一種副雞嗜血桿菌pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種試劑盒，更具體的講是一種副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括20μL的PCR緩沖液、25μL超純水、5μLMarkerDL2000，3μL15pmol/μL上引物，3μL濃度為15pmol/μL的下引物，3μL聚合酶，3μL溴酚藍，15μL的TE緩沖液，5μL陰性對照，5μL陽性對照，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明擁有PCR檢測技術的檢測快的優(yōu)點，而且本試劑盒造價低、采用了特殊的引物，可以滿足最低為0.00953ng基因片段PCR產物的檢測，檢測靈敏性高。
【專利說明】—種副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種試劑盒，更具體的講是一種副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]雞傳染性鼻炎(Infectious coryza, IC)是由副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagal I inarum, HPG)引起的一種上呼吸道疾病，最明顯的癥狀是鼻道和鼻竇有漿液性或黏液性分泌物流出、面部水腫和結膜炎，肉垂出現(xiàn)明顯腫脹[I]。該菌有A、B、C 3個血清型，主要引起育成雞生長不良，產蛋雞產蛋率下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成很大的經濟損失[2]。目前診斷雞傳染性鼻炎的方法主要用傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)和生化鑒定副雞嗜血桿菌，由于副雞嗜血桿菌對營養(yǎng)要求高，不易培養(yǎng)，而且該菌常常與其它細菌混合感染，無法快速鑒別診斷，因此應用特異、快速、敏感的聚合酶鏈反應(PCR)檢測副雞嗜血桿菌技術就顯得非常重要，但是目前市場上并沒有用于檢測副雞嗜血桿菌的試劑盒，這是現(xiàn)有技術中的不足。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種快速、準確、簡便的副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒。
[0004]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
一種副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括20 μ L的PCR緩沖液、25 μ L 超純水、5 μ LMarker DL2000，3 μ L15pmol/μ L上引物，3 μ L濃度為 15pmol/y L的下引物，3 μ L聚合酶，3 μ L溴酚藍，15 μ L的TE緩沖液，5 μ L陰性對照，5 μ L陽性對照。
[0005]上述PCR 緩沖液由 25 mmol/L MgCl2 2 μ L, 10XPCR buffer 5 μ L, IOmmoI/LdNTPx2y L0
[0006]上述上引物的序列號為V -CCGCATAGAARRRRAAGA-3 '，下引物的序列號為5' -CCAACCTTCCTCACCACC-3'。
[0007]上述陰性對照為非副雞嗜血桿菌的DNA片段。
[0008]上述陽性對照為標準副雞嗜血桿菌的PCR產物。
[0009]上述上引物中R為簡并引物。
[0010]反應步驟:第一步50 min 50°C, 1個循環(huán)；第二步94°C 3 min, 1個循環(huán)；第三步940C 1 min,52°C 1 min,72°C 2 min，35 個循環(huán)，第四步 72°C延伸 7min，1 個循環(huán)
取5 μ L上述反應產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，以Marker DL2000作為參考，TAE緩沖液為電泳緩沖液，以5V/cm電泳lh，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果；
回收目的條帶，16°C 1.5 h連接至PMD19-T Easy Vector，轉化感受態(tài)DH5 α，均勻涂布于含Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)16h，挑取白色菌落小量培養(yǎng)，提取質粒作PCR擴增鑒定，將陽性菌液測序，并采用非副雞嗜血桿菌DNA片段作為陰性對照，標準副雞嗜血桿菌DNA片段作為陽性對照。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明擁有PCR檢測技術的檢測快的優(yōu)點，而且本試劑盒造價低、采用了特殊的引物，可以滿足最低為0.00953ng基因片段PCR產物的檢測，檢測靈
敏性高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明敏感性實驗結果圖；
1-95.3ng基因片段PCR產物，2-9.53 ng基因片段PCR產物，3-0.953ng基因片段PCR產物，4-0.0953ng基因片段PCR產物，5-0.00953ng基因片段PCR產物。
[0013]圖2為本發(fā)明電泳實驗結果圖
1-Marker DL2000, 2-PCR 產物(650bp)，3-標準菌株 PCR 產物(650bp)，4-陰性對照。
【具體實施方式】
[0014]下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，以便本領域技術人員可以更好的了解本發(fā)明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0015]實施例1
一種副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括20 μ L的PCR緩沖液、25 μ L 超純水、5 μ LMarker DL2000，3 μ L15pmol/μ L 上引物，3 μ L濃度為 15pmol/y L的下引物，3 μ L聚合酶， 3 μ L溴酚藍，15 μ L的TE緩沖液，5 μ L陰性對照，5 μ L陽性對照。
[0016]上述PCR 緩沖液由 25 mmol/L MgCl2 2 μ L, 10XPCR buffer 5 μ L, IOmmoI/LdNTPx2y L0
[0017]上述上引物的序列號為V -CCGCATAGAARRRRAAGA-3 '，下引物的序列號為5' -CCAACCTTCCTCACCACC-3'。
[0018]上述陰性對照為非副雞嗜血桿菌的DNA片段。
[0019]上述陽性對照為標準副雞嗜血桿菌的PCR產物。
[0020]上述上引物中R為簡并引物。
【權利要求】
1.一種副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括20 μ L的PCR緩沖液、25 μ L 超純水、5 μ LMarker DL2000，3 μ L15pmol/μ L 上引物，3 μ L 濃度為 15pmol/y L的下引物，3 μ L聚合酶，3 μ L溴酚藍，15 μ L的TE緩沖液，5 μ L陰性對照，5 μ L陽性對照。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述PCR緩沖液由 25 mmol/L MgCl2 2 μ L, 10XPCR buffer 5 μ L, 10mmol/L dNTPx2y L0
3.根據(jù)權利要求1所述的一種副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述上引物的序列號為5 ' -CCGCATAGAARRRRAAGA-3 '，下引物的序列號為5' -CCAACCTTCCTCACCACC-3'。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述陰性對照為非副雞嗜血桿菌的DNA片段。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述陽性對照為標準副雞嗜血桿菌的PCR產物。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種副雞嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述上引物中R為簡并 引物。
【文檔編號】C12Q1/04GK103667511SQ201310742906
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權日:2013年12月30日
【發(fā)明者】郎景民, 馬景霞, 吳洪才, 楊平, 郭顯坡 申請人:山東濱州博萊威生物技術有限公司