛋白合成與細(xì)胞周期相適應(yīng)地進行調(diào) 節(jié)。在S期過程中增加的組蛋白類蛋白(histone proteins)合成通過組蛋白基因的轉(zhuǎn)錄 激活以及組蛋白mRNA水平的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控而實現(xiàn)。這可能表明,組蛋白莖環(huán)對于組蛋白表達(dá) 調(diào)節(jié)的所有轉(zhuǎn)錄后步驟都是重要的。其是有效加工、mRNA輸出到細(xì)胞質(zhì)中、負(fù)載到多核糖 體上和對mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)所必需的。
[0012] 在上述情形中,鑒定一種32 kDa的蛋白,其在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中在組蛋白信使的 3'端與組蛋白莖環(huán)相締合。該莖環(huán)結(jié)合蛋白(SLBP)的表達(dá)水平是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的,并且在 S期最高,此時組蛋白mRNA水平增加。SLBP是U7 snRNP對組蛋白前mRNA的有效的3'端 加工所必需的。在加工完成后,SLBP保持與成熟的組蛋白mRNAs的末端的莖環(huán)締合,并且 在刺激其細(xì)胞質(zhì)中翻譯成組蛋白類蛋白。(Dominski,Z.和W. F. Marzluff (2007),Gene (基 因)396(2) :373-90)。有趣的是,SLBP的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在后生動物和原生動物中都是 保守的(Dcivila L0pez,M.,&Samuelsson,T. (2008),RNA(紐約,Ν· Y.),14(1),1-10. doi : 10. 1261/rna. 782308),并且能夠表明,其與組蛋白莖環(huán)序列的結(jié)合取決于莖環(huán)結(jié)構(gòu),并且 最小的結(jié)合位點包含所述莖環(huán)的至少3個5'核苷酸和2個3'核苷酸(Pandey,N. B.,等 人·(1994),Molecular and Cellular Biology (分子和細(xì)胞生物學(xué)),14 (3) ,1709-1720 和 Williams,A. S. , &Marzluff,W.F. , (1995),NucleicAcids Research (核酸研究),23(4), 654-662.)。
[0013] 盡管組蛋白基因通常分類為"復(fù)制依賴性的",其產(chǎn)生末端是組蛋白莖環(huán)的mRNA, 或是"置換型的",其相反產(chǎn)生攜帶聚腺苷酸-尾的mRNA,但是,在一些非常少見的情形中已 經(jīng)鑒定了其天然存在的在其3'包含組蛋白莖環(huán)和聚腺苷酸或寡(A)的mRNAs。Sanchez等人 使用熒光素酶作為報道蛋白在爪蟾(Xenopus)卵子發(fā)生過程中檢驗了附著在組蛋白mRNA 的組蛋白莖環(huán)的3'的天然存在的寡腺苷酸尾的作用,并且發(fā)現(xiàn)寡腺苷酸尾是在卵子發(fā)生過 程中使組蛋白mRNA沉默的翻譯抑制機制的活性部分,并且去除其是激活組蛋白mRNAs翻 譯的機制的一部分(Sanchez,R.和 W.F.Marzluff (2004),Mol Cell Biol (分子細(xì)胞生物 學(xué))24(6) :2513-25)。
[0014] 此外,已經(jīng)使用編碼標(biāo)記蛋白α珠蛋白的人工構(gòu)建體研究了在前mRNA加工和 mRNA穩(wěn)定性水平上對復(fù)制依賴性組蛋白的調(diào)節(jié)的需要,這是利用與內(nèi)含子較少的組蛋白 基因相比珠蛋白基因含有內(nèi)含子的事實。對于這一目的,產(chǎn)生這樣的構(gòu)建體,其中α珠蛋 白編碼序列之后接著組蛋白莖環(huán)信號(組蛋白莖環(huán)之后接著組蛋白下游元件)和聚腺苷 酸化信號(Whitelaw,Ε·,等人·(1986) .Nucleic Acids Research (核酸研究),14(17), 7059-7070· ;Pandey,N.B.,&Marzluff,W.F. (1987).Molecular and Cellular Biology(分 子和細(xì)胞生物學(xué)),7 (12),4557-4559. ;Pandey,Ν· B.,等人·(1990) · Nucleic Acids Research (核酸研究),18(11) ,3161-3170)。
[0015] LUscher等人以另一種方法研究了重組組蛋白H4基因的細(xì)胞周期依賴性調(diào)節(jié)。 產(chǎn)生這樣的構(gòu)建體,其中H4編碼序列之后接著組蛋白莖環(huán)信號和聚腺苷酸化信號,這兩種 加工信號臨時由半乳糖激酶編碼序列隔開(Liischer,B.等人.,(1985).Proc.Natl.Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報),82 (13),4389-4393)。
[0016] 另外,Stauber等人鑒定了在組蛋白H4 mRNA水平上賦予細(xì)胞周期調(diào)節(jié)所需要 的最小序列。對于這些研究,使用這樣的構(gòu)建體,其包含在組蛋白莖環(huán)信號(其后接著 聚腺苷酸化信號)之前的選擇標(biāo)記黃嘌呤:鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(GPT)的編碼序列 (Stauber,C.等人·,(1986). ΕΜΒ0 J,5 (12) ,3297-3303)。
[0017] 檢驗組蛋白前mRNA加工,Wagner等人使用在組蛋白莖環(huán)信號與聚腺苷酸化信號 之間放置EGFP的報道子構(gòu)建體(以使EGFP僅在組蛋白前mRNA加工被破壞的情形中表達(dá)) 鑒定了組蛋白前mRNAs切割所需要的因子(Wagner,E.J.等人.,(2007).M〇1 Cell(分子細(xì) 胞)28(4),692-9)。
[0018] 應(yīng)該注意,聚腺苷化的mRNA的翻譯通常需要使得3'聚腺苷酸序列接近5' CAP。 這通過聚腺苷酸結(jié)合蛋白與真核起始因子eIF4G之間的蛋白-蛋白相互作用而調(diào)控。關(guān)于 復(fù)制依賴性的組蛋白mRNAs,已經(jīng)揭示了類似的機制。在這種情形中,Gallie等人表明組蛋 白莖環(huán)在功能上與聚腺苷酸序列類似,原因在于其提高翻譯效率并且共同依賴于5' -CAP, 從而建立有效的翻譯水平。他們表明組蛋白莖環(huán)足以增加報道m(xù)RNA在轉(zhuǎn)染的中國倉鼠 卵巢細(xì)胞中的翻譯并且是必需的,但是為了最理想地行使功能,必須位于3' -端。因此, 與其他mRNAs上的聚腺苷酸尾相似,這些組蛋白mRNAs的:V端似乎是在體內(nèi)翻譯所必需 的,并且在功能上與聚腺苷酸尾相似(Gallie,D. R.,Lewis,N. J.,&Marzluff,W. F. (1996), Nucleic Acids Research (核酸研究),24(10) ,1954-1962)。
[0019] 另外,可以顯示,SLBP結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)組蛋白mRNA上,并且是其翻譯所需要的。即 使SLBP不直接與eIF4G相互作用,但是組蛋白mRNA翻譯所需要的結(jié)構(gòu)域與最近鑒定的蛋 白SLIP1相互作用。在另一個步驟中,SLIP1與eIF4G相互作用,并且允許組蛋白mRNA循 環(huán)并通過與聚腺苷化mRNAs翻譯相似的機制支持組蛋白mRNA的有效的翻譯。
[0020] 如上文提及,基因治療方法通常使用DNA將編碼信息轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中,然后其轉(zhuǎn)錄 成mRNA,所述mRNA攜帶天然存在的mRNA元件,特別是5' -CAP結(jié)構(gòu)和3'聚腺苷酸序列以 確保所編碼的治療性蛋白或抗原性蛋白的表達(dá)。
[0021] 然而,在多種情形中,不管是使用DNA還是RNA,基于將所述核酸引入到患者細(xì)胞 或組織中并且隨后通過表達(dá)由這些核酸編碼的需要的多肽的表達(dá)系統(tǒng)沒有表現(xiàn)出合乎需 要的、或者甚至是必需的可能允許有效的治療的表達(dá)水平。
[0022] 在現(xiàn)有技術(shù)中,迄今已經(jīng)進行了不同的嘗試在體外和/或體內(nèi)增加編碼的蛋白的 表達(dá)產(chǎn)率,特別是使用改善的表達(dá)系統(tǒng)?,F(xiàn)有技術(shù)中通常所述的增加表達(dá)的方法常規(guī)上是 基于使用包含特定啟動子和相應(yīng)的調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體或盒。由于這些表達(dá)載體或盒典型 地局限于特定的細(xì)胞系統(tǒng),因此這些表達(dá)系統(tǒng)必須進行修改才能用于不同的細(xì)胞系統(tǒng)。然 后通常將所述修改的表達(dá)載體或盒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中并且典型地依賴于特定的細(xì)胞系進行處 理。因此,優(yōu)選主要產(chǎn)生對不依賴于對特定細(xì)胞類型特異性的啟動子和調(diào)節(jié)元件、能夠通過 細(xì)胞中固有的系統(tǒng)在靶細(xì)胞中表達(dá)編碼的蛋白的那些核酸分子。在這種情形中,在mRNA穩(wěn) 定元件和增加 mRNA翻譯效率的元件之間可以區(qū)分。
[0023] 在其編碼序列進行優(yōu)化并且通常適用于這樣的目的的mRNAs記述在中請TO 02/098443 (CureVac GmbH)中。例如,W0 02/098443描述了以通用形式穩(wěn)定并且在其編碼 區(qū)翻譯優(yōu)化的mRNAs。W0 02/098443還公開了確定序列修飾的方法。W0 02/098443另外 描述了為增加序列中的鳥嘌呤/胞嘧啶(G/C)含量而取代mRNA序列中的腺嘌呤和尿嘧啶 核苷酸的可能性。依據(jù)W0 02/098443,所述為增加 G/C含量的取代和修改可以用于基因治 療應(yīng)用,而且還可以用作遺傳疫苗用于癌癥或傳染病的治療。在這一情形中,W0 02/098443 通常提及作為用于所述修飾的基礎(chǔ)序列的序列,其中修飾的mRNA編碼至少一種生物活性 肽或多肽,所述肽或多肽在待治療的患者中例如全然不翻譯或不充分翻譯的或具有錯誤的 翻譯。備選地,W0 02/098443提議編碼抗原(例如,治療性蛋白或病毒抗原)的mRNAs作 為所述修飾的基礎(chǔ)序列。
[0024] 在另一種增加所編碼的蛋白的表達(dá)的方法中,申請W0 2007/036366記述了長的 聚腺苷酸序列(特別是長于120bp)以及β珠蛋白基因的至少兩個3'非翻譯區(qū)的組合對 mRNA穩(wěn)定性和翻譯活性的陽性作用。
[0025] 然而,即使所有這些近來的現(xiàn)有技術(shù)文獻已經(jīng)嘗試提供非常有效的用于基因治療 方法以及另外改善的mRNA穩(wěn)定性和翻譯活性的工具,但是,相對于DNA疫苗和基于DNA的 基因治療方法,仍然存在基于RNA的應(yīng)用穩(wěn)定性通常較低的問題。因此,在本領(lǐng)域中仍然存 在提供用于基因治療方法或作為上文討論的常規(guī)治療的補充治療法的改善的工具的需求, 其允許在體內(nèi)更好地提供所編碼的蛋白,例如,通過進一步改善的mRNA穩(wěn)定性和/或翻譯 活性,優(yōu)選用于基因治療。
[0026] 此外,盡管本領(lǐng)域中的所有進展,在不含細(xì)胞的系統(tǒng)、細(xì)胞或生物體中有效表達(dá)所 編碼的肽或蛋白(重組表達(dá))仍然是具有挑戰(zhàn)性的問題。
[0027] 因此,本發(fā)明基本目的是提供另外的和/或備選的增加所編碼的蛋白的表達(dá)的方 法,優(yōu)選地,通過相對于現(xiàn)有技術(shù)中已知用于遺傳或獲得性疾?。ㄌ貏e如本文定義的)的治 療性或預(yù)防性治療中的基因治療的所述核酸進一步穩(wěn)定mRNA和/或增加所述mRNA的翻譯 效率而進行。
[0028] 該目的通過后附權(quán)利要求的主題來解決。具體地,按照第一方面,本發(fā)明基本目的 通過本發(fā)明的核酸序列而解決,所述核酸序列包含或編碼 :
[0029] a)編碼區(qū),所述編碼區(qū)編碼至少一種包含治療性蛋白或其片段、變體或衍生物的 肽或蛋白;
[0030] b)至少一個組蛋白莖環(huán),和
[0031] c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號,
[0032] 優(yōu)選地用于增加所編碼的肽或蛋白的表達(dá)。
[0033] 備選地,除組蛋白莖環(huán)序列之外的任意適宜的莖環(huán)序列(來源于組蛋白基因,特 別是H1,H2A,H2B,H3和H4家族的組蛋白基因)都可以由本發(fā)明用于其所有的方面和實施 方案中。
[0034] 在這一情形中,特別優(yōu)選的是本發(fā)明第一方面所述的本發(fā)明的核酸至少部分通過 DNA或RNA合成產(chǎn)生,優(yōu)選如本文所述,或是分離的核酸。
[0035] 本發(fā)明是基于本發(fā)明人的令人驚訝的發(fā)現(xiàn):聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號與至 少一種組蛋白莖環(huán)的組合(盡管二者均代表自然中的擇一機制)協(xié)同作用,原因在于該組 合增加蛋白的表達(dá),高于使用任一種單獨的元件所觀察到的水平數(shù)倍(manifold)。觀察到 聚腺苷酸與至少一種組蛋白莖環(huán)的組合的協(xié)同作用與聚腺苷酸和組蛋白莖環(huán)的順序無關(guān), 并且與聚腺苷酸序列的長度無關(guān)。
[0036] 因此,特別優(yōu)選的是,本發(fā)明的核酸序列包含或編碼:a)編碼區(qū),所述編碼區(qū)編碼 至少一種包含治療性蛋白或其片段、變體或衍生物的肽或蛋白;b)至少一個組蛋白莖環(huán), 和c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化序列;優(yōu)選地用于增加所編碼的肽或蛋白的表達(dá),其中所 編碼的蛋白優(yōu)選不是組蛋白類蛋白,特別不是H4,H3,H2A和/或H2B組蛋白家族的組蛋白 類蛋白或其保留組蛋白(_樣)功能(即,形成核小體)的片段、衍生物或變體。此外,所編 碼的蛋白典型地不對應(yīng)于H1組蛋白家族的組蛋白接頭蛋白。本發(fā)明的核酸分子典型地不 包含小鼠組蛋白基因的任何調(diào)節(jié)信號(5'和/或,特別是3'),特別不是小鼠組蛋白基因 H2A的任何調(diào)節(jié)信號,并且進一步最優(yōu)選不是小鼠組蛋白基因 H2A614的任何調(diào)節(jié)信號。特 別地,其不包含來自小鼠組蛋白基因的組蛋白莖環(huán)和/或組蛋白莖環(huán)加工信號,特別地不 是小鼠組蛋白基因 H2A的組蛋白莖環(huán)和/或組蛋白莖環(huán)加工信號,最優(yōu)選不是小鼠組蛋白 基因 H2A614的組蛋白莖環(huán)和/或組蛋白莖環(huán)加工信號。
[0037] 此外,本發(fā)明的核酸在其元件(a)中典型地不提供報道蛋白(例如,熒光素酶, GFP,EGFP,β -半乳糖苷酶,特別是EGFP),半乳糖激酶(galK)和/或標(biāo)記或選擇蛋白(例 如,α-珠蛋白,半乳糖激酶和黃嘌呤:鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(GPT))或細(xì)菌報道蛋白, 例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)或其他細(xì)菌抗生素抗性蛋白,例如,來源于細(xì)菌neo基因的細(xì) 菌抗生素抗性蛋白。
[0038] 報道、標(biāo)記或選擇蛋白典型地理解為不是本發(fā)明所述的治療性蛋白。報道、標(biāo)記或 選擇蛋白或其基礎(chǔ)基因 (underlying gene)通常用作細(xì)菌、細(xì)胞培養(yǎng)物、動物或植物中的研 究工具。它們賦予表達(dá)其的生物體(優(yōu)選是異源表達(dá))容易鑒別的特性,所述特性可以測 量或允許進行選擇。具體地,標(biāo)記或選擇蛋白表現(xiàn)出可選擇的功能。典型地,所述選擇、標(biāo) 記或報道蛋白在人或其他動物中不是天然存在的,而是來源于其他生物體,特別是來源于 細(xì)菌或植物。因此,來源于除哺乳動物之外的物種、特別是除人之外的物種的具有選擇、標(biāo) 記或報道功能的蛋白優(yōu)選排除被理解為本發(fā)明所述的"治療性蛋白"。特別地,選擇、標(biāo)記或 報道蛋白允許通過例如基于熒光或其他分光光度計技術(shù)以及針對抗生素的抗性的體外測 定來鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。因此,賦予轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所述特性的選擇、報道或標(biāo)記基因典型地不被 理解為本發(fā)明所述的治療性蛋白。
[0039] 在任何情形中,報道、標(biāo)記或選擇蛋白通常不發(fā)揮任何治療性作用。如果任一種單 獨的報道、標(biāo)記或選擇蛋白仍然發(fā)揮治療性作用(除了其報道、選擇或標(biāo)記功能之外),則 所述報道、標(biāo)記或選擇蛋白優(yōu)選不被理解為本發(fā)明意義內(nèi)的"治療性蛋白"。
[0040] 相比之下,本發(fā)明所述的治療性蛋白(包括其片段、變體和衍生物),特別排除H1、 H2A、H2B、H3和H4家族的組蛋白基因,典型地不表現(xiàn)出選擇、標(biāo)記或報道功能。如果任一單 個"治療性蛋白"仍然應(yīng)該表現(xiàn)出選擇、標(biāo)記或報道功能(除了其治療性功能之外),則所述 治療性蛋白優(yōu)選不被理解為本發(fā)明意義內(nèi)的"選擇、標(biāo)記或報道蛋白"。
[0041] 最優(yōu)選地理解為本發(fā)明所述的治療性蛋白來源于哺乳動物,特別是人,并且,其不 適合作為選擇、標(biāo)記或報道蛋白。
[0042] 因此,優(yōu)選的是,編碼至少一種肽或蛋白的編碼區(qū)(a)與至少一種組蛋白莖環(huán)的 至少(b),或更廣泛地,與任意適當(dāng)?shù)那o環(huán)是異源的。換言之,在本發(fā)明的情形中,"異源"意 指至少一種莖環(huán)序列不是天然存在為編碼本發(fā)明核酸的元件(a)的(治療性)蛋白或肽的 特定基因的(調(diào)節(jié))序列(例如,在3' UTR)。因此,本發(fā)明核酸的(組蛋白)莖環(huán)優(yōu)選來 源于不同于包含本發(fā)明核酸的元件(a)的編碼區(qū)的基因的基因的3'UTR。例如,如果本發(fā) 明核酸是異源的,則元件(a)的編碼區(qū)不編碼組蛋白類蛋白或其(保留組蛋白類蛋白的功 能的)片段、變體或衍生物,而是編碼發(fā)揮生物學(xué)功能、優(yōu)選不同于組蛋白(_樣)功能的治 療性功能的任意其他的(相同物種或另一種物種的)肽或序列,例如,編碼治療性蛋白(發(fā) 揮治療性功能,例如,關(guān)于內(nèi)分泌紊亂,替代缺陷性的內(nèi)源蛋白,例如,缺陷性的內(nèi)源哺乳動 物蛋白,特別是缺陷性的內(nèi)源人蛋白)。
[0043] 在這一情形中,特別優(yōu)選的是本發(fā)明的核酸在5' -至3' -方向上包含或編碼:
[0044] a)編碼區(qū),所述編碼區(qū)編碼至少一種包含治療性蛋白或其片段、變體或衍生物的 肽或蛋白;
[0045] b)至少一個組蛋白莖環(huán),任選地沒有所述組蛋白莖環(huán)3'的組蛋白下游元件 (HDE),
[0046] c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號。
[0047] 術(shù)語"組蛋白下游元件(HDE) "是指在天然存在的組蛋白莖環(huán)3'的約15-20個核苷 酸的富含嘌呤的多核苷酸片段,其表示參與將組蛋白前mRNA加工為成熟的組蛋白mRNA的 U7 snRNA 的結(jié)合位點。例如,在海膽(sea urchins)中,所述 HDE 為 CAAGAAAGA(Dominski, Ζ·和 W.F.Marzluff (2007),Gene (基因)396 (2) :373-90)。
[0048] 此外,優(yōu)選地,本發(fā)明第一方面所述的本發(fā)明的核酸不包含內(nèi)含子。
[0049] 在另一個特別優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明第一方面所述的本發(fā)明的核酸序列從5' 到3'包含或編碼:
[0050] a)編碼區(qū),優(yōu)選地所述編碼區(qū)編碼至少一種包含治療性蛋白或其片段、變體或衍 生物的肽或蛋白;
[0051] c)聚腺苷酸序列;和
[0052] b)至少一個組蛋白莖環(huán)。
[0053] 本發(fā)明第一實施方案所述的本發(fā)明的核酸序列包含任意適當(dāng)?shù)暮怂?,例如,選自 任意(單鏈或雙鏈)DNA,優(yōu)選地,但不限于此,例如,基因組DNA,質(zhì)粒DNA,單鏈DNA分子,雙 鏈DNA分子,或可以選自例如任意PNA(肽核酸)或可以選自例如任意(單鏈或雙鏈)RNA, 優(yōu)選信使RNA(mRNA);等等。本發(fā)明的核酸序列還可以包含病毒RNA(vRNA)。然而,本發(fā)明 的核酸序列可以不是病毒RNA或者可以不包含病毒RNA。更具體地,本發(fā)明的核酸序列可以 不包含病毒序列兀件,例如,病毒增強子或病毒啟動子(例如,沒有滅活的病毒啟動子或序 列元件,更具體地不是通過更換策略滅活),或其他病毒序列元件,或病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒核 酸序列。更具體地,本發(fā)明的核酸序列可以不是反轉(zhuǎn)錄病毒或病毒載體或修飾的反轉(zhuǎn)錄病 毒或病毒載體。
[0054] 在任意情形中,本發(fā)明的核酸序列可以或可以不包含增強子和/或啟動子序列, 其可以被修飾或不被修飾或者其可以是激活的或不被激活。所述增強子或啟動子可以是植 物可表達(dá)的或不可表達(dá)的,和/或在真核生物中可表達(dá)或不可表達(dá)和/或在原核生物中可 表達(dá)或不可表達(dá)。本發(fā)明的核酸序列可以包含或不包含編碼(自我剪接)核酶的序列。
[0055] 在具體的實施方案中,本發(fā)明的核酸序列可以是或可以包含自我復(fù)制的RNA(復(fù) 制子)。
[0056] 優(yōu)選地,本發(fā)明的核酸序列是質(zhì)粒DNA或RNA,特別是mRNA。
[0057] 在本發(fā)明第一方面的具體的實施方案中,本發(fā)明的核酸是包含在適于體外轉(zhuǎn)錄的 核酸中的核酸序列,特別是包含在適當(dāng)?shù)捏w外轉(zhuǎn)錄載體中的核酸序列(例如,包含用于體 外轉(zhuǎn)錄的特定啟動子(諸如T3、T7或Sp6啟動子)的質(zhì)粒或線性核酸序列)。
[0058] 在本發(fā)明第一方面的其他特別優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的核酸包含在適于 在表達(dá)系統(tǒng)中(例如,在表達(dá)載體或質(zhì)粒中)、特別是在原核(例如,細(xì)菌,如大腸桿菌 (E. coli),或真核(例如,哺乳動物細(xì)胞,如CH0細(xì)胞,酵母細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞或完整生物體, 如植物或動物)表達(dá)系統(tǒng)中)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核酸中。
[0059] 術(shù)語"表達(dá)系統(tǒng)"意指適于產(chǎn)生肽、蛋白或RNA,特別是mRNA(重組表達(dá))的系統(tǒng) (細(xì)胞培養(yǎng)物或完整生物體)。
[0060] 本發(fā)明第一方面所述的本發(fā)明的核酸序列包含或編碼至少一個(組蛋白)莖環(huán)。 莖環(huán)(不管其是組蛋白莖環(huán)還是不是組蛋白莖環(huán))通??梢源嬖谟趩捂淒NA中,或者更常 見地存在于RNA中。該結(jié)構(gòu)還稱為發(fā)夾或發(fā)夾環(huán),并且通常由連續(xù)序列內(nèi)的莖和(末端)環(huán) 組成,其中所述莖由兩條由在一定程度上作為間隔體的短序列隔開的相鄰的完全或部分反 向互補的序列形成,所述作為間隔體的短序列成為所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)。這兩條相鄰的完全 或部分反向互補的序列可以定義為,例如,莖環(huán)元件莖1和莖2。當(dāng)這兩條相鄰的完全或部 分反向互補的序列,例如,莖環(huán)元件莖1和莖2,彼此形成堿基配對時,形成雙鏈的核酸序列 片段,其在其末端包含由位于連續(xù)序列上的莖環(huán)元件莖1和莖2之間的短序列形成的不配 對的環(huán),從而形成莖環(huán)。不配對的環(huán)由此典型地表示核酸不能與這些莖環(huán)元件中的任一個 堿基配對的區(qū)域。形成的棒棒糖-形狀的結(jié)構(gòu)是多種RNA二級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)單元。因此, 莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成依賴于產(chǎn)生的莖和環(huán)區(qū)域的穩(wěn)定性,其中第一前提條件典型地是存在可以 自身向后折疊形成配對雙鏈的序列。配對的莖環(huán)元件的穩(wěn)定性由長度、其包含的錯配或凸 起的數(shù)量(少量錯配典型地是可耐受的,尤其是較長的雙鏈片段)以及配對區(qū)的堿基組成 決定。在本發(fā)明的情形中,3-15個堿基的環(huán)長度是可能的,但是更優(yōu)選的環(huán)長度是3-10個 堿基,更優(yōu)選3-8個,3-7個,3-6個或甚至更優(yōu)選4-5個堿基,并且最優(yōu)選4個堿基。形成 雙鏈結(jié)構(gòu)的莖序列典型地具有5-10個堿基的長度,更優(yōu)選5-8個堿基的長度。
[0061] 在本發(fā)明的情形中,組蛋白莖環(huán)典型地來源于組蛋白基因(例如,來源于組蛋白 家族H1,H2A,H2B,H3,H4的基因),并且包含兩條相鄰的完全或部分反向互補的序列的分子 內(nèi)堿基配對,由此形成莖環(huán)。典型地,組蛋白3' UTR莖環(huán)是參與組蛋白mRNAs的核質(zhì)轉(zhuǎn)運 以及在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性和翻譯效率的調(diào)節(jié)的RNA元件。后生動物組蛋白基因的mRNAs缺 少聚腺苷化和聚腺苷酸尾,相比之下,3 '端加工在該高度保守的莖環(huán)與下游約20個核苷 酸處的富含嘌呤的區(qū)域(組蛋白下游元件,或HDE)之間的位點發(fā)生。組蛋白莖環(huán)被31kDa 莖環(huán)結(jié)合蛋白(SLBP-也稱為組蛋白發(fā)夾結(jié)合蛋白或HBP)結(jié)合。所述組蛋白莖環(huán)結(jié)構(gòu)優(yōu)選 由本發(fā)明與其他序列元件和結(jié)構(gòu)組合使用,所述其他序列元件和結(jié)構(gòu)不天然存在于(意指 在未轉(zhuǎn)化的活生物體/細(xì)胞中)組蛋白基因中,而是按照本發(fā)明組合以提供人造的異源核 酸。因此,本發(fā)明特別是基于這樣的發(fā)現(xiàn):組蛋白莖環(huán)結(jié)構(gòu)與其他異源序列元件的人工(非 天然的)組合提供有利的作用,所述其他異源序列元件不存在于組蛋白基因中或后生動物 組蛋白基因中,并且分離自編碼不同于組蛋白的蛋白的基因的可操作和/或調(diào)節(jié)序列區(qū)域 (影響轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)。因此,本發(fā)明的一個方面提供組蛋白莖環(huán)結(jié)構(gòu)與不存在于后生動 物組蛋白基因中的聚腺苷酸序列或表示聚腺苷酸化信號的序列(編碼區(qū)的3'-端)的組 合。
[0062] 按照本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面,提供組蛋白莖環(huán)結(jié)構(gòu)與編碼優(yōu)選不存在于后生 動物組蛋白基因中的治療性蛋白的編碼區(qū)的組合(編碼區(qū)和組蛋白莖環(huán)序列是異源的)。 如果所述治療性蛋白天然存在于哺乳動物中,優(yōu)選人中,則其是優(yōu)選的。在一個更優(yōu)選的實 施方案中,本發(fā)明核酸的所有元件(a)、(b)和(c)彼此是異源的,并且由三種不同的來源人 工組合,例如,(a)治療性蛋白編碼區(qū)來源于人基因,(b)組蛋白莖環(huán)來源于后生動物、例如 哺乳動物、非人或人組蛋白基因,(c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號來源于例如不同于組 蛋白基因并且不同于編碼本發(fā)明的核酸元件(a)所述的治療性蛋白的基因的基因的非翻 譯區(qū)。
[0063] 因此,組蛋白莖環(huán)是本文所述的莖環(huán)結(jié)構(gòu),如果優(yōu)選是官能化限定的,則其表現(xiàn)出 /保留與其天然結(jié)合配偶體莖環(huán)結(jié)合蛋白(SLBP-也稱作組蛋白發(fā)夾結(jié)合蛋白或HBP)結(jié)合 的特性。
[0064] 按照本發(fā)明,權(quán)利要求1的組件(b)所述的組蛋白莖環(huán)序列可以不是來源于小鼠 組蛋白類蛋白。更特別地,所述組蛋白莖環(huán)序列可以不是來源于小鼠組蛋白基因 H2A614。此 夕卜,本發(fā)明的核酸可以不包含小鼠組蛋白莖環(huán)序列也不包含小鼠組蛋白基因 H2A614。此外, 即使本發(fā)明的核酸序列可以包含至少一種哺乳動物組蛋白基因,但是本發(fā)明的核酸序列可 以不包含莖環(huán)加工信號,更具體地,小鼠組蛋白加工信號,并且最具體地,可以不包含小鼠 莖環(huán)加工信號H2kA614。然而,所述至少一種哺乳動物組蛋白基因可以不是W0 01/12824的 Seq. ID No. 7〇
[0065] 按照本發(fā)明第一方面的一個優(yōu)選的實施方案,本發(fā)明的核酸序列包含或編碼至少 一種組蛋白莖環(huán)序列,優(yōu)選按照下式(I)或(II)中的至少一種所述:
[0066] 式(I)(不具有莖邊界元件的莖環(huán)序列):
[0067]
【權(quán)利要求】
1. 核酸序列,其包含或編碼: a) 編碼區(qū),所述編碼區(qū)編碼至少一種肽或蛋白; b) 至少一種組蛋白莖環(huán),和 c) 聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號; 其中所述肽或蛋白包含選自下述的治療性蛋白或其片段、變體或衍生物: (i) 用于治療代謝或內(nèi)分泌紊亂的治療性蛋白, (ii) 用于治療血液病癥、循環(huán)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、癌癥或腫瘤疾病、傳染病或免 疫缺陷的治療性蛋白, (iii) 用于激素替代療法的治療性蛋白, (iv) 用于使體細(xì)胞重新編程成為多能或全能干細(xì)胞的治療性蛋白, (v) 選自佐劑或免疫刺激性蛋白的治療性蛋白;和 (vi) 抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸,其中所述至少一種組蛋白莖環(huán)與編碼所述至少一種肽 或蛋白的編碼區(qū)是異源的,優(yōu)選其中所述編碼區(qū)不編碼組蛋白或其具有組蛋白或組蛋白樣 功能的片段、衍生物或變體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸,其中由所述編碼區(qū)編碼的肽或蛋白包含治療性蛋 白或其片段、變體或衍生物,所述治療性蛋白的片段、變體或衍生物保留天然存在的全長治 療性蛋白的至少50%的生物活性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的核酸,其中其編碼區(qū)不編碼報道蛋白或標(biāo)記或選 擇蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的核酸序列,其中所述肽或蛋白包含選自下述的治療性蛋白 或其片段、變體或衍生物: 用于治療代謝或內(nèi)分泌紊亂的治療性蛋白,其包括酸性鞘磷脂酶,Adipotide, Agalsidase_0,Alglucosidase, α-半乳糖苷酶Α,α-葡糖苷酶,α-L-艾杜糖苷酸酶, a-N-乙酰葡糖苷酶,雙調(diào)蛋白,血管生成素(Angl,Ang2, Ang3, Ang4, ANGPTL2, ANGPTL3, ANGPTL4,ANGPTL5,ANGPTL6,ANGPTL7),β動物纖維素,β-葡糖醛酸糖苷酶,骨形態(tài)發(fā)生 蛋白 BMPs(BMPl,ΒΜΡ2, ΒΜΡ3, ΒΜΡ4, ΒΜΡ5, ΒΜΡ6, ΒΜΡ7, BMP8a,BMP8b,ΒΜΡ10, ΒΜΡ15),CLN6 蛋白,表皮生長因子(EGF),Epigen,表皮調(diào)節(jié)素,成纖維細(xì)胞生長因子(FGF,F(xiàn)GF-l,F(xiàn)GF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23),Galsulphase, 葛瑞林,葡糖腦苷脂酶,GM-CSF,肝素-結(jié)合EGF-樣生長因子(HB-EGF),肝細(xì)胞生長因 子HGF,Hepcidin,人白蛋白,增加的白蛋白損失,艾度硫酸酯酶(艾杜糖醒酸-2-硫酸酯 酶),整聯(lián)蛋白ανβ3, ανβ5和α5β 1,艾杜糖醛酸硫酸酯酶,拉羅尼酶,N-乙酰半乳 糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB ;galsulfaSe,芳基硫酸酯酶A (ARSA),芳基硫酸酯酶B (ARSB)), N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶,神經(jīng)生長因子(NGF,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF),神經(jīng)營養(yǎng)因 子-3 (NT-3),和神經(jīng)營養(yǎng)因子4/5 (NT-4/5),神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG1,NRG2, NRG3, NRG4),神經(jīng) 氈蛋白(NRP-1,NRP-2),肥胖抑制素,血小板衍生生長因子(PDGF(PDFF-A,PDGF-B,PDGF-C, TOGF-D),TGF β受體(內(nèi)皮因子,TGF- β 1受體,TGF- β 2受體,TGF- β 3受體),血小板生成 素(ΤΗΡ0)(巨核細(xì)胞生長和發(fā)育因子(MGDF)),轉(zhuǎn)化生長因子(TGF(TGF-a,TGF-MTGF3 1, TGFP 2,和 TGFP 3))),VEGF(VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E,VEGF-F 和 PIGF), 奈西立肽,胰蛋白酶,促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH),心房鈉尿肽(ANP),膽囊收縮素,胃泌素, 瘦蛋白,催產(chǎn)素,生長抑素,加壓素(抗利尿激素),降鈣素,Exenatide,生長激素(GH),生 長素,胰島素,胰島素樣生長因子lIGF-l,Mecaserminrinfabate,IGF-l類似物,美卡舍 明,IGF-1類似物,培維索孟,普蘭林肽,特立帕肽(人甲狀旁腺素殘基1-34),貝卡普勒明, Dibotermin-α (骨形態(tài)發(fā)生蛋白2),醋酸組氨瑞林(促性腺素釋放激素;GnRH),奧曲肽,和 帕利夫明(角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子;KGF); 用于治療血液病癥、循環(huán)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、癌癥或腫瘤疾病、傳染病或免疫缺 陷的治療性蛋白,其包括阿替普酶(組織型纖溶酶原激活物;tPA),阿尼普酶,抗凝血酶 III (AT-III),比伐盧定,達(dá)貝泊汀a,屈曲克凝a (活化的蛋白C,促紅細(xì)胞生成素,依泊汀 a,促血紅細(xì)胞生長素,紅細(xì)胞生成素,因子IX,因子Vila,因子VIII,來匹盧定,蛋白質(zhì)C濃 縮劑,瑞替普酶(tPA的缺失突變蛋白),鏈激酶,替奈普酶,尿激酶,血管抑素,抗-CD22免疫 毒素,地尼白介素 _ 毒素連接物,Immunocyanin,MPS (Metallopanstimulin),Aflibercept, 內(nèi)皮抑素,膠原酶,人脫氧核糖核酸酶I,鏈道酶,透明質(zhì)酸酶,木瓜蛋白酶,L-天冬酰胺酶, Peg-天冬酰胺酶,拉布立酶,人慢性促性腺素(HCG),人促卵泡激素(FSH),促黃體素-α,催 乳素,α-l-蛋白酶抑制劑,乳糖酶,胰酶(脂肪酶,淀粉酶,蛋白酶),腺苷脫氨酶(牛培加 酶,PEG-ADA),阿巴他塞,阿來法塞,阿那白滯素,依那西普,白細(xì)胞介素-l(IL-l)受體拮抗 齊U,阿那白滯素,胸腺素,TNF-α拮抗劑,恩夫韋肽,和胸腺素 α 1 ; 選自佐劑或免疫刺激性蛋白的治療性蛋白,其包括:人佐劑蛋白,特別是模式識別受 體 TLR1,TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11 ;N0D1,N0D2, N0D3, N0D4, N0D5, NALP1, NALP2, NALP3, NALP4, NALP5, NALP6, NALP6, NALP7, NALP7, NALP8, NALP9, NALP10, NALP11,NALP12, NALP13, NALP14,1IPAF,NAIP,CIITA,RIG-I,MDA5 和 LGP2, TLR 信 號傳導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)劑,包括銜接子蛋白,包括例如,Trif和Cardif;小-GTP酶信號傳導(dǎo)的組 分(RhoA,Ras,Racl,Cdc42, Rab 等),PIP 信號傳導(dǎo)的組分(PI3K,Src-激酶等),MyD88-依 賴性信號傳導(dǎo)的組分(MyD88, IRAKI,IRAK2, IRAK4, TIRAP,TRAF6等),MyD88-非依賴性信 號傳導(dǎo)的組分(TICAM1,TICAM2, TRAF6, TBK1,IRF3, TAK1,IRAKI等);活化的激酶,包括,例 如,Akt,MEKK1,MKK1,MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, ERK1,ERK2, GSK3, PKC 激酶,PKD 激酶,GSK3 激酶,JNK,P38MAPK,TAK1,IKK 和 TAK1 ;活化的轉(zhuǎn)錄因子,包括,例如,NF- κ B,c-Fos,c-Jun, c-Myc,CREB,AP-1,Elk-1,ATF2, IRF-3, IRF-7,熱休克蛋白,諸如 HSP10, HSP60, HSP65, HSP70,HSP75和HSP90, gp96,纖維蛋白原,纖連蛋白的TypIII重復(fù)額外結(jié)構(gòu)域A ;或補體系 統(tǒng)的成分,包括 Clq,MBL,Clr,Cls,C2b,Bb,D,MASP-1,MASP-2, C4b,C3b,C5a,C3a,C4a,C5b, C6, C7, C8, C9, CR1,CR2, CR3, CR4, ClqR,C1INH,C4bp,MCP,DAF,H,I,P 和 CD59,或誘導(dǎo)的靶 基因,包括,例如,β-防衛(wèi)素,細(xì)胞表面蛋白;或人佐劑蛋白,包括trif,flt-3配體,Gp96或 纖連蛋白,誘導(dǎo)或增強先天性免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子,包括IL-1 a,IL1 β,IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, TNFa , IFNa , IFN3, IFNy,GM-CSF,G-CSF,M-CSF ;趨化因子,包括 IL-8, IP-10, MCP-1,MIP-1 a,RANTES,嗜酸 性粒細(xì)胞趨化因子,CCL21 ;由巨噬細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子,包括IL-1,IL-6, IL-8, IL-12和 TNF-a ;以及 IL-1R1 和 IL-la ; 細(xì)菌(佐劑)蛋白,特別是細(xì)菌熱休克蛋白或伴侶蛋白,包括Hsp60, Hsp70, Hsp90, HsplOO ;來自革蘭氏陰性細(xì)菌的OmpA(外膜蛋白);細(xì)菌孔蛋白,包括OmpF ;細(xì)菌毒素,包 括來自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的百日咳毒素(PT),來自百日咳博德 特氏菌的百日咳腺苷酸環(huán)化酶毒素 CyaA和CyaC,來自百日咳毒素的PT-9K/129G突變體, 來自百日咳博德特氏菌的百日咳腺苷酸環(huán)化酶毒素 CyaA和CyaC,破傷風(fēng)毒素,霍亂毒素 (CT),霍亂毒素 B-亞基,來自霍亂毒素的CTK63突變體,來自CT的CTE112K突變體,大腸桿 菌(Escherichia coli)熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT),來自熱不穩(wěn)定性腸毒素的B亞基(LTB), 具有減少的毒性的大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素突變體,包括LTK63, LTR72 ;苯酚可溶性調(diào) 控蛋白;來自幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的嗜中性粒細(xì)胞活化蛋白(HP-NAP);表 面活性蛋白D;來自布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)的外表面蛋白A脂蛋白,來自 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的Ag38(38kDa抗原);來自細(xì)菌菌毛的蛋 白;霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的腸毒素 CT,來自革蘭氏陰性細(xì)菌的菌毛的菌毛蛋白,和 表面活性蛋白A和細(xì)菌鞭毛蛋白, 原生動物(佐劑)蛋白,特別是來自克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi)的Tc52,來自 Trypanosoma gondii的PFTG,原生動物熱休克蛋白,來自利什曼原蟲屬物種(Leishmania spp.)的LelF,來自剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)的肌動蛋白抑制蛋白樣蛋白, 病毒(佐劑)蛋白,特別是呼吸道合胞病毒融合糖蛋白(F-蛋白),來自MMT病毒的包 膜蛋白,小鼠白血病病毒蛋白,野生型麻疹病毒的血凝素蛋白, 真菌(佐劑)蛋白,特別是真菌免疫調(diào)節(jié)性蛋白(FIP;LZ-8); 以及賊鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH),OspA ; 用于激素替代療法的治療性蛋白,特別是雌激素,孕酮或黃體酮,和睪酮; 用于將體細(xì)胞重新編程為多能或全能干細(xì)胞的治療性蛋白,特別是〇ct-3/4, Sox基因 家族(Soxl,Sox2, Sox3 和 Soxl5),Klf 家族(Klfl,Klf2, Klf4 和 Klf5),Myc 家族(c-myc, L-myc 和 N-myc),Nanog 和 LIN28 ;和 選自用于治療癌癥或腫瘤疾病的抗體的治療性抗體,特別是131T-托西莫單抗,3F8, 8H9,阿巴扶單抗,阿德木單抗,Afutuzumab,Alacizumab pegol,阿侖珠單抗,Amatuximab, AME-133v,AMG102,麻安莫單抗,阿泊珠單抗,巴土昔單抗,貝妥莫單抗,貝利木單抗,貝 伐珠單抗,比伐單抗-DM1,Blinatumomab,Brentuximab vedotin,Cantuzumab,美坎珠 單抗,Cantuzumab ravtansine,卡羅單抗噴地肽,Carlumab,卡妥索單抗,西妥昔單抗, Citatuzumab bogatox, Cixutumumab, Clivatuzumab tetraxetan, CNT0328, CNTO 95, Conatumumab, Dacetuzumab, Dalotuzumab,地舒單抗,地莫單抗,Drozitumab, Ecromeximab, 依決洛單抗,Elotuzumab,Elsilimomab,Enavatuzumab,Ensituximab,依帕珠單抗, Ertumaxomab, Ertumaxomab, Etaracizumab, Farletuzumab, FBTA05, Ficlatuzumab, Figitumumab, Flanvotumab, Galiximab, Galiximab, Ganitumab, GC1008,吉妥珠單抗,吉妥 珠單抗奧佐米星,Girentuximab,Glemnbatumumab vedotin,GS6624, HuC242_DM4, HuHMFGl, HuN901_DMl,替伊莫單抗,Icrucumab, ID09C3,Indatuximab ravtansine,伊珠單抗奧佐 米星,Intetumumab, Ipilimumab, Iratumumab, Labetuzumab,雷克薩單抗,林妥珠單抗, Lorvotuzumab mertansine, Lucatumumab,魯昔單抗,Mapatumumab, Matuzumab, MDX-060, MEDI 522,米妥莫單抗,Mogamulizumab,MORab-003, MORab-009, Moxetumomab pasudotox, MT103,他那可單抗,Naptumomab estafenatox,Narnatumab,Necitumumab,尼妥珠單抗,尼 妥珠單抗,Olaratumab,Onartuzumab,Oportuzumab monatox, Oregovomab, Oregovomab, PAM4,帕尼單抗,Patritumab,Pemtumomab,帕妥珠單抗,普立昔單抗,Racotumomab, Radretumab,雷莫蘆單抗,Rilotumumab,利妥昔單抗,Robatumumab,Samalizumab,SGN-30, SGN-40,西羅珠單抗,Siltuximab,Tabalumab,Tacatuzumab tetraxetan,帕他普莫單抗, Tenatumomab,Teprotumumab,TGN1412,Ticilimumab ( = tremelimumab),Tigatuzumab, TNX-650,托西莫單抗,曲妥珠單抗,TRBS07, Tremelimumab,TRU-016, TRU-016, Tucotuzumab celmoleukin,Ublituximab,Urelumab,維妥珠單抗,維妥珠單抗(IMMU-106),Volociximab, 伏妥莫單抗,WX-G250, zalutumumab和他珠單抗; 用于治療免疫病癥的抗體,特別是依法利珠單抗,依帕珠單抗,Etrolizumab, Fontolizumab,Ixekizumab,美泊利單抗,Milatuzumab,匯集的免疫球蛋白,普立昔單抗,利 妥昔單抗,Rontalizumab,盧利珠單抗,Sarilumab,維多珠單抗,Visilizumab,Reslizumab, 阿達(dá)木單抗,Aselizumab,Atinumab,Atlizumab,貝利木單抗,Besilesomab,BMS-945429, Briakinumab,Brodalumab,卡那單抗,卡那單抗,培舍珠單抗,厄利珠單抗,F(xiàn)ezakinumab, 戈利木單抗,Gomiliximab,英夫利昔單抗,Mavrilimumab,那他珠單抗,Ocrelizumab,奧 度莫單抗,奧法木單抗,Ozoralizumab,Pexelizumab,羅維珠單抗,SBI-087,SBI-087, Secukinumab,Sirukumab,他利珠單抗,托珠單抗,Toralizumab,TRU-015, TRU-016,優(yōu)特克 單抗,優(yōu)特克單抗,維帕莫單抗,阿佐莫單抗,Sifalimumab,魯昔單抗,和Rho(D)免疫球蛋 白; 用于治療傳染病的抗體,特別是阿非莫單抗,CR6261,埃巴單抗,Efungumab,艾韋單 抗,非維珠單抗,F(xiàn)oravirumab,Ibalizumab,Libivirumab,Motavizumab,奈巴庫單抗, Tuvirumab,烏珠單抗,巴土昔單抗,Pagibaximab,帕利珠單抗,Panobacumab,PR0140,瑞非 韋魯,Raxibacumab,瑞加韋單抗,司韋單抗,Suvizumab,和替非珠單抗; 用于治療血液病癥的抗體,特別是阿昔單抗,阿托木單抗,依庫珠單抗,美泊利單抗和 Milatuzumab ; 用于免疫調(diào)節(jié)的抗體,特別是抗胸腺細(xì)胞球蛋白,巴利昔單抗,西地珠單抗,達(dá)利珠單 抗,Gavilimomab,伊諾莫單抗,莫羅莫那-⑶3,莫羅莫那-⑶3,奧度莫單抗和Siplizumab ; 用于治療糖尿病的抗體,特別是Gevokizumab,Otelixizumab和Teplizumab ; 用于治療阿爾茨海默病的抗體,特別是Bapineuzumab,Crenezumab,Gantenerumab, Ponezumab,R1450 和 Solanezumab ; 用于治療哮喘的抗體,特別是 Benralizumab,Enokizumab,Keliximab,Lebrikizumab, 奧馬珠單抗,Oxelumab,Pascolizumab 和 Tralokinumab ; 用于治療多種病癥的抗體,特別是 Blosozumab,CaroRx,F(xiàn)resolimumab,F(xiàn)ulranumab, Romosozumab,司他莫單抗,Tanezumab和雷珠單抗。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的核酸序列,其中所述核酸是RNA,優(yōu)選是mRNA。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的核酸序列,其中所述至少一種組蛋白莖環(huán)選自下 述式⑴或(II): 式(I)(不具有莖邊界元件的莖環(huán)序列):
式(II)(具有莖邊界元件的莖環(huán)序列):
其中: 莖1或莖2邊界元件&_6 是1-6個、優(yōu)選2-6個、更優(yōu)選2-5個、甚至更優(yōu)選3-5個、 最優(yōu)選4-5個或5個Ν的連續(xù)序列,其中每個Ν彼此獨立地選自下述核苷酸:所述核苷酸選 自A,U,T,G和C,或其核苷酸類似物; 莖1 [%_26隊_5] 與元件莖2反向互補或部分反向互補,并且是5-7個核苷酸的連續(xù)序 列; 其中隊_2是0-2個、優(yōu)選0-1個、更優(yōu)選1個N的連續(xù)序列,其中每個N彼此獨立地選 自下述核苷酸:所述核苷酸選自A,U,T,G和C或其核苷酸類似物; 其中N3_5是3-5個、優(yōu)選4-5個、更優(yōu)選4個N的連續(xù)序列,其中每個N彼此獨立地選 自下述核苷酸:所述核苷酸選自A,U,T,G和C或其核苷酸類似物,并且 其中G是鳥苷或其類似物,并且可以任選地被胞苷或其類似物替代,條件是其在莖2中 的互補核苷酸胞苷被鳥苷替代; 環(huán)序列[隊_4出/1〇隊_4] 位于元件莖1和莖2之間,并且是3-5個核苷酸、更優(yōu)選4個 核苷酸的連續(xù)序列; 其中每個%_4彼此獨立地是0-4個、優(yōu)選1-3個、更優(yōu)選1-2個N的連續(xù)序列,其中每 個N彼此獨立地選自下述核苷酸:所述核苷酸選自A,U,T,G和C或其核苷酸類似物;并且 其中U/T表示尿苷或任選地胸苷; 莖2[隊_50%_2]與元件莖1反向互補或部分反向互補,并且是5-7個核苷酸的連續(xù)序 列; 其中N3_5是3-5個、優(yōu)選4-5個、更優(yōu)選4個N的連續(xù)序列,其中每個N彼此獨立地選 自下述核苷酸:所述核苷酸選自A,U,T,G和C,或其核苷酸類似物; 其中乂_2是0-2個、優(yōu)選0-1個、更優(yōu)選1個N的連續(xù)序列,其中每個N彼此獨立地選 自下述核苷酸:所述核苷酸選自A,U,T,G和C或其核苷酸類似物;并且 其中C是胞苷或其類似物,并且可以任選地被鳥苷或其類似物替代,條件是其在莖1中 的互補核苷酸鳥苷被胞苷替代; 其中 莖1和莖2能夠彼此堿基配對 形成反向互補序列,其中堿基配對可以發(fā)生在莖1與莖2之間,或者 形成部分反向互補的序列,其中不完全的堿基配對可以發(fā)生在莖1和莖2之間。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸序列,其中所述至少一種組蛋白莖環(huán)選自下式(la)或 (Ila)中的至少一個:
式(la)(不具有莖邊界元件的莖環(huán)序列)
式(Ila)(具有莖邊界元件的莖環(huán)序列)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的核酸序列,其中所述聚腺苷酸序列包含約25至 約400個腺苷核苷酸的序列,優(yōu)選約50至約400個腺苷核苷酸的序列,更優(yōu)選約50至約 300個腺苷核苷酸的序列,甚至更優(yōu)選約50至約250個腺苷核苷酸的序列,最優(yōu)選約60至 約250個腺苷核苷酸的序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的核酸序列,其中所述聚腺苷酸化信號包含共有 序列 NN (U/T) ANA,優(yōu)選 AA (U/T) AAA 或 A (U/T) (U/T) AAA。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的核酸序列,其中所述核酸序列是修飾的核酸, 特別是穩(wěn)定的核酸。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的核酸序列,其中,與野生型核酸的編碼區(qū)的G/C含量相比, 所述修飾的核酸的編碼至少一種肽或蛋白的編碼區(qū)的G/C含量增加,與野生型核酸所編碼 的氨基酸序列相比,所述修飾的核酸編碼的氨基酸序列優(yōu)選不被修飾。
13. 組合物或試劑盒或部件的試劑盒,其包含多種或多于一種核酸序列,所述核酸序列 每種為根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的核酸序列。
14. 權(quán)利要求1-12中任一項定義的核酸序列或權(quán)利要求13定義的組合物或試劑盒或 部件的試劑盒,其用作藥物。
15. 權(quán)利要求1-12中任一項定義的核酸序列或權(quán)利要求13定義的組合物或試劑盒或 部件的試劑盒,其用于基因療法。
16. 藥物組合物,其包含權(quán)利要求1-12中任一項定義的核酸序列或權(quán)利要求13定義的 組合物和任選的藥用載體。
17. 權(quán)利要求1-12中任一項定義的核酸序列或權(quán)利要求13定義的組合物或試劑盒或 部件的試劑盒用于增加所述編碼的肽或蛋白的表達(dá)的應(yīng)用。
18. 權(quán)利要求1-12中任一項定義的核酸序列或權(quán)利要求13定義的組合物或試劑盒或 部件的試劑盒用于增加基因療法中所述編碼的肽或蛋白的表達(dá)的應(yīng)用。
19. 一種用于增加編碼的肽或蛋白表達(dá)的方法,所述方法包括下述步驟: a) 提供權(quán)利要求1-12中任一項定義的核酸序列或權(quán)利要求13定義的組合物, b) 將所述核酸序列或所述組合物應(yīng)用于或施用至不含細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)胞、組織或 生物體。
【文檔編號】C12N15/117GK104114705SQ201380009418
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年2月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月15日
【發(fā)明者】安德烈亞斯·特斯, 托馬斯·施拉克, 約亨·普羅布斯特 申請人:庫瑞瓦格有限責(zé)任公司
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