專利名稱：一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，特別涉及一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法。
背景技術：
生香酵母又稱為產(chǎn)酯酵母，能夠以乙醇為碳源，既具備酒精發(fā)酵能力又具備醋酸發(fā)酵能力，能夠產(chǎn)生以酯香為主的多種香味物質。其可以以糖、醛、有機酸、鹽類為養(yǎng)料，在酯酶作用下合成酯類。芝蘭香型白酒兼具醬香味和糊味，因而選育出生香功能強大的生香酵母，將有利于芝蘭香型白酒產(chǎn)酯增香、除雜味、使酒體協(xié)調，改善芝蘭香型白酒質量。芝蘭香型白酒生產(chǎn)采用高溫堆積，中溫和低溫酵母菌細胞生長受到抑制；且隨著發(fā)酵進行乙醇逐漸積累，當其濃度達到一定值時便會抑制酵母菌的細胞生長和代謝。因此選育優(yōu)良的耐高溫、耐乙醇生香酵母菌株，既能提高芝蘭香型白酒生產(chǎn)產(chǎn)率，又能改善芝蘭香白酒質量。CN101831386A的發(fā)明公開了一種耐鹽生香酵母篩選方法及其工藝，其方法是:采用15W的紫外燈30cm處照射菌懸液而誘變菌種，用透明圈法，初篩到比出發(fā)菌種優(yōu)良的菌種，再通過放在生產(chǎn)曲房與生產(chǎn)成曲同步培養(yǎng)進行復篩，最后將酵母菌經(jīng)多次馴化培養(yǎng)，平板分離，使篩選菌種純化，得到優(yōu)質耐鹽生香酵母。但是該酵母并不能耐高溫、耐乙醇，不適用于芝蘭香型白酒生產(chǎn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的 目的在于提供一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法，該方法操作簡單、方便，可以篩選出耐高溫耐乙醇的酵母菌株，適用于芝蘭香型白酒生產(chǎn)。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:
一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法，所述的馴化方法步驟如下:
(1)、以總酯含量和聞香為指標，同時兼顧酒精度，從市售的生香酵母中篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株；
(2)、將步驟(I)篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株接入麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，獲得對數(shù)期生香酵母菌液，將對數(shù)期生香酵母菌液與海藻酸鈉水溶液在室溫無菌狀態(tài)下混合均勻，再將混合液加入到氯化鈣水溶液中制備成凝膠球顆粒，然后在2-4°C下固化4-5小時得固定化凝膠顆粒，用無菌水將固定化凝膠顆粒水洗后獲得固定化生香酵母；
(3)、對固定化生香酵母在乙醇馴化培養(yǎng)基中進行耐高溫耐乙醇的循環(huán)梯度馴化，具體設置參數(shù)為:循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度范圍為:最低濃度為1%-5%，最高濃度為10%-15% ;循環(huán)梯度馴化的溫度范圍為:最低溫度為28-32 °C，最高溫度為40-45 V ;每個梯度采用乙醇體積百分比濃度的梯度增幅1%_3%及采用溫度梯度增幅
0.5°C -3 V ;循環(huán)馴化多次，最后得到耐高溫耐乙醇的生香酵母。馴化是一種定向選育微生物的方法，其中的微生物由于逐步適應某種特定條件，最后獲得較高耐受力和代謝活性。本發(fā)明以市售的生香酵母為對象，通過開發(fā)合適的馴化方法，以獲得適用于芝蘭香型白酒生產(chǎn)的耐高溫耐乙醇的生香酵母。作為優(yōu)選，步驟(I)具體為:將市售的生香酵母純化培養(yǎng)后在30°C下用麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)7天得發(fā)酵液，以國標GB/T 10345-2007為標準，聞香并測定發(fā)酵液酒精度、總酯，達標的酵母菌株即為生香優(yōu)良的酵母菌株。作為優(yōu)選，步驟(2)中凝膠球顆粒的具體制備方法為:采用1.0-3.0 g海藻酸鈉加入有50 mL蒸餾水的250 mL三角瓶中，加熱溶解后冷卻，取3-5 mL對數(shù)期生香酵母菌液加入三角瓶中混合均勻，混合液通過注射器注入1-3%重量百分比濃度的氯化鈣水溶液中，制備成凝膠球顆粒。作為優(yōu)選，所述凝膠球顆粒的直徑為2-3mm。作為優(yōu)選，步驟(3)中循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度范圍為:最低濃度為1%_3%，最高濃度為10%-12%;循環(huán)梯度馴化的溫度范圍為:最低溫度為28-30 0C，最高溫度為 40-42 °C。作為優(yōu)選，循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度梯度具體為:2%、4%、6%、8%、10%、12%，循環(huán)梯度馴化的溫度梯度具體為:30°C、32°C、34°C、36 °C、38°C、4(TC、42。。。作為優(yōu)選，步驟(3)中循環(huán)馴化次數(shù)為2-5次。作為優(yōu)選，步驟(3)中每個梯度的馴化時間為24-72小時。作為優(yōu)選，每個梯度的馴化時間為40-48小時。作為優(yōu)選，乙醇馴 化培養(yǎng)基由乙醇與YH)液體培養(yǎng)基混合組成。本發(fā)明的有益效果是:
1、選用循環(huán)梯度馴化法，操作簡單、方便，可以篩選出耐高溫耐乙醇的酵母菌株，解決了芝蘭香型白酒生產(chǎn)中生香酵母的耐高溫、耐乙醇性能差的缺陷，提高了發(fā)酵能力，同時也為其它香型白酒相關研究提供借鑒意義。2、本發(fā)明選用固定化酵母菌形式進行馴化，使得其可以在極端條件下進行反復使用，具有操作快速、簡單。


圖1是本發(fā)明實施例1的循環(huán)梯度馴化流程示意圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例，并結合附圖，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。
本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。麥芽汁培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基及YPD液體培養(yǎng)基均為現(xiàn)有常規(guī)培養(yǎng)基。實施例1
(I)、生香酵母曲購自山東梁山良友生物工程有限公司，取2 g干曲置于裝有100 mL無菌水并帶玻璃珠的三角瓶中，200 r/min振蕩30 min后進行梯度稀釋，取10_5、10_6、10_7稀釋度的樣品200 μ L均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基的平板上，每個樣品平行涂布4塊。待長出菌落后，選擇具有典型酵母菌菌落特征的單菌落進一步劃線分離2 3次，經(jīng)鏡檢為純種后分別轉入YPD固體培養(yǎng)基斜面，低溫保存，備用。取保存的純種酵母菌株，30°C下用麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)7天得發(fā)酵液，以國標GB/T10345-2007為標準，聞香并測定發(fā)酵液的酒精度、總酯,達標的酵母菌株即為生香優(yōu)良的酵母菌株(若有5株以上的酵母菌株達標，則選取總酯含量最高的三株作為生香優(yōu)良的酵母菌株)。(2)、將步驟(I)篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株接入麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，獲得對數(shù)期生香酵母菌液，將對數(shù)期生香酵母菌液與海藻酸鈉水溶液在室溫無菌狀態(tài)下混合均勻，再將混合液加入到氯化鈣水溶液中制備成凝膠球顆粒，然后在2-4°C下固化4-5小時得固定化凝膠顆粒，用無菌水將固定化凝膠顆粒水洗后獲得固定化生香酵母；
采用1.5 g海藻酸鈉加入有50 mL蒸餾水的250 mL三角瓶中，加熱溶解后冷卻，取4mL對數(shù)期生香酵母菌液加入三角瓶中混合均勻，混合液通過注射器注入2%重量百分比濃度的氯化鈣水溶液中，制備成凝膠球顆粒然后放入4°C冰箱中固化4 h，用無菌水將固定化凝膠顆粒洗三次得固定化生香酵母。(3)、對固定化生香酵母在乙醇馴化培養(yǎng)基(乙醇馴化培養(yǎng)基由乙醇與YPD液體培養(yǎng)基混合組成，以下乙醇的百分比均為體積百分比)中進行耐高溫耐乙醇的循環(huán)梯度馴化(如圖1所示)，具體步驟如下:
預培養(yǎng):將固定化生香酵母置于YPD液體培養(yǎng)基中(即0%乙醇)，30 °C培養(yǎng)48小時，然后按以下步驟進行:
1、在無菌狀態(tài)下，將預培養(yǎng)后固定化生香酵母轉移到2%乙醇馴化培養(yǎng)基(即乙醇含量2%)中，30°C培養(yǎng)48小時: 2、將固定化生香酵母轉移到2%乙醇馴化培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)48小時；
3、將固定化生香酵母轉移到4%乙醇馴化培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)48小時；
4、將固定化生香酵母轉移到4%乙醇馴化培養(yǎng)基中，34°C培養(yǎng)48小時；
5、將固定化生香酵母轉移到6%乙醇馴化培養(yǎng)基中，34°C培養(yǎng)48小時；
6、將固定化生香酵母轉移到6%乙醇馴化培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)48小時；
7、將固定化生香酵母轉移到8%乙醇馴化培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)48小時；
8、將固定化生香酵母轉移到8%乙醇馴化培養(yǎng)基中，38°C培養(yǎng)48小時；
9、將固定化生香酵母轉移到10%乙醇馴化培養(yǎng)基中，38°C培養(yǎng)48小時；
10、將固定化生香酵母轉移到10%乙醇馴化培養(yǎng)基中，40°C培養(yǎng)48小時；
11、將固定化生香酵母轉移到12%乙醇馴化培養(yǎng)基中，40°C培養(yǎng)48小時；
12、將固定化生香酵母轉移到12%乙醇馴化培養(yǎng)基中，42°C培養(yǎng)48小時；
循環(huán)回到步驟1，依次反復培養(yǎng)3個循環(huán)，最后獲得耐高溫耐乙醇的生香酵母。通過本發(fā)明的方法得到耐高溫耐乙醇的生香酵母:耐溫度范圍為36°C -40°C，耐乙醇濃度范圍為5%-9% ;且總酯含量和聞香結果與馴化之前保持穩(wěn)定。實施例2
生香酵母曲購自山東梁山徐家制曲廠，本實施例與實施例1的不同之處在于對固定化生香酵母在乙醇馴化培養(yǎng)基中進行耐高溫耐乙醇的循環(huán)梯度馴化參數(shù):
預培養(yǎng):將固定化生香酵母置于YPD液體培養(yǎng)基中(即0%乙醇)，30 °C培養(yǎng)42小時，然后按以下步驟進行:
1、在無菌狀態(tài)下，將預培養(yǎng)后固定化生香酵母轉移到3%乙醇馴化培養(yǎng)基(即乙醇含量2%)中，30°C培養(yǎng)42小時:
2、將固定化生香酵母轉移到3%乙醇馴化培養(yǎng)基中，33°C培養(yǎng)42小時；
3、將固定化生香酵母轉移到6%乙醇馴化培養(yǎng)基中，33°C培養(yǎng)42小時；
4、將固定化生香酵母轉移到6%乙醇馴化培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)42小時；
5、將固定化生香酵母轉移到9%乙醇馴化培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)42小時；
6、將固定化生香酵母轉移到9%乙醇馴化培養(yǎng)基中，39°C培養(yǎng)42小時；
7、將固定化生香酵母轉移到12%乙醇馴化培養(yǎng)基中，39°C培養(yǎng)42小時；
8、將固定化生香酵母轉移到12%乙醇馴化培養(yǎng)基中，42°C培養(yǎng)42小時；
循環(huán)回到步驟1，依次 反復培養(yǎng)5個循環(huán)，最后獲得耐高溫耐乙醇的生香酵母。通過本發(fā)明的方法得到耐高溫耐乙醇的生香酵母:耐溫度范圍為36°C -40°C，耐乙醇濃度范圍為5%-9% ;且總酯含量和聞香結果與馴化之前保持穩(wěn)定。實施例3
生香酵母曲購自濟南久益生物工程有限公司，方法與實施例1相同。最終得到耐高溫耐乙醇的生香酵母:耐溫度范圍為36°C _40°C，耐乙醇濃度范圍為5%-9% ;且總酯含量和聞香結果與馴化之前保持穩(wěn)定。本發(fā)明權利要求所給出的范圍均是可以實施的，其結果與實施例1-3類似，在此不作贅述。以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。
權利要求
1.一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法，其特征在于:所述的馴化方法步驟如下: (1)、以總酯含量和聞香為指標，同時兼顧酒精度，從市售的生香酵母中篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株； (2)、將步驟(I)篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株接入麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，獲得對數(shù)期生香酵母菌液，將對數(shù)期生香酵母菌液與海藻酸鈉水溶液在室溫無菌狀態(tài)下混合均勻，再將混合液加入到氯化鈣水溶液中制備成凝膠球顆粒，然后在2-4°C下固化4-5小時得固定化凝膠顆粒，用無菌水將固定化凝膠顆粒水洗后獲得固定化生香酵母； (3)、對固定化生香 酵母在乙醇馴化培養(yǎng)基中進行耐高溫耐乙醇的循環(huán)梯度馴化，具體設置參數(shù)為:循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度范圍為:最低濃度為1%-5%，最高濃度為10%-15%;循環(huán)梯度馴化的溫度范圍為:最低溫度為28-32 °C，最高溫度為40-45 V ;每個梯度采用乙醇體積百分比濃度的梯度增幅1%_3%及采用溫度梯度增幅0.5°C -30C ;循環(huán)馴化多次，最后得到耐高溫耐乙醇的生香酵母。
2.根據(jù)權利要求1所述的馴化方法，其特征在于:步驟(I)具體為:將市售的生香酵母純化培養(yǎng)后在30°C下用麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)7天得發(fā)酵液，以國標GB/T 10345-2007為標準，聞香并測定發(fā)酵液酒精度、總酯，達標的酵母菌株即為生香優(yōu)良的酵母菌株。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的馴化方法，其特征在于:步驟(2)中凝膠球顆粒的具體制備方法為:采用1.0-3.0 g海藻酸鈉加入有50 mL蒸餾水的250 mL三角瓶中，加熱溶解后冷卻，取3-5 mL對數(shù)期生香酵母菌液加入三角瓶中混合均勻，混合液通過注射器注入1-3%重量百分比濃度的氯化鈣水溶液中，制備成凝膠球顆粒。
4.根據(jù)權利要求3所述的馴化方法，其特征在于:所述凝膠球顆粒的直徑為2-3mm。
5.根據(jù)權利要求1所述的馴化方法，其特征在于:步驟(3)中循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度范圍為:最低濃度為1%_3%，最高濃度為10%-12%;循環(huán)梯度馴化的溫度范圍為:最低溫度為28-30°C，最高溫度為40-42°C。
6.根據(jù)權利要求5所述的馴化方法，其特征在于:循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度梯度具體為:2%、4%、6%、8%、10%、12%，循環(huán)梯度馴化的溫度梯度具體為:30。。、32。。、34。。、36。。、38。。、40。。、42。。。
7.根據(jù)權利要求1或5或6所述的馴化方法，其特征在于:步驟(3)中循環(huán)馴化次數(shù)為2-5 次。
8.根據(jù)權利要求1或5或6所述的馴化方法，其特征在于:步驟(3)中每個梯度的馴化時間為24-72小時。
9.根據(jù)權利要求8所述的馴化方法，其特征在于:每個梯度的馴化時間為40-48小時。
10.根據(jù)權利要求1或2或5或6所述的馴化方法，其特征在于:乙醇馴化培養(yǎng)基由乙醇與YPD液體培養(yǎng)基混合組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，提供了一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法。本發(fā)明步驟為(1)從市售的生香酵母中篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株；(2)將對數(shù)期生香酵母菌液與海藻酸鈉水溶液在室溫無菌狀態(tài)下混合均勻，再將混合液加入到氯化鈣水溶液中制備成凝膠球顆粒，然后在2-4℃下固化4-5小時得固定化凝膠顆粒；(3)對固定化生香酵母在乙醇馴化培養(yǎng)基中進行耐高溫耐乙醇的循環(huán)梯度馴化，循環(huán)馴化多次，最后得到耐高溫耐乙醇的生香酵母。本發(fā)明選用循環(huán)梯度馴化法，操作簡單、方便，可以篩選出耐高溫耐乙醇的酵母菌株，解決了芝蘭香型白酒生產(chǎn)中生香酵母的耐高溫、耐乙醇性能差的缺陷，提高了發(fā)酵能力。
文檔編號C12R1/865GK103205368SQ20131000485
公開日2013年7月17日 申請日期2013年1月8日 優(yōu)先權日2013年1月8日
發(fā)明者俞建午, 李小兵, 朱增亮, 錢淑芳 申請人:浙江省致中和生物健康食品研究院