賦予酵母對(duì)乙醇和高溫的耐受性的基因的制作方法
【專利摘要】描述與了鑒定賦予酵母乙醇耐受性的基因的方法、賦予乙醇耐受性的基因、以及用于鑒定這些基因的突變株。此處特指為HpETT1的基因是從多形漢遜酵母中分離的。在特指為7E的乙醇敏感突變體多形漢遜酵母菌株中HpETT1的表達(dá)互補(bǔ)了該突變體的乙醇敏感性。當(dāng)該HpETT1的多個(gè)拷貝被整合到該基因組中并過量表達(dá)時(shí)，被轉(zhuǎn)化的菌株表現(xiàn)了大約10倍更大的對(duì)乙醇的耐受性和對(duì)蛋白錯(cuò)誤折疊劑AZC的耐受性。HpETT1的表達(dá)還增加了釀酒酵母中的乙醇耐受性。HpEtt1與來自釀酒酵母表示為MPE1的一種先前鑒定的蛋白具有39％序列一致性，然而，該MPE1基因不會(huì)賦予對(duì)該7E突變體的乙醇耐受性。鑒定了另一種來自樹干畢赤酵母的基因，該基因此處被指定為PsETT1，它編碼一種與HpETT1具有37％一致性的直系同源蛋白，并且還賦予對(duì)該7E突變體的乙醇耐受性。
【專利說明】賦予酵母對(duì)乙醇和高溫的耐受性的基因 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0001] 本發(fā)明要求于2012年1月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/585, 873和61/585, 917 的優(yōu)先權(quán)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本披露涉及賦予用以通過發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的酵母乙醇耐受性的基因，具體涉及多形 漢遜酵母的木糖發(fā)酵菌株的增加的乙醇耐受性，涉及有用于鑒定乙醇耐受基因的多形漢遜 酵母的乙醇敏感突變體，涉及多形漢遜酵母的乙醇耐受重組體，并且更具體地涉及此處分 別指定為HpETTl和PsETTl的來自多形漢遜酵母和樹干畢赤酵母的基因序列，HpETTl和 PsETTl與釀酒酵母的MPEl基因在序列上相似但賦予酵母（包括多形漢遜酵母和釀酒酵 母）增加的乙醇耐受性。 背景
[0003] 在該背景部分和后面的說明中引用的參考文獻(xiàn)是為了提供對(duì)下文所述的發(fā)明的 更好的理解，作為材料和方法的來源（它們會(huì)進(jìn)一步使人員能夠?qū)嵺`這些方法和/或獲得 下文所述的組合物），以及作為這類方法的縮略。因此，通過引用來結(jié)合此處引用的每個(gè)參 考文獻(xiàn)以達(dá)到這樣的程度，這些參考文獻(xiàn)為幫助制備和使用后面所要求保護(hù)的發(fā)明提供教 導(dǎo)。如果在此處提供的披露和參考文獻(xiàn)中有任何沖突，本披露將引用的參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)控 制在它們沖突的程度內(nèi)。此處任何參考文獻(xiàn)的引用并非承認(rèn)這樣的文獻(xiàn)與下文所要求保護(hù) 的發(fā)明有關(guān)或是其現(xiàn)有技術(shù)。
[0004] 多形漢遜酵母是具有工業(yè)和科學(xué)重要性的一種酵母種類。這種非常規(guī)的耐熱親甲 烷性酵母是用于生產(chǎn)異源蛋白的最好的酵母系統(tǒng)之一（蓋利森（GelliSSen)，2000 ;蓋利森 (Gellissen)編輯.2002 ;蘇科（Suckow)和蓋利森（Gellissen)，2002)，它充當(dāng)研究過氧化 物酶體功能（范德克萊恩（VanderKlei)和維恩威斯（Veenhuis)，2002)、甲醇代謝、硝酸 鹽同化（西維里奧（Siverio) ,2002)以及應(yīng)激反應(yīng)（烏比沃夫克（Ubiyvovk)等人，2006) 的一個(gè)模型。多形漢遜酵母還具有在通過木質(zhì)纖維素碳源發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料中有用的潛 力，因?yàn)樗軌虬l(fā)酵木糖（瑞奧博弗（Ryabova)等人，2003)并且是最耐熱的酵母種類中的 一種（格拉（Guerra)等人，2005)。然而，多形漢遜酵母作為通過發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的一種有機(jī) 體是受限的，因?yàn)榕c其他酵母（例如釀酒酵母）相比它的生長(zhǎng)對(duì)乙醇相當(dāng)敏感。 概述
[0005] 諸位發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，為了在通過發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料的商業(yè)應(yīng)用中有用，如果 多形漢遜酵母對(duì)乙醇的耐受性被提高的話將是令人希望的。此處所述的這些發(fā)現(xiàn)在集中于 識(shí)別用于構(gòu)建多形漢遜酵母的乙醇耐受菌株的研究中產(chǎn)生。諸位發(fā)明人創(chuàng)建了多形漢遜酵 母的插入性突變體的文庫集。從插入性突變體的文庫集中選擇一個(gè)顯示對(duì)乙醇高度敏感的 轉(zhuǎn)化體（此處指定為7E)。在對(duì)該突變體中的插入盒進(jìn)行測(cè)序中發(fā)現(xiàn)，該插入破壞了此處 指定為HpETTl(SEQ.IDNO: 1)的一個(gè)基因的開放閱讀框，該基因編碼一種未知的蛋白（SEQ IDN0:2)，該蛋白相應(yīng)地被指定為Ettl。通過將Ettl的氨基酸序列與酵母數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì) t匕，發(fā)現(xiàn)Ettl與由MPEl基因（SEQ.IDN0:6)編碼的釀酒酵母的蛋白（SEQ.IDN0:5)享有 約39%的序列一致性。這一基因被報(bào)道是編碼對(duì)于體外RNA3'端加工來說必要的一種蛋 白的必需酵母基因，并且是所謂的CPF復(fù)合體的一個(gè)亞單元（沃（Vo)等人，2001)。該MPEl 基因?qū)τ卺劸平湍革@然是必需的，因?yàn)獒劸平湍窶PEl缺失突變體不能成活。
[0006] 相比之下，由諸位發(fā)明人識(shí)別的多形漢遜酵母突變體7E盡管在一個(gè)基因中具有 破壞仍保持成活，該基因與釀酒酵母MPEl基因具有接近的ORF相似性。盡管如上所述，在 普通生長(zhǎng)介質(zhì)上該7E突變體具有生存能力，但它對(duì)乙醇是高度敏感的。如此處進(jìn)一步闡述 的，未被破壞的HpETTl基因在7E突變體中的表達(dá)成功地互補(bǔ)該突變體對(duì)乙醇的高度敏感。
[0007] 搜索酵母數(shù)據(jù)庫顯示了另一種同源基因，此處指定為PsETTl，存在于另一種木糖 發(fā)酵酵母--樹干畢赤酵母中。PsETTl的產(chǎn)物，PsEttl與HpEttl具有大約37%氨基酸一 致性。諸位發(fā)明人分離該P(yáng)sETTl基因并在多形漢遜酵母7E突變體中表達(dá)它，并且顯示像 一樣HpETTl，該樹干畢赤酵母基因的表達(dá)至少部分地互補(bǔ)了該多形漢遜酵母ettl突變體 對(duì)乙醇的高度敏感。
[0008] 仍進(jìn)一步，顯示使用如此處所述地構(gòu)建的多拷貝整合體在多形漢遜酵母中過量表 達(dá)天然HpETTl基因，得到多形漢遜酵母的一種轉(zhuǎn)化菌株，該轉(zhuǎn)化菌株在對(duì)乙醇的耐受性上 相對(duì)于親代菌株具有大約10倍的增加。仍然更令人驚訝地，顯示在釀酒酵母中表達(dá)該多形 漢遜酵母HpETTl基因也賦予了該酵母乙醇耐受性方面可檢測(cè)的增加。
[0009] 因此，本教導(dǎo)呈現(xiàn)了一些有用的新方面。一方面是多形漢遜酵母的一種突變株，其 特征為對(duì)乙醇敏感，并且具有突變，該突變破壞了HpETTl基因的功能性表達(dá)。另一個(gè)方面 是鑒定一種基因的方法，該基因賦予一種酵母菌株以乙醇耐受性，所述方法包括用表達(dá)候 選核酸的載體轉(zhuǎn)化該多形漢遜酵母ettl突變株，選擇補(bǔ)互補(bǔ)該ettl突變體對(duì)乙醇的敏感 性的轉(zhuǎn)化體，并鑒定該候選核酸的序列以鑒定賦予乙醇耐受性的基因。另一個(gè)方面是編碼 一種Ettl蛋白的一種分離的核酸，其特征為當(dāng)在該ettl突變體中表達(dá)時(shí)，該核酸互補(bǔ)該突 變體的乙醇敏感性。編碼Ettl蛋白的核酸的代表性實(shí)例是SEQ.IDNO: 1的HpETTl基因，其 編碼SEQ.IDN0:2的HpEttl蛋白，以及SEQ.IDN0:3的PsETTl基因，其編碼SEQ.ID.N0:4 的PsEttl蛋白。一個(gè)相關(guān)方面是指定為Ettl的新型蛋白類別及其分離的版本的鑒定。仍 另一個(gè)相關(guān)方面是一種重組核酸，該重組核酸包括編碼Ettl蛋白的序列和啟動(dòng)子，該啟動(dòng) 子在選擇的酵母菌株中是可操作的，該酵母菌株被可操作地配置為表達(dá)在該選擇的酵母菌 株中的ETTl基因。這類載體的實(shí)例示于圖1中并包括ρ21+ΕΤΤ1Ηρ和pGLG61+ETTlHp，其 每種都被配置為表達(dá)該多形漢遜酵母Ettl蛋白，以及p70+ETTlPst，其被配置為表達(dá)一種 樹干畢赤酵母Ettl蛋白。這些載體具有選擇為在多形漢遜酵母中特別地可操作的啟動(dòng)子。 另一個(gè)實(shí)例是prPGKISc+ETTIHp，其被配置為在釀酒酵母中表達(dá)HpETTl基因。
[0010] 另一個(gè)重要的方面是具有增強(qiáng)的乙醇耐受性的酵母菌株，該耐受性可通過在酵母 菌株中過量表達(dá)Ettl蛋白產(chǎn)生。具有增加的乙醇耐受性的酵母菌株可以是包括一種重組 核酸的多形漢遜酵母菌株、釀酒酵母菌株或樹干畢赤酵母菌株，該重組核酸過量表達(dá)來自 多形漢遜酵母或樹干畢赤酵母的Ettl蛋白中的至少一種。這類菌株的示例性實(shí)施例包括 多形漢遜酵母菌株7E-GAPDHETTlPst、7E-GAPDHETTlHp、和3Leu+pETTl-10,以及釀酒酵母 菌株BY4742+prPGKlSc+ETTlHp。 toon] 應(yīng)注意，最初針對(duì)在材料和方法部分中使用的這些載體、基因、蛋白和菌株的命名 具有根術(shù)語"MPE1"，隨后是針對(duì)該基因獲得自何種有機(jī)體的一個(gè)后綴，即Hp針對(duì)多形漢遜 酵母，Pst針對(duì)樹干畢赤酵母，并且Sc針對(duì)釀酒酵母。最初使用這種命名是因?yàn)樵卺槍?duì)與多 形漢遜酵母7E突變體中破壞的基因相似的序列搜索酵母數(shù)據(jù)庫之后，發(fā)現(xiàn)最接近的已知 序列是釀酒酵母MPEl基因，所以最初給予來自樹干畢赤酵母和多形漢遜酵母的最接近的 相似序列相同的名字。然而，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)該釀酒酵母MPEl基因不互補(bǔ)該多形漢遜酵母7E突變 體的乙醇敏感性，而來自多形漢遜酵母和樹干畢赤酵母的相似序列互補(bǔ)該突變，更適當(dāng)?shù)?是將該多形漢遜酵母和樹干畢赤酵母基因作為新型的乙醇耐受性基因，此處以后綴"ETT1" 命名。因此，最初命名為ρ21+ΜΡΕ1Ηρ和pGLG61+MPElHp或p70+MPElPst的載體被重命名為 ρ21+ΗρΕΤΤ1和pGLG61+HpETTl以及p70+PsETTl。僅釀酒酵母基因嚴(yán)格地被稱為MPE1。 附圖簡(jiǎn)要說明 圖I. 1和1. 2顯示此處描述的載體的示意性圖示。圖a和b顯示多形漢遜酵母表達(dá) 載體，c、d和e顯示用于在多形漢遜酵母中表達(dá)該多形漢遜酵母HpETTl基因、該釀酒酵母 MPEl基因、以及該樹干畢赤酵母PsETTl基因的構(gòu)建體。圖1.2f顯示用于在多形漢遜酵母 中多拷貝整合該HpETTl基因的一種載體。 圖2描述了固體培養(yǎng)基密度測(cè)定，顯示與非突變株3Leu+⑵和親代菌株NCYC4951eul-l(3)相比，該HpETTl突變體多形漢遜酵母菌株7E(1)的乙醇敏感性。A組顯 示細(xì)胞在37°C下過夜生長(zhǎng)之后的密度，這些細(xì)胞最初以指定的光密度鋪板于具有指定百分 比的乙醇的YNB培養(yǎng)基上（加2%蔗糖）。B組顯示在存在1 %乙醇的YNB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)過 夜之后的密度。 圖3A顯示用于鑒定質(zhì)粒染色體整合體的基因組整合體和探針，并且圖3B顯示用于分 析整合體7E、Nl和N2的拷貝數(shù)的DNA印跡。 圖4顯示多形漢遜酵母HpEttl蛋白（Hp)、釀酒酵母Mpel蛋白（Sc)、樹干畢赤酵母PsEttl蛋白（Ps)之間的序列比較，以及它們之間的一致序列。 圖5描述了固體培養(yǎng)基密度測(cè)定，顯示通過表達(dá)HpETTl和PsETTl基因而不是釀酒酵 母MPEl基因?qū)Χ嘈螡h遜酵母7E突變的互補(bǔ)。上面的組顯示在單獨(dú)的YH)介質(zhì)上生長(zhǎng)，并且 下面的組顯示在Yro介質(zhì)加7 %乙醇上生長(zhǎng)。這些菌株是：（1)多形漢遜酵母7E突變體親代 菌株；（2) 3Leu+對(duì)照；（3)用釀酒酵母MPEl基因轉(zhuǎn)化的7E轉(zhuǎn)化體，指定為7EGAPDHMPEISc; (4)用樹干畢赤酵母ETTl基因轉(zhuǎn)化的7E轉(zhuǎn)化體，指定為7E-GAPDHETTlPst;以及（5)用多 形漢遜酵母ETTl基因轉(zhuǎn)化的7E轉(zhuǎn)化體，指定為7E-PETT1HP-1。 圖6描述了固體培養(yǎng)基密度測(cè)定，顯示在過量表達(dá)HpETTl基因的菌株3Leu+pETTl-10 中乙醇耐受性增強(qiáng)。該3Leu+pETTl-10菌株是通過用多拷貝整合載體pGLG61+ETTlHP轉(zhuǎn) 化3Leu+菌株獲得的。上面的組顯示在單獨(dú)的YPS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且下面的組顯示在 YPD介質(zhì)加7(%乙醇上生長(zhǎng)。這些菌株是：（l)7E突變體；（2)3Leu+對(duì)照親代菌株；以及 (3) 3Leu+pETTl-10菌株，它是用多拷貝的多形漢遜酵母pETTl基因轉(zhuǎn)化的對(duì)照親代菌株。 圖7是顯示當(dāng)生長(zhǎng)于缺少乙醇的YH)介質(zhì)㈧以及含6 %乙醇的YH)介質(zhì)⑶中 時(shí)，與對(duì)照菌株3Leu+(實(shí)線）相比，在多形漢遜酵母中過量表達(dá)HpETTl基因的菌株 31eU+pETTl-10(點(diǎn)虛線）的生長(zhǎng)特征中增強(qiáng)的乙醇耐受性的圖。 圖8是顯示在單獨(dú)的YPS介質(zhì)（A)或含7%乙醇的YPS介質(zhì)（B)上，與對(duì)照親代菌株 3Leu+(實(shí)線）相比，該7E突變體（點(diǎn)虛線）的乙醇敏感性和在多形漢遜酵母中過量表達(dá) HpETTl基因的菌株31eu+pETTl-10 (短劃線）的生長(zhǎng)特征中增強(qiáng)的乙醇耐受性的圖。 圖9顯示通過在具有或不具有乙醇或應(yīng)激誘導(dǎo)劑AZC的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，與親代對(duì) 照菌株31eu+(2)和突變株7E菌株（1)相比，過量表達(dá)HpETTl基因的3Leu+pETTl-10(3)菌 株中應(yīng)激耐受性增加。 圖10是描述該多形漢遜酵母7E突變體（短劃線）與其親代菌株31eu+(實(shí)線）相比 的溫度敏感性的圖。 圖11是顯示當(dāng)在50°C下生長(zhǎng)于使用2 %木糖作為碳源的YNB培養(yǎng)基中，與該7E突變體（點(diǎn)虛線）和該親代菌株31eu+(實(shí)線）相比，過量表達(dá)HpETTl基因的菌株 3Leu+pETTl-10(短劃線）生長(zhǎng)特征改善。 圖12描述了固體培養(yǎng)基密度測(cè)定，顯示在表達(dá)來自多形漢遜酵母的HpETTl基因的 至少兩種釀酒酵母菌株（4和5)中，乙醇耐受性增加。菌株1是僅承載釀酒酵母質(zhì)粒載體 Yep352的對(duì)照菌株，并且菌株2-6是具有那種載體但在釀酒酵母啟動(dòng)子的控制下攜帶多形 漢遜酵母HpETTl基因的轉(zhuǎn)化體的單獨(dú)的分離株。上面的組是對(duì)照生長(zhǎng)培養(yǎng)基（YNB加蔗糖、 leu、Iys和his)，下面的組與其相同進(jìn)一步包含6%乙醇。 圖13描述了固體培養(yǎng)基密度測(cè)定，顯示當(dāng)在鋪板之前在37°C下培養(yǎng)或在56°C下熱擊 15min時(shí)，與親代對(duì)照31eu+(2)和菌株MPEISc(用一個(gè)載體轉(zhuǎn)化以過量表達(dá)釀酒酵母MPEl 蛋白的3Leu+)相比，過量表達(dá)HpETTl基因（3)的多形漢遜酵母的3Leu+pETTl-10菌株的 熱擊耐受性增加。 圖14顯示了 12%SDSPAGE結(jié)果，該結(jié)果顯示使用his標(biāo)記的表達(dá)載體在大腸桿菌中 過量表達(dá)之后，該HpEttl蛋白（箭頭）的分離。泳道分配：1.蛋白梯；2.在到柱上之前總 的可溶性蛋白；3.可溶性蛋白流動(dòng)通過；4-9.從柱上相繼洗脫的各組分。 詳細(xì)說明 定義
[0012] 此處使用的某些常用的或新引入的術(shù)語被認(rèn)為是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解 的，或是鑒于本披露通常被理解的。此處包括這樣通常理解的意思，然而為了解決澄清使用 某些術(shù)語所指稱的對(duì)象的問題，提供了以下非限制性定義以幫助更好地理解本發(fā)明。
[0013] 同胞菌株是一種微生物菌株，其與盡管不必然具有相同的基因型的另一個(gè)菌株是 相同種類。
[0014] 親代菌株是一種微生物菌株，與同微生物體的衍生菌株具有相同遺傳背景，除了 在該衍生菌株中進(jìn)行了的改變。
[0015] ettl突變株，是多形漢遜酵母的菌株，此處示例為多形漢遜酵母7E，具有破壞此 處鑒定為HpETTl的基因的表達(dá)的突變，與缺少該突變的同胞或親代多形漢遜酵母菌株相 t匕，該突變株顯示出對(duì)在乙醇上生長(zhǎng)的敏感性。
[0016] ETTl基因是一種來自編碼一種蛋白（Ettl蛋白）的任何來源的基因，該蛋白質(zhì)在 一種ettl突變株中表達(dá)時(shí)，至少部分地克服了該突變株的乙醇敏感生長(zhǎng)特性。
[0017] HpETTl基因是從多形漢遜酵母的一個(gè)菌株中獲得的編碼一種Ettl蛋白的核酸， 在此針對(duì)該基因示例為SEQ.IDNOl并且針對(duì)該蛋白（HpEttl蛋白）示例為SEQ.IDN02。
[0018] PsETTl基因是從樹干畢赤酵母的一個(gè)菌株中獲得的編碼一種Ettl蛋白的核酸， 在此針對(duì)該基因示例為SEQ.IDN03并且針對(duì)該蛋白（PsEttl蛋白）示例為SEQ.IDN04。
[0019] 過量表達(dá)是指在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中，通常將編碼ORF的一種核酸表達(dá)至比在相似 生長(zhǎng)條件下在該宿主細(xì)胞的未轉(zhuǎn)化的親代中表達(dá)的相同核酸更大的程度。
[0020] 乙醇敏感性或乙醇敏感生長(zhǎng)增加是指當(dāng)乙醇存在于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中時(shí)，與在相同培 養(yǎng)基上生長(zhǎng)的相同有機(jī)體的同胞菌株相比，一個(gè)受試菌株以更低的速率、向更低的密度生 長(zhǎng)或者以其他方式的活力降低。
[0021] 乙醇耐受性增強(qiáng)是指當(dāng)乙醇存在于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中時(shí)，與在相同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的相 同有機(jī)體的同胞菌株相比，一個(gè)受試菌株以更快的速率、向更大的密度生長(zhǎng)或者以其他方 式的活力增加。 用以進(jìn)行示例性實(shí)施例的材料和方法
[0022] 菌株和牛長(zhǎng)備件。此處披露的酵母菌株列于表1中。將多形漢遜酵母NCYC495 Ieul-I菌株用作插入誘變的受體，并在37°C將其維持在包含0. 67%YNB(Difco,底特律， MI，USA)補(bǔ)充以2%蔗糖和40mgI/1亮氨酸的基本培養(yǎng)基中。多形漢遜酵母7E被選擇為 多形漢遜酵母NCYC495Ieul-I菌株的一個(gè)插入性突變體，它不能在補(bǔ)充以7%乙醇的YPS 介質(zhì)（0.5%酵母提取物，1%蛋白胨和2%蔗糖）中生長(zhǎng)。
[0023] 該多形漢遜酵母CBS4732S菌株（拉切瓦（Lahtchev)等人，2002)被用作該HpETTl 基因的一個(gè)來源。將該菌株在37°c下維持在Yro介質(zhì)（0.5%酵母提取物，1%蛋白胨和2% 葡萄糖）中。
[0024] 將樹干畢赤酵母菌株CBS6054 (楊（Yang)等人，1994)用作該樹干畢赤酵母 PsETTl基因的一個(gè)來源，它是HpETTl的一個(gè)直系同源物。將釀酒酵母菌株BY4742 (布拉赫 曼（Brachmann)等人，1998)用作釀酒酵母MPEl基因的來源。
[0025] 將該3Leu+菌株（伊什切克（Ishchuk)等人，2008)用作在多形漢遜酵母中過量表 達(dá)HpETTl的一個(gè)受體菌株。
[0026] 選擇酵母轉(zhuǎn)化體是在具有2%蔗糖的YNB介質(zhì)上或在補(bǔ)充以IgΓ1遺傳霉素或 140mgΓ1博來霉素的YPS介質(zhì)（0. 5%酵母提取物，1 %蛋白胨和2%蔗糖）上。
[0027] 當(dāng)需要一個(gè)細(xì)菌宿主時(shí)，將大腸桿菌菌株DH5a[cD80dlacZAM15、recAl、endAl、 gyrA96、thi-l、hsdR17(rK'mK+)、supE44、relAl、deoR、Δ(lacZYA_argF)U169]用在實(shí)驗(yàn)中。 將該細(xì)菌菌株在37°C下在豐富（LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如在薩姆布魯克（Sambrook)等人，1989 中所述的。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞維持在包含IOOmgΓ1氨比西林的培養(yǎng)基中。 表1. 這項(xiàng)研究中使用的酵母菌株

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的核酸，該核酸編碼一種與釀酒酵母Mpel蛋白（SEQ. ID N0:6)的ORF有 至少37% -致性的蛋白質(zhì)，其中當(dāng)所述的由該核酸編碼的蛋白在該ettl突變株中表達(dá)時(shí)， 所述分離的核酸互補(bǔ)由多形漢遜酵母的ettl突變株賦予的乙醇敏感性。
2. 如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中由所述核酸編碼的蛋白是一種根據(jù)SEQ. ID N0:2的多形漢遜酵母ettl蛋白或是一種根據(jù)SEQ. ID N0:4的樹干畢赤酵母ettl蛋白。
3. 如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中該分離的核酸被可操作地配置有一種啟動(dòng) 子，以在由包含該分離的核酸的載體轉(zhuǎn)化的酵母中表達(dá)所述蛋白。
4. 如權(quán)利要求3所述的分離的核酸，其中該酵母選自由多形漢遜酵母和釀酒酵母組成 的組。
5. -種酵母，該酵母被用權(quán)利要求3所述的分離的核酸轉(zhuǎn)化。
6. 如權(quán)利要求5所述的酵母，其中該酵母選自由多形漢遜酵母和釀酒酵母組成的組。
7. 如權(quán)利要求5所述的酵母，其中該分離的核酸是以多拷貝整合入該酵母的基因組 中。
8. -種用于制備乙醇的方法，包括：在選擇以生產(chǎn)乙醇的條件下，在一種介質(zhì)中培養(yǎng) 權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的酵母。
9. 多形漢遜酵母的一種菌株，該菌株在編碼根據(jù)SEQ. ID N0:2的蛋白的ETT1基因中有 一種突變，其中與缺少這樣一種突變的多形漢遜酵母的親代菌株相比，該突變導(dǎo)致對(duì)生長(zhǎng) 在包含乙醇的介質(zhì)上敏感。
10. 如權(quán)利要求9所述的菌株，被指定為7E，保藏為NRRL_。
11. 一種鑒定賦予酵母增強(qiáng)的乙醇耐受性的基因的方法，包括：用一種可操作地連接 至一種啟動(dòng)子的候選核酸轉(zhuǎn)化根據(jù)權(quán)利要求9的親代多形漢遜酵母菌株，該啟動(dòng)子表達(dá)由 該候選核酸編碼的一種蛋白；選擇與該突變體親代菌株相比，展現(xiàn)了在包含乙醇的介質(zhì)中 增強(qiáng)生長(zhǎng)的多形漢遜酵母的被轉(zhuǎn)化的子代菌株；并確定在所選的被轉(zhuǎn)化的子代菌株中表達(dá) 的該候選核酸的一個(gè)序列。
12. 權(quán)利要求11所述的方法，其中該候選核酸編碼與根據(jù)SEQ ID N0:6的釀酒酵母 mpel蛋白具有至少39%序列一致性的一種蛋白質(zhì)。
13. 權(quán)利要求11所述的方法，其中該候選核酸編碼與根據(jù)SEQ ID N0:2的多形漢遜酵 母ettl蛋白具有至少37%序列一致性的一種蛋白質(zhì)。
14. 權(quán)利要求11所述的方法，其中該候選核酸編碼與根據(jù)SEQ ID N0:4的樹干畢赤酵 母ettl蛋白具有至少37%序列一致性的一種蛋白質(zhì)。
15. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中該子代菌株是用一種載體轉(zhuǎn)化的，該載體將該候 選基因中的多個(gè)拷貝引入該子代菌株的染色體中。
【文檔編號(hào)】C12P7/06GK104428418SQ201380004910
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年1月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月12日
【發(fā)明者】查爾斯·阿巴斯, 安德烈·A·希博尼, 安德烈·Y·沃羅諾夫斯基, 奧萊納·P·伊修克 申請(qǐng)人:阿徹丹尼爾斯米德蘭德公司