人類多巴胺d2受體基因型檢測芯片及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明人類多巴胺2型受體基因型檢測芯片，包括固相支持物和固定在其上的寡核苷酸探針，所述探針包含以下序列或其互補(bǔ)序列中的包含DRD2_-141Cins/del（rs1799732）、DRD2_957C>T(rs6277)、DRD2_T>C（rs6275）、DRD2_A>G(rs1079727)、DRD2_C>T(rs4648317)、DRD2TaqIA_G>A(rs1800497)、DRD2_TaqIBG>A(rs1079597)、DRD2TaqID_C>T(rs1800498)突變位點(diǎn)在內(nèi)的14-20個(gè)連續(xù)核苷酸。本發(fā)明芯片檢測靈敏度率大于96%，特異度率大于98%。
【專利說明】人類多巴胺D2受體基因型檢測芯片及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物或酶，屬于基因分析檢測產(chǎn)品的基因檢測芯片，具體是指一種適用于檢測人類多巴胺2型受體基因型的基因檢測芯片以及檢測人類多巴胺2型受體基因型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多巴胺受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，控制運(yùn)動(dòng)功能、情緒、內(nèi)分泌生理系統(tǒng)。多巴胺受體與某些神經(jīng)精神病(如藥物依賴、帕金森病、精神分裂癥、狂躁、抑郁癥等)、腎病、心血管疾病有關(guān)。
[0003]多巴胺作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要參與運(yùn)動(dòng)、情感以及神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)。目前已分離出五種多巴胺受體(DA2R)，根據(jù)它們的生物化學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，可分為D1類和D2類受體。D1類受體包括D1和D5受體(在大鼠也稱D1A和DIB受體)。D2類受體包括D2，D3和D4受體。兩類受體的C端含有磷酸化和棕櫚?；稽c(diǎn)，涉及激動(dòng)劑依賴性受體的去敏感化過程和第四胞內(nèi)環(huán)的形成多巴胺的配體化合物很容易將D1受體和D2受體家族區(qū)分開來，但大多數(shù)化合物不能區(qū)分相同家族的受體亞型。20世紀(jì)90年代以來分子生物學(xué)以及基因遺傳學(xué)迅速發(fā)展，推動(dòng)了腦內(nèi)多巴胺受體(dopamine receptor,DR)的分子克隆、DR亞型結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究。隨著對(duì)多巴胺受體亞型研究的不斷深入，為多巴胺受體基因多態(tài)性與神經(jīng)性精神病的相關(guān)性提供了越來越多的證據(jù)，相關(guān)的研究主要集中在多巴胺受體D2家族。具體來說，人類多巴胺D2受體在人群中存在不同的基因型(即基因多態(tài)性)，而基因型不同人類多巴胺二型受體對(duì)不同的精神藥物作用明顯不同，最終導(dǎo)致基因型不同的精神病患者 對(duì)同一精神藥物的藥效存在差異。因此檢測人類多巴胺D2受體的基因型方法的研究是學(xué)界研究熱點(diǎn)。但目前測定類多巴胺D2受體的基因型的方法主要是采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、手工或自動(dòng)順序、序列特異性引物PCR等方法，這些方法不僅操作繁瑣，檢測周期長，而且影響檢測結(jié)果的因素多，不易控制，難以滿足實(shí)際應(yīng)用的要求，使科研單位和臨床上至今還無法廣泛開展有關(guān)類多巴胺2型受體的基因型的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)目前測定類多巴胺二型受體的基因型的方法存在的問題和不足，提供一種用于檢測類多巴胺二型受體的基因型的基因檢測芯片以及用基因檢測芯片檢測類多巴胺二型受體的基因型的檢測方法。本發(fā)明提供的人類多巴胺2型受體基因型檢測芯片，包括固相支持物和有序固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包含以下序列或其互補(bǔ)序列中的包含DRD2_-141Cins/del(rsl799732)、DRD2_957C>T(rs6277)、DRD2_T>C (rs6275)、DRD2 A>G(rs!079727)、DRD2_C>T(rs4648317)、DRD2Taa IA G>A(rsl800497)、DRD2 Tag IB G>A(rs!079597)、DRD2TaaIDC>T(rsl800498)[0005]突變位點(diǎn)在內(nèi)的14-20個(gè)連續(xù)核苷酸。[0006]DRD2_-141Cins/del(rsl799732):ggcggaatcccccaacccctcctacccgttCcaggccggggatcgccgaggaggtacagct (SEQ ID NO:1)
[0007]DRD2—_141Cins/del(rs!799732):ggcggaatcccccaacccctcctacccgtt[-]caggccggggatcgccgaggaggtacagct (SEQ ID NO:2)
[0008]DRD2—957C>T(rs6277):cccgtcccaccatggtctccacagcactccCgacagccccgccaaaccagagaagaatg gg (SEQ ID NO:3)
[0009]DRD2—957C>T(rs6277):cccgtcccaccatggtctccacagcactccTgacagccccgccaaaccagagaagaatg gg (SEQ ID NO:4)
[0010]DRD2—T>C (rs6275):ccagctgactctccccgacccgtcccaccaTggtctccacagcactcccgacagccccgcc (SEQ ID NO:5)
[0011]DRD2—T>C (rs6275):ccagctgactctccccgacccgtcccaccaCggtctccacagcactcccgacagccccgcc (SEQ ID NO:6)
[0012]DRD2—A>G(rs!079727):tctctgtgatgaatgggtgccaaatacacaAatacagaatctaagaaaacacatggggtta (SEQ ID NO:7)
[0013]DRD2—A>G(rs!079727):tctctgtgatgaatgggtgccaaatacacaGatacagaatctaagaaaacacatggggtta (SEQ ID NO:8)
[0014]DRD2—C>T(rs4648317):cctccctgagtgcacaggatgctggagcctCccagtttctctggctttcatctcgtcttca (SEQ ID NO:9)
[0015]DRD2—C>T(rs4648317):cctccctgagtgcacaggatgctggagcctTccagtttctctggctttcatctcgtcttca (SEQ ID NO:10)
[0016]DRD2Taq IA—G>A(rsl800497):ggcaacacagccatcctcaaagtgctggtcGaggcaggcgcccagctggacgtccag gatg (SEQ ID NO:11)
[0017]DRD2Taq IA_G>A(rsl800497):ggcaacacagccatcctcaaagtgctggtcAaggcaggcgcccagctggacgtccag gatg (SEQ ID NO: 12)
[0018]DRD2—Taq IB G>A(rsl079597):tctccacagtgctgtcagaatcacctattcGaaaggcgaatctgatcatgtggtt cctgct (SEQ ID NO:13)
[0019]DRD2—Taq IB G>A(rsl079597):tctccacagtgctgtcagaatcacctattcAaaaggcgaatctgatcatgtggtt cctgct (SEQ ID NO:14)
[0020]DRD2TaqID_C>T(rsl800498):ctgggggtgtgaagaaaagagccttgggttCgactagggaacctggggccact ccttcctc (SEQ ID NO:15)
[0021]DRD2TaqID_C>T(rsl800498):ctgggggtgtgaagaaaagagccttgggttTgactagggaacctggggccact ccttcctc (SEQ ID N0:16)。
[0022]為了增強(qiáng)檢測信號(hào)的強(qiáng)度，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率，所述DRD2—-HICins/del(rsl799732)、DRD2—957C>T(rs6277)、DRD2—T>C (rs6275)、DRD2 A>G(rsl079727)、DRD2—C>T(rs4648317)、DRD2Taa IA G>A(rsl800497)、DRD2 Tag IB G>A(rs!079597)、DRD2TaaIDC>T(rsl800498)突變位點(diǎn)序列中大寫字母表示的堿基最好位于所述探針的中部。
[0023]所述寡核苷酸探針還可以在其5’端包含一段氨基修飾的16聚的聚脫氧胸苷酸(聚 dT)0[0024]所述固相支持物可采用各種基因芯片領(lǐng)域的常用材料，如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(tuán)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。
[0025]上述修飾的玻片或硅片的活性基團(tuán)如但不限于醛基、氨基、異硫酸基等，優(yōu)選醛基修飾的玻片或硅片。
[0026]本發(fā)明基因芯片的制備可按照生物芯片的常規(guī)制造方法進(jìn)行。例如，如果固相支持物采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探針配置成溶液，然后用點(diǎn)樣儀將其點(diǎn)在修飾玻片或硅片，排列成預(yù)定的系列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的基因芯片。如果寡核苷酸探針不含氨基修飾，則其制備方法也可參照:王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》JL DeRisi, VRIyer, P0 Brown.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression ona genomic scale.Science, 1997，278:680和馬立人，蔣中華主編《生物芯片》北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000，1-130。
[0027]本發(fā)明的人類多巴胺D2受體基因型檢測芯片的基因型檢測靈敏度率大于96%，特異度率大于98%。
[0028]本發(fā)明還提供了一種人類多巴胺D2受體基因檢測芯片的非以診斷為目的檢測人類多巴胺D2受體基因型的方法，包括以下步驟:
[0029](1)制備染色體DNA ；
[0030](2)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增人類多巴胺D2受體基因型的檢測方法基因中包含 DRD2_-141Cins/del (rsl799732)、DRD2 957C>T(rs6277)、DRD2 T>C (rs6275)、DRD2_A>G(rs!079727)、DRD2_C>T(rs4648317)、DRD2Taq IA_G>A(rsl800497)、DRD2_Taq IBG>A (rs!079597)、DRD2TaaID C>T (rsl800498)等的基因片段；
[0031 ] (3)標(biāo)記上述擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0032](4)將上述標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片雜交；
[0033](5)檢測基因芯片的雜交信號(hào)。
[0034]制備用于PCR擴(kuò)增的染色體DNA的方法有很多，可以從全血中制備、也可以從發(fā)根中制備，還可以從口腔黏膜的脫落物中制備。具體方法采用常規(guī)的組織DNA提取試劑盒。
[0035]用PCR方法擴(kuò)增染色體基因特定片段的方法采用常規(guī)技術(shù)。其中的關(guān)鍵在于引物設(shè)計(jì)，有關(guān)引物設(shè)計(jì)的方法、軟件均可以從商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明涉及的人類多巴胺D2受體基因的擴(kuò)增引物和體系可根據(jù)上述方法完成。
[0036]對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記可以通過采用5’端帶標(biāo)記基團(tuán)的引物進(jìn)行擴(kuò)增的方法，也可通過在擴(kuò)增過程中摻入帶標(biāo)記基團(tuán)的單核苷酸的方法加以實(shí)現(xiàn)，所述標(biāo)記基團(tuán)包括但不限于:地高辛分子(DIG)、生物素分子(Biotin)、熒光素及其衍生物分子(FITC等)、其他熒光分子(如Cy3、Cy5等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)等。
[0037]擴(kuò)增產(chǎn)物的變性采用加熱至94~98°C，并保溫2~10分鐘，然后迅速置冰上變性。
[0038]取適量變性的擴(kuò)增產(chǎn)物加入雜交緩沖液中與基因芯片雜交。與基因芯片雜交時(shí)，可以先將基因芯片與預(yù)雜交緩沖液進(jìn)行預(yù)雜交。
·[0039]本發(fā)明擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片之間的固相雜交按照本領(lǐng)域的經(jīng)典方法進(jìn)行，本領(lǐng)域一般人員依據(jù)經(jīng)驗(yàn)容易確定有關(guān)緩沖液、探針和樣品濃度、預(yù)雜交溫度、雜交溫度以及時(shí)間等的最適條件。
[0040]然后根據(jù)標(biāo)記信號(hào)在基因芯片上的位置、強(qiáng)度等信息獲取待測信息。本發(fā)明所述基因檢測芯片雜交信號(hào)的方法是基于與抗生物素抗體或親合素或鏈親合素或抗地高辛抗體或抗熒光素抗體復(fù)合在一起的堿性磷酸酶催化的四氮唑藍(lán)或辣根過氧化物酶催化的四氮唑藍(lán)(NBT)和辣根過氧化物酶催化的5-溴-4氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺鹽(BCIP)或辣根過氧化物酶催化的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的顯色反應(yīng)。若擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光基團(tuán)標(biāo)記，也可以直接用熒光檢測設(shè)備(如激光共聚焦掃描儀Scanarray3000等)獲取待測信息。
[0041 ] 本發(fā)明還提供一種人類多巴胺D2受體基因檢測芯片用于檢測人類多巴胺D2受體基因型的試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明所說的用于檢測人類多巴胺D2受體基因型的基因檢測芯片和使用說明書，使用說明書包含非以診斷為目的檢測人類多巴胺D2受體基因型的方法及上述現(xiàn)有技術(shù)的相關(guān)內(nèi)容。
[0042]本發(fā)明提供的基因芯片及其試劑盒，可用于檢測人類多巴胺D2受體基因型，這對(duì)于藥物研究單位和臨床有針對(duì)性的治療等相關(guān)應(yīng)用提供了一種簡便易行的解決方案。
[0043]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)就在于人類多巴胺D2受體基因檢測芯片以及檢測人類多巴胺D2受體基因型的方法作為一種新的檢測工具，克服了目前測定人類多巴胺D2受體基因型的方法操作繁瑣，檢測周期長，而且影響檢測結(jié)果的因素多，不易控制，難以滿足實(shí)際應(yīng)用要求的缺陷，本發(fā)明基因芯片通過將能反映樣本中大量基因信息的基因探針(寡核苷酸探針)，有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巰基、羥基等活性基因修飾的載玻片或硅片、尼龍膜、硝酸纖維塑膜)上形成陣列，通過與實(shí)際樣本(或擴(kuò)增產(chǎn)物)進(jìn)行雜交反應(yīng)，只需一次實(shí)驗(yàn)，就可高通 量獲得所有待檢基因的信息。本發(fā)明用基因芯片檢測人類多巴胺D2受體基因型，可以發(fā)揮基因芯片檢測操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確(本芯片檢測靈敏度率大于96%，特異度率大于98%)等特點(diǎn)，對(duì)于科研單位和臨床的相關(guān)應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。)因此本發(fā)明人類多巴胺D2受體基因檢測芯片及其檢測人類多巴胺D2受體的基因型的方法具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明；
[0045]圖1是人類多巴胺D2受體的基因檢測芯片上的一種點(diǎn)樣列陣；
[0046]圖2是用本發(fā)明基因檢測芯片檢測人類多巴胺D2受體的基因型所得結(jié)果?！揪唧w實(shí)施方式】
[0047]以下是本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的實(shí)際使用并不局限于實(shí)施例。
[0048]實(shí)施例1，人類多巴胺D2受體的基因檢測芯片以及檢測人類多巴胺D2受體的基因型的方法
[0049]采用本發(fā)明人類多巴胺D2受體的基因檢測芯片以及檢測人類多巴胺D2受體的基因型的方法。
[0050]本發(fā)明提供的基因檢測芯片，包括固相支持物和有序固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包含以下序列或其互補(bǔ)序列中的包含DRD2_-141Cins/del(rsl799732)、DRD2 957C>T(rs6277)、DRD2_T>C(rs6275)、DRD2_A>G(rs!079727)、DRD2_C>T(rs4648317)、DRD2Taa IA G>A(rsl800497)、DRD2 Tag IB G>A(rs!079597)、DRD2TaaIDC>T(rsl800498)突變位點(diǎn)在內(nèi)的14-20個(gè)連續(xù)核苷酸。
[0051 ] 用于人類多巴胺D1受體基因檢測芯片非以診斷為目的檢測人類多巴胺D1受體基因型的方法，包括以下步驟:
[0052](1)制備染色體DNA;
[0053](2)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增人類多巴胺D2受體基因型的檢測方法基因中包含 DRD2_-141Cins/del (rsl799732)、DRD2 957C>T(rs6277)、DRD2 T>C (rs6275)、DRD2_A>G(rs!079727)、DRD2_C>T(rs4648317)、DRD2Taq IA_G>A(rsl800497)、DRD2_Taq IBG>A (rs!079597)、DRD2TaaID C>T (rsl800498)等的基因片段；
[0054]( 3 )標(biāo)記上述擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0055](4)將上述標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片雜交；
[0056](5)檢測基因芯片的雜交信號(hào)。
[0057]㈠基因芯片的準(zhǔn)備
[0058]購置醛基修飾的載玻片(產(chǎn)品編號(hào):BSM03011，上海百傲科技有限公司)。人工合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)以 下探針，用水溶解成濃度ΙΟΟμΜ，然后用2Χ點(diǎn)樣buffer (產(chǎn)品編號(hào):BST02010，上海百傲科技有限公司)等比例混合。接著，用Affmetrix公司的GMS417點(diǎn)樣儀按圖1所述方法點(diǎn)制陣列。然后室溫放置過夜。
[0059]其中各探針序列為:
[0060]DRD2_-141Cins/del (rsl799732) probe:NH2_5，-tttttttttttttttt-cggcctgGaacgggt-3’(15 聚)(SEQ ID NO:17)
[0061]DRD2_-141Cins/del (rsl799732) probe:NH2_5’ -tttttttttttttttt-cggcctg-aacgggt-3，(15 聚)(SEQ ID NO:18)
[0062]DRD2_957C>T(rs6277)probe:NH2_5， -tttttttttttttttt-ggctgtcGggagtgc-3’(15 聚)(SEQ ID NO:19)
[0063]DRD2_957C>T(rs6277)probe:NH2_5， -tttttttttttttttt-ggctgtcAggagtgc-3，(15 聚)(SEQ ID NO:20)
[0064]DRD2_T>C (rs6275)probe:NH2_5，-tttttttttttttttt_ggagaccAtggtggg_3，(15聚)(SEQ ID NO:21)
[0065]DRD2_T>C (rs6275)probe:NH2_5，_tttttttttttttttt-ggagaccGtggtggg_3，(15聚)(SEQ ID NO:22)
[0066]DRD2 A>G(rs1079727)probe:NH2_5， -tttttttttttttttt-tctgtatTtgtgtat-3’(15 聚)(SEQ ID NO:23)
[0067]DRD2 A>G(rs1079727)probe:NH2_5’ -tttttttttttttttt-tctgtatCtgtgtat-3’(15 聚)(SEQ ID NO:24)
[0068]DRD2 C>T(rs4648317)probe:NH2_5， -tttttttttttttttt_aaactggGaggctcc_3，(15 聚)(SEQ ID NO:25)
[0069]DRD2 C>T(rs4648317)probe:NH2_5， -tttttttttttttttt_aaactggAaggctcc_3，(15 聚)(SEQ ID NO:26)
[0070]DRD2Taq IA G>A(rs!800497)probe:NH2_5，-tttttttttttttttt-cctgcctCgaccagc-3’ (15 聚)(SEQ ID NO:27)[0071]DRD2Taq IA G>A(rs!800497)probe:NH2_5，-tttttttttttttttt-cctgcctTgaccagc-3，(15 聚)(SEQ ID NO:28)
[0072]DRD2_Taq IB G>A(rs!079597)probe:NH2_5’ -tttttttttttttttt-cgcctttCgaatagg-3，(15 聚)(SEQ ID NO:29)
[0073]DRD2_Taq IB G>A(rs!079597)probe:NH2_5’ -tttttttttttttttt-cgcctttTgaatagg-3，(15 聚)(SEQ ID NO:30)
[0074]DRD2TaqID_C>T(rs!800498)probe:NH2_5， -tttttttttttttttt-cctagtcGaacccaa-3’ (15 聚)(SEQ ID NO:31)
[0075]DRD2TaqID_C>T(rs!800498)probe:NH2_5， -tttttttttttttttt-cctagtcAaacccaa-3，(15 聚)(SEQ ID NO:32)
[0076]㈡染色體DNA的制備
[0077]取待檢者全血500 μ 1，用一次性無菌注射針頭抽取，收集于含50 μ 1的296EDTA溶液的無菌1.5ml離心管中，將管蓋蓋上，上下顛倒數(shù)次，使混勻。取無菌的1.5ml離心管，向其中加入均勻的待檢全血100 μ 1和純水300 μ 1，充分混勻，室溫靜置8分鐘；將離心管置離心機(jī)中，10，000g離心1分鐘；取出離心管，傾去上清液，離心管底部可見少量白色沉淀；向離心管中加入抽提液(產(chǎn)品編號(hào):BST01010，上海百傲科技有限公司)60μ 1，充分振蕩使沉淀溶解；沸水裕中15分鐘；取出離心管，置離心機(jī)中，12，000g離心15分鐘。離心后上清液可直接用于PCR擴(kuò)增。
[0078]㈢用PCR方法擴(kuò)增基因片段
[0079]委托上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司全成以下引物:`[0080]DRD2 -141Cins/del(rsl799732)上游引物:Biotin_5，-GAAGACTGGCGAGCAGACGG
[0081]TGAG-3’ (SEQ ID NO:33)
[0082]DRD2_957C>T(rs6277)上游引物:Biotin-5’-GGAGTCTTCAGAGGGGGAAA_3’ (SEQ IDNO:34)
[0083]DRD2_T>C (rs6275)上游引物:Biotin-5’ -GGAGTCTTCAGAGGGGGAAA-3’ (SEQ IDNO:35)
[0084]DRD2 A>G(rs!079727)上游引物:Biotin-5，-AGAGGCATCCTTCCAAGTCA_3’ (SEQ IDNO:36)
[0085]DRD2 C>T(rs4648317)上游引物:Biotin-5，-CTCTTGGGCTTTCCAATCTG_3’ (SEQ IDNO:37)
[0086]DRD2Taq IA G>A(rsl800497) h游引物:Biotin_5，-CCGTCGACGGCTGGCCAAGTTGTCTA-3，(SEQ ID NO:38)
[0087]DRD2_Taq IB G>A(rs!079597)上游引物:Biotin_5’ -GATACCCACTTCAGGAAGTC-3’(SEQ ID NO:39)
[0088]DRD2TaqID_C>T(rsl800498)上游引物:Biotin5’-CCCAGCAGGGAGAGGGAGTA-3’(SEQID NO:40)
[0089]DRD2_-141Cins/del (rsl799732)下游引物:Biotin_5，-CGGTTCGGCACTGAAGCTGGAC AG-3’ (SEQ ID NO:41)
[0090]DRD2_957C>T(rs6277)下游引物:Biotin-5，-GGAATGGGACCTTTCACAGA_3’ (SEQ IDNO:42)
[0091]DRD2_T>C (rs6275)下游引物:Biotin-5’ -GGAATGGGACCTTTCACAGA-3’ (SEQ IDNO:43)
[0092]DRD2 A>G(rs!079727)下游引物:Biotin-5’-AATGGATGGACAGCAGGAGT_3’ (SEQ IDNO:44)
[0093]DRD2 C>T(rs4648317)下游引物:Biotin-5，-AGAGGCACATGGACACTGCT_3，(SEQ IDNO:45)
[0094]DRD2Taq IA G>A(rsl800497)下游引物:Biotin_5，-CCGTCGACCCTTCCTGAGTGTCATCA-3’ (SEQ ID NO:46)
[0095]DRD2_Taq IB G>A(rs!079597)下游弓丨物:Biotin-5，-CAGTAAAGAACTAGGAGTCAG-3’ (SEQ ID NO:47)
[0096]DRD2TaqID_C>T(rsl800498)下游引物:Biotin5，-GACAAGTACTTGGTAAGCATG-3’(SEQ ID NO:48)
[0097]然后用水溶解并稀釋至10 μ M。將購置的Taq酶(產(chǎn)品號(hào):Lot00085632, Fermentas), 10X 緩沖液(產(chǎn)品號(hào):Lot00083585, Fermentas), dNTP(產(chǎn)品號(hào):Lot00083613, Fermentas)，純水以及染色體DNA制備過程中獲得的PCR擴(kuò)增模板按以下配方配制PCR擴(kuò)增體系；
[0098]
【權(quán)利要求】
1.人類多巴胺2型受體基因型檢測芯片，其特征在于包括固相支持物和有序固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包含以下序列或其互補(bǔ)序列中的包含 DRD2—-141Cins/del (rsl799732)、DRD2 957C>T(rs6277)、DRD2 T>C (rs6275)、DRD2—A>G (rs!079727)、DRD2—C>T (rs4648317)、DRD2Taq IA_G>A (rsl800497)、DRD2—Taq IBG>A(rsl079597)、DRD2TaaID C>T(rsl800498)突變位點(diǎn)在內(nèi)的14-20個(gè)連續(xù)核苷酸，具體為:DRD2—_141Cins/del(rs!799732):ggcggaatcccccaacccctcctacccgttCcaggccggggatcgccgaggaggtacagct (SEQ ID NO:1)DRD2_-141Cins/del (rs!799732):ggcggaatcccccaacccctcctacccgtt[_]caggccggggatcgccgaggaggtacagct (SEQ ID NO:2)DRD2—957C>T(rs6277):cccgtcccaccatggtctccacagcactccCgacagccccgccaaaccagagaagaatg gg (SEQ ID NO:3)DRD2—957C>T(rs6277):cccgtcccaccatggtctccacagcactccTgacagccccgccaaaccagagaagaatg gg (SEQ ID NO:4)DRD2—T>C (rs6275):ccagctgactctccccgacccgtcccaccaTggtctccacagcactcccgacagccccgcc (SEQ ID NO:5)DRD2—T>C (rs6275):ccagctgactctccccgacccgtcccaccaCggtctccacagcactcccgacagccccgcc (SEQ ID NO:6)DRD2—A>G(rs!079727):tctctgtgatgaatgggtgccaaatacacaAatacagaatctaagaaaacacatggggtta (SEQ ID NO:7)DRD2—A>G(rsl079727):tctctgtgatgaatgggtgccaaatacacaGatacagaatctaagaaaacacatggggtta (SEQ ID NO:8)DRD2—C>T(rs4648317):cctccctgagtgcacaggatgctggagcctCccagtttctctggctttcatctcgtcttca (SEQ ID NO:9)DRD2—C>T(rs4648317):cctccctgagtgcacaggatgctggagcctTccagtttctctggctttcatctcgtcttca (SEQ ID NO:10)DRD2Taq IA_G>A(rsl800497):ggcaacacagccatcctcaaagtgctggtcGaggcaggcgcccagctggacgtccag gatg (SEQ ID NO:11)DRD2Taq IA_G>A(rsl800497):ggcaacacagccatcctcaaagtgctggtcAaggcaggcgcccagctggacgtccag gatg (SEQ ID NO:12)DRD2—Taq IB G>A(rsl079597):tctccacagtgctgtcagaatcacctattcGaaaggcgaatctgatcatgtggtt cctgct (SEQ ID NO:13)DRD2—Taq IB G>A(rsl079597):tctccacagtgctgtcagaatcacctattcAaaaggcgaatctgatcatgtggtt cctgct (SEQ ID NO:14)DRD2TaqID_C>T(rs!800498):ctgggggtgtgaagaaaagagccttgggttCgactagggaacctggggccact ccttcctc (SEQ ID NO:15)DRD2TaqID_C>T(rsl800498):ctgggggtgtgaagaaaagagccttgggttTgactagggaacctggggccact ccttcctc (SEQ ID N0:16)o
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類多巴胺2型受體基因型檢測芯片，其特征在于所述DRD2_-141Cins/del (rsl799732)、DRD2_957C>T (rs6277)、DRD2_T>C (rs6275)、DRD2_A>G (rs!079727)、DRD2_C>T (rs4648317)、DRD2TaqIA_G>A (rsl800497)、DRD2_Taq IBG>A(rs!079597)、DRD2TaaID C>T (rsl800498)突變位點(diǎn)序列中大寫字母表示的堿基位于所述探針的中部。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類多巴胺2型受體基因型檢測芯片，其特征在于所述寡核苷酸探針在其5’端包含一段氨基修飾的16聚的聚脫氧胸苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類多巴胺2型受體基因型檢測芯片，其特征在于所述固相支持物是尼龍膜、經(jīng)活性基團(tuán)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人類多巴胺2型受體基因型檢測芯片，其特征在于所述活性基團(tuán)是醛基、氨基或異硫酸基等，優(yōu)選醛基修飾的玻片或硅片。
6.一種使用權(quán)利要求1所述的基因檢測芯片的非以診斷為目的檢測人類多巴胺D2受體基因型的方法，包括以下步驟:(1)制備染色體DNA；(2)用聚合酶鏈反應(yīng)方法擴(kuò)增人類多巴胺D2受體基因型的檢測方法基因中包含DRD2_-141Cins/del (rsl799732)、DRD2_957C>T (rs6277)、DRD2_T>C (rs6275)、DRD2_A>G (rs!079727)、DRD2_C>T (rs4648317)、DRD2TaqIA_G>A (rsl800497)、DRD2_Taq IBG>A (rs!079597)、DRD2TaaID C>T (rsl800498)等的基因片段；(3 )標(biāo)記上述擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)將上述標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與基`因芯片雜交；(5)檢測基因芯片的雜交信號(hào)。
7.一種用于檢測人類多巴胺D2受體基因型的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含用于檢測人類多巴胺D2受體基因型的如權(quán)利要求1所述的基因檢測芯片和使用說明書，使用說明書包含非以診斷為目的檢測人類多巴胺D2受體基因型的方法。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667496SQ201310726699
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】魏淵, 吳娜, 劉星雨 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)