一種篩選rip3蛋白激酶抑制劑的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒，其包括盒體（1），襯墊（2），裝有RIP3蛋白激酶的試管（3），裝有髓鞘堿性蛋白的試管（4），裝有ATP的試管（5），裝有反應(yīng)緩沖液的試管（6），裝有熒光素的試管（7）和裝有熒光素酶的試管（8），所述的襯墊（2）設(shè)置于盒體（1）內(nèi)，襯墊（2）上設(shè)有容器孔，所述的裝有RIP3蛋白激酶的試管（3），裝有髓鞘堿性蛋白的試管（4），裝有ATP的試管（5），裝有反應(yīng)緩沖液的試管（6），裝有熒光素的試管（7），和裝有熒光素酶的試管（8），該試劑盒使用方法簡便，檢測特異性高。
【專利說明】一種篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]受體相互作用蛋白家族(receptor-1nteracting proteins, RIPs)是蛋白激酶家族的一個重要分支，其功能上具有特異的絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)激酶活性，屬于Ser/Thr蛋白激酶家族。目前用于蛋白激酶活性檢測的方法主要包括以下幾類:
[0003]1.基于抗原抗體原理的ELISA方法，通過用蛋白激酶底物包被多孔板板底，加入激酶及反應(yīng)液反應(yīng)后，分別用針對磷酸化底物的抗體(一抗)以及針對一抗的抗體(二抗)進(jìn)行孵育，通過化學(xué)發(fā)光等方式檢測激酶催化底物磷酸化的程度，從而評價其活性并用于抑制劑篩選。但受蛋白純化程度以及底物自身磷酸化影響，無法排除非特異性磷酸化的干擾，影響激酶活性檢測和抑制劑活性檢測的準(zhǔn)確性。此外該方法價格昂貴、耗時長、操作步驟多，制約了化合物的高通量篩選。
[0004]2.放射性同位素標(biāo)記法，蛋白激酶可催化P32標(biāo)記的ATP反應(yīng)從而將P32基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物對其進(jìn)行標(biāo)記，通過放射自顯影檢測底物被P32標(biāo)記的程度評價酶活及抑制劑對酶促反應(yīng)的抑制程度。該方法特異性程度高，但缺點(diǎn)顯著，包括對研究場所有嚴(yán)格限制，易造成環(huán)境污染，對研究者健康有潛在危害，且難以實(shí)現(xiàn)抑制劑的高通量篩選。
[0005]該方法是目前用于RIP3 (受體相互作用蛋白-3)酶活檢測及抑制劑篩選的唯一方法。具體方法為從Jurkat細(xì)胞裂解液中用免疫沉淀法得到RIP3蛋白，在反應(yīng)液中和10 μ Ci [32P] y -ATP和5 μ g MBP在30°C孵育30分鐘，隨后進(jìn)行放射自顯影。反應(yīng)液成分為:20mM HEPES[pH7.5],2mM DTT,ImM NaF,ImM Na3VO4,20mMβ -glycerophosphate,20mMMgCl2, 20mMMnCl2, ImM EDTA, 300 μ M ATP。
[0006]3.ATP消耗法，該方法主要包括兩步反應(yīng)，第一步反應(yīng)是RIP3利用體系中的ATP將其底物磷酸化，將ATP轉(zhuǎn)化為ADP ;第二步反應(yīng)是試劑盒中的熒光素酶在存在O2和Mg2+的情況下利用體系中酶促反應(yīng)之后剩余的ATP將甲殼蟲熒光素氧化并將ATP轉(zhuǎn)化為AMP同時發(fā)出熒光。該檢測方法的作用原理為:將一定量的酶與底物置于反應(yīng)緩沖液中，通過加入ATP啟動酶促反應(yīng)發(fā)生，待反應(yīng)結(jié)束后，終止反應(yīng)并用熒光素酶催化體系中剩余的ATP與熒光素反應(yīng)從而釋放熒光。在一定范圍內(nèi)酶促反應(yīng)后ATP剩余量與熒光強(qiáng)度成線性正相關(guān)，而RIP3催化的酶促反應(yīng)程度又與ATP剩余量成線性負(fù)相關(guān)。若熒光強(qiáng)度高，表明體系中剩余的ATP較多，即表明酶促反應(yīng)消耗掉的ATP較少，酶促反應(yīng)程度較弱。反之，若熒光強(qiáng)度低，表明體系中剩余的ATP較少，即表明酶促反應(yīng)消耗ATP多，酶促反應(yīng)程度較強(qiáng)。因而熒光強(qiáng)度與酶促反應(yīng)成線性負(fù)相關(guān)，可通過檢測熒光強(qiáng)度來評價酶促反應(yīng)的程度。但由于蛋白純化過程中無法避免的會有非特異性蛋白殘留，會在酶促反應(yīng)中引入非特異性的ATP消耗，影響激酶活性檢測和抑制劑活性檢測的準(zhǔn)確性和精確性。
[0007]ATP消耗法被用于多種激酶檢測，但目前針對RIP3蛋白(受體相互作用蛋白-3)仍有以下問題未解決:1.RIP3蛋白屬于RIP蛋白家族，為絲蘇氨酸激酶，與其它家族絲蘇氨酸激酶相比，一級結(jié)構(gòu)具有顯著差異，并且目前晶體結(jié)構(gòu)未知。除放射性同位素法外，至今尚無其它酶活檢測方法報道；2.ATP消耗法方法本身存在一定局限性，如蛋白純化過程中無法避免的會有非特異性蛋白殘留，會在酶促反應(yīng)中引入非特異性的ATP消耗，此外包括底物濃度、ATP濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等因素，均會影響目標(biāo)蛋白酶活，因而無法直接用于抑制劑篩選；3.目前尚未發(fā)現(xiàn)針對RIP3的抑制劑，無陽性化合物能被用來對該體系進(jìn)行校正優(yōu)化以滿足抑制劑檢出度的要求和反應(yīng)高信噪比的要求。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0008]因此，本實(shí)用新型要解決的技術(shù)問題是針對目前RIP3蛋白激酶抑制劑篩選方法較為局限的問題，提供了一種特異性高，使用方法簡便的篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒。
[0009]本實(shí)用新型是通過下述技術(shù)方案來解決上述技術(shù)問題:
[0010]一種篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒，其包括盒體，襯墊，裝有RIP3蛋白激酶的試管，裝有髓鞘堿性蛋白的試管，裝有ATP的試管，裝有反應(yīng)緩沖液的試管，裝有熒光素的試管和裝有熒光素酶的試管，所述的襯墊設(shè)置于盒體內(nèi)，襯墊上設(shè)有容器孔，所述的裝有RIP3蛋白激酶的試管，裝有髓鞘堿性蛋白的試管，裝有ATP的試管，裝有反應(yīng)緩沖液的試管，裝有熒光素的試管和裝有熒光素酶的試管放置于容器孔內(nèi)。
[0011]其中所述 襯墊上的容器孔較佳地有6個，每個容器孔內(nèi)分別放置裝有RIP3蛋白激酶的試管，裝有髓鞘堿性蛋白的試管，裝有ATP的試管，裝有反應(yīng)緩沖液的試管，裝有熒光素的試管，和裝有熒光素酶的試管。所述襯墊上的容器孔的排列方式較佳地為平行排列，或者為環(huán)狀排列。
[0012]其中所述反應(yīng)緩沖液組分為:3_(N-嗎啉基)丙磺酸10mM，MgCl25mM, MnCl22.5mM,EDTA0.4mM, EGTAlmM, β -丙三醇-磷酸鹽2.5mM, 二硫蘇糖醇0.05mM,所述反應(yīng)緩沖液pH值為7.0。
[0013]所述RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒的使用方法為:在上述反應(yīng)緩沖液中加入髓鞘堿性蛋白，RIP3蛋白激酶和待測RIP3蛋白激酶抑制劑，之后加入ATP，從而配制成反應(yīng)體系溶液，該反應(yīng)體系溶液中髓鞘堿性蛋白濃度為15ng/l.! I~30ng/l.! 1，RIP3蛋白激酶濃度為5U/y 1，ATP濃度為IOyM~20μΜ，震蕩或靜置條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20°C~30°C，反應(yīng)時間為60~90分鐘。檢測所得反應(yīng)體系溶液的發(fā)光值，確定ATP的濃度，根據(jù)ATP的濃度計算待測RIP3蛋白激酶抑制劑的抑制率。所述發(fā)光值的檢測方法較佳地為:利用各種市售熒光檢測試劑盒檢測，所述熒光檢測試劑盒較佳地為Promega公司的Kinase-Glo熒光檢測試劑盒，發(fā)光值的檢測方法具體請參見該試劑盒的說明書內(nèi)容。
[0014]本實(shí)用新型所述篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒的保藏條件較佳地為_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0015]本實(shí)用新型中，上述優(yōu)選條件在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上可任意組合，即得本實(shí)用新型各較佳實(shí)施例。
[0016]本實(shí)用新型的積極進(jìn)步效果在于:本實(shí)用新型提供的篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒通過優(yōu)化設(shè)計檢測反應(yīng)條件，克服了普通RIP3蛋白激酶抑制劑的篩選方法步驟復(fù)雜，假陽性率高的缺陷，不僅保證了篩選反應(yīng)的高靈敏性，而且使篩選反應(yīng)的特異性大大提高。與放射性同位素法相比，所述試劑盒具有顯而易見的無污染性和高安全性，該篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒設(shè)計合理，檢測操作方便而且節(jié)約成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為一種篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒的結(jié)構(gòu)不意圖。
[0018]圖2為一種篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒的結(jié)構(gòu)不意圖。
[0019]圖3為所述篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒檢測不同化合物對RIP3蛋白激酶抑制作用的結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面舉出較佳實(shí)施例，并結(jié)合附圖來更清楚完整地說明本實(shí)用新型，但并不因此將本實(shí)用新型限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。所述的室溫為本領(lǐng)域常規(guī)的室溫溫度，較佳地為20?40°C。
[0021]實(shí)施例1 一種篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒
[0022]結(jié)合圖1，本實(shí)用新型所述篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒包括:盒體1，襯墊2，裝有RIP3蛋白激酶的試管3，裝有髓鞘堿性蛋白的試管4，裝有ATP的試管5，裝有反應(yīng)緩沖液的試管6,裝有熒光素的試管7,和裝有熒光素酶的試管8。
[0023]其中所述的襯墊2設(shè)置于盒體I內(nèi)，襯墊2上設(shè)有6個容器孔，所述的容器孔在襯墊2上分成兩排平行排列。所述的裝有RIP3蛋白激酶的試管3，裝有髓鞘堿性蛋白的試管
4,裝有ATP的試管5,裝有反應(yīng)緩沖液的試管6,裝有熒光素的試管7和裝有熒光素酶的試管8放置于容器孔內(nèi)。
[0024]其中所述反應(yīng)緩沖液組分為:3_(N-嗎啉基)丙磺酸10mM，MgCl25mM, MnCl22.5mM,EDTA0.4mM, EGTAlmM, β -丙三醇-磷酸鹽2.5mM, 二硫蘇糖醇0.05mM,所述反應(yīng)緩沖液的pH值為7.0。
[0025]本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0026]實(shí)施例2 —種篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒
[0027]結(jié)合圖2，本實(shí)用新型所述篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒包括:盒體1，襯墊2，裝有RIP3蛋白激酶的試管3，裝有髓鞘堿性蛋白的試管4，裝有ATP的試管5，裝有反應(yīng)緩沖液的試管6,裝有熒光素的試管7,和裝有熒光素酶的試管8。
[0028]其中所述的襯墊2設(shè)置于盒體I內(nèi)，所述襯墊2為圓形結(jié)構(gòu)，該襯墊2上設(shè)有6個容器孔，所述的容器孔在襯墊2上為環(huán)狀排列。所述的裝有RIP3蛋白激酶的試管3，裝有髓鞘堿性蛋白的試管4,裝有ATP的試管5,裝有反應(yīng)緩沖液的試管6,裝有熒光素的試管7和裝有熒光素酶的試管8放置于容器孔內(nèi)。
[0029]其中所述反應(yīng)緩沖液組分為:3_(N-嗎啉基)丙磺酸10mM，MgCl25mM, MnCl22.5mM,EDTA0.4mM, EGTAlmM, β -丙三醇-磷酸鹽2.5mM, 二硫蘇糖醇0.05mM,所述反應(yīng)緩沖液的pH值為7.0。本試劑盒保存于_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0030]實(shí)施例3RIP3抑制劑的篩選[0031]采用實(shí)施例1所述篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒，在反應(yīng)緩沖液中加入RIP3蛋白激酶，底物髓鞘堿性蛋白(MBP)，待測蛋白激酶抑制劑和ATP，從而配制成反應(yīng)體系溶液，所得反應(yīng)體系溶液的PH值為6.8，其中RIP3蛋白激酶的濃度為5U/y 1，反應(yīng)體系溶液體積為10 μ 1，MBP的濃度為25ng/l.! 1，ATP濃度為10 μ M，搖床震蕩速度為100rpm，25°C反應(yīng) 75min。
[0032]用不同濃度索拉菲尼(索拉菲尼濃度分別為:0.80μΜ，4μΜ，20μΙ^Ρ 100 μ Μ)、舒尼替尼(舒尼替尼濃度分別為:0.80μΜ，4μΜ，20μΜ和100 μ Μ)和威羅菲尼(Vemuraf enib，其濃度分別為:0.80μΜ，4μΜ，20μΜ和100 μ Μ)分別加入反應(yīng)體系溶液，上述三種化合物均購買自Selleck Chemicals公司。反應(yīng)結(jié)束后與未加藥反應(yīng)組相比較,抑制率％=(空白組特異性反應(yīng)率-加藥組特異性反應(yīng)率)/空白組特異性反應(yīng)率X 100%ο上述反應(yīng)體系反應(yīng)進(jìn)行75min后,加入熒光素和熒光素酶,檢測反應(yīng)體系溶液的熒光值,檢測結(jié)果如圖3所示。其中所述檢測反應(yīng)體系溶液的熒光值的方法請參考Kinase-Glo?試劑盒的說明書(Promega公司，貨號:V6711)。檢測結(jié)果顯示索拉菲尼具有出濃度依賴的抑制活性，表明該化合物具有RIP3蛋白激酶抑制陽性作用，其半數(shù)抑制濃度約為20 μ M ；Vemurafenib在100 μ M濃度下抑制率約為90%，其半數(shù)抑制濃度約為2.4μΜ;舒尼替尼在100 μ M濃度下抑制率不足5%，顯示出陰性作用。目前尚未發(fā)現(xiàn)RIP3抑制劑，因此利用本實(shí)用新型的篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒，首次發(fā)現(xiàn)多祀點(diǎn)抑制劑索拉菲尼和威羅菲尼(Vemurafenib)分子具有RIP3蛋白激酶抑制活性，而多靶點(diǎn)抑制劑舒尼替尼未能產(chǎn)生抑制作用，表明所述篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒具有選擇性和特異性。
[0033] 雖然以上描述了本實(shí)用新型的【具體實(shí)施方式】，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些僅是舉例說明，本實(shí)用新型的保護(hù)范圍是由所附權(quán)利要求書限定的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本實(shí)用新型的原理和實(shí)質(zhì)的前提下，可以對這些實(shí)施方式做出多種變更或修改，但這些變更和修改均落入本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒，其特征在于，其包括盒體(1)，襯墊(2)，裝有RIP3蛋白激酶的試管(3)，裝有髓鞘堿性蛋白的試管(4)，裝有ATP的試管(5)，裝有反應(yīng)緩沖液的試管(6),裝有熒光素的試管(7)和裝有熒光素酶的試管(8),所述的襯墊(2)設(shè)置于盒體(I)內(nèi)，襯墊(2)上設(shè)有容器孔，所述的裝有RIP3蛋白激酶的試管(3)，裝有髓鞘堿性蛋白的試管(4),裝有ATP的試管(5),裝有反應(yīng)緩沖液的試管(6),裝有熒光素的試管(7)和裝有熒光素酶的試管(8)放置于容器孔內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒，其特征在于，所述襯墊(2)上的容器孔有6個，每個容器孔內(nèi)分別放置裝有RIP3蛋白激酶的試管(3)，裝有髓鞘堿性蛋白的試管(4),裝有ATP的試管(5),裝有反應(yīng)緩沖液的試管(6),裝有熒光素的試管(7)和裝有熒光素酶的試管(8)。
3.如權(quán)利要求2所述的篩選RIP3蛋白激酶抑制劑的試劑盒，其特征在于，所述襯墊(2)上的容器孔為平行排列或環(huán)狀排列。
【文檔編號】C12M1/40GK203530326SQ201320582532
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】魏世英, 匡海門, 其他發(fā)明人請求不公開姓名 申請人:匡海門