小核糖核酸病毒科重組載體和病毒樣顆粒及制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了小核糖核酸病毒科重組載體和病毒樣顆粒及制備方法和用途，旨在提供一種同一質(zhì)粒的不同啟動子下多個基因的表達和準確切割表達，并成功包裝出的病毒樣顆粒；其技術(shù)要點是：將小核糖核酸病毒科P1/P1op基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的兩個啟動下，獲得重組穿梭載體，轉(zhuǎn)染至宿主細胞，獲得重組桿狀病毒，感染宿主細胞，獲得病毒樣顆粒。
【專利說明】小核糖核酸病毒科重組載體和病毒樣顆粒及制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種病毒重組載體，還公開了包括該病毒重組載體的病毒樣顆粒及病毒樣顆粒及制備方法和用途，具體地說，是同一質(zhì)粒下的不同啟動子高效表達小核糖核酸病毒科病毒的病毒重組載體和病毒樣顆粒。
【背景技術(shù)】
[0002]小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)家族包含了 17個屬,大部分具有較強的致病性。其中腸病毒屬(Enterovirus),代表種:小兒麻痹癥病毒(poliovirus脊髓灰質(zhì)炎病毒)，手足口病毒71型(Enterovirus71,EV71);鼻病毒屬(Rhinovirus)，代表種:人類鼻病毒A(Human rhinovirus A);肝病毒屬(Hepatovirus),代表種:肝炎A型病毒(Hepatitis Avirus, HAV);副腸內(nèi)細胞病變?nèi)祟惞聝翰《緦?Parechovirus副腸孤病毒屬)，代表種:人類副腸內(nèi)細胞病變?nèi)祟惞聝翰《?Human parechovirus人副腸孤病毒)，能夠造成嚴重的人類疾病。另外心病毒屬(Cardiovirus),代表種:腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus);我鳥口瘡病毒屬(Aphthovirus),代表種:口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus,FMDV)等能夠引起豬牛等脊柱動物疾病。該科病毒對人類健康和生命財產(chǎn)造成極大的傷害，因此急需有效地防治手段。目前大部分病毒還沒有疫苗和特效的治療藥物，或者疫苗需要提高其安全性和有效性。
[0003]該科病毒基因組非常相似，為單股正鏈RNA，長約7.2~8.4kb，兩端為保守的非編碼區(qū)，在腸道病毒中同源性非常高，中間為連續(xù)開放讀碼框架。此外，5’端共價結(jié)合約23氨基酸的蛋白質(zhì)Vpg (genome-linked protein), 3’端帶有約50個核苷酸的poly A尾。讀碼框架區(qū)分為3個區(qū)域:P1、P2和P3。P2和P3區(qū)域編碼7個非結(jié)構(gòu)蛋白。其中3⑶/3C為蛋白酶，負責其他蛋白的剪切功能；其他蛋白包括依賴RNA的RNA聚合酶3D，具有NTP酶活性和復合體定位細胞膜的2C，兩種蛋白`酶(2B、3AB)，以及RNA5 ‘端共價多肽3B (VPg)等。Pl區(qū)編碼4個病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl~VP4。VPl、VP2和VP3均暴露在病毒衣殼的表面，中和抗原和型特異性抗原位點主要集中在VPl蛋白，同時也是分型的主要依據(jù)；VP4位于衣殼內(nèi)部，與病毒基因組脫殼有關(guān)。VP1、VP2和VP3蛋白形成的五聚體的頂端在病毒表面形成的峽谷樣結(jié)構(gòu)是受體分子結(jié)合的位點。
[0004]該類病毒粒子的裝配分為4個步驟:(I)以腸道病毒為例，當外殼蛋白Pl形成后，通過個3⑶/3C蛋白進一步切割成三個緊密聚合的蛋白質(zhì)(VPO、VP3、VPl)組成未成熟的原聚體(5S)。初期由于Pl和蛋白酶濃度較低，該裂解速度較慢；(2)隨著蛋白酶濃度增加，未成熟的原聚體濃度增加，從而形成五聚體(14S); (3)然后12個五聚體形成空殼的(80S)病毒樣顆粒(virus like particle, VLP); (4)接著正股VPg-RNA進入病毒樣顆粒形成病毒前體(150S)，進而引發(fā)VPO裂解形成VP4和VP2，形成具有感染性的成熟病毒粒子。80S的病毒樣顆粒不包含病毒的基因組，只是一個五聚體的倉庫，不具有自主復制的能力和傳染性。同時具有大部分的病毒顆粒的結(jié)構(gòu)特征，因此是目前發(fā)展該類病毒疫苗的首選目標。[0005]研究表明在該類病毒中，單獨的3C蛋白能夠切割Pl蛋白，可以不需要3D蛋白的參與。其中FMDV的3C蛋白不但能夠單獨切割自身Pl蛋白，并且能夠切割polio等病毒，并且其切割效率較高。而polio病毒的3C蛋白不能完全切割Pl蛋白，需要3D蛋白的參與。而EV71病毒3C蛋白切割效率的研究仍屬空白。
[0006]目前研究已經(jīng)有多種方法表達該類病毒VLP蛋白，用于疫苗研究。其中分別利用不同載體表達VP1、VPO和VP3的方法，轉(zhuǎn)染后不能很好的得到病毒樣顆粒。另外利用不同的啟動子分別表達3CD和Pl基因，利用表達后的3CD蛋白剪切Pl基因后形成單體蛋白，然后形成VLP。目前報道一般利用3⑶進行切割，但是3⑶蛋白基因組較大(1600bp)加重了載體負載，同時影響了切割效率。目前利用桿狀病毒系統(tǒng)和酵母系統(tǒng)的不同啟動子分別表達3CD和P1，能夠得到EV71、FMDV等病毒的病毒樣顆粒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種同一質(zhì)粒的不同啟動子下多個基因的表達和準確切割表達，并成功包裝出的病毒樣顆粒。
[0008]為此，本發(fā)明首先提供的一種小核糖核酸病毒科重組載體，該重組載體是將Pl/Plop基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的兩個啟動下，所述的Pl基因和3C基因均為小核糖核酸病毒科的Pl基因和3C基因,所述的Plop基因為小核糖核酸病毒科的Pl基因的優(yōu)化基因。
[0009]上述的小核糖核酸病毒科重組載體，將Pl/Plop基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的Ppt5lh啟動子和P1Ci啟動子下。
[0010]上述的小核糖核酸病毒科重組載體，將Pl/Plop基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的Ppt5lh啟動子和Pallv啟動子下。
[0011]本發(fā)明的另外一個技術(shù)方案，是提供該小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒包括小核糖核酸病毒科的重組載體，該重組載體是將Pl/Plop基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的兩個啟動下，所述的Pl基因和3C基因均為小核糖核酸病毒科的Pl基因和3C基因，所述的Plop基因為小核糖核酸病毒科的Pl基因的優(yōu)化基因。
[0012]進一步的，上述的小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，將Pl/Plop基因和3C基因分別分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的Ppolh啟動子和Ρ1(ι/ΡΜν啟動子下，轉(zhuǎn)化DHlOa感受態(tài)，提取陽性質(zhì)粒得到各個重組穿梭載體，再將各個穿梭載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlObac，篩選陽性重組桿狀病毒載體，轉(zhuǎn)染至宿主細胞，自主包裝成病毒樣顆粒。
[0013]進一步的，上述的小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，所述的宿主細胞為昆蟲細胞Sf9細胞株。
[0014]為制備該病毒樣顆粒，本發(fā)明還有一個技術(shù)方案是提供該病毒樣顆粒的制備方法:該方法依次包括下述步驟:
[0015]I)引物設計
[0016]對pFast-dual質(zhì)粒的Ppolh啟動子和P10/Pemv啟動子分析，設計Pl/Plop和3C基因引物；
[0017]2)穿梭載體構(gòu)建
[0018]以pFast-dual為載體，采用PCR擴增Pl和3C基因，回收片段，采用限制性內(nèi)切酶對片段和pFastBac-dual載體進行酶切后，利用回收片段進行T4連接酶連接，并進行轉(zhuǎn)化DHlOa感受態(tài)，得到陽性菌落后，提取質(zhì)粒得到重組的各個穿梭載體；
[0019]3)重組桿狀病毒載體構(gòu)建
[0020]將上述構(gòu)建好的穿梭載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlObac，選白色陽性菌落，進行PCR鑒定，得到陽性克隆，經(jīng)過擴大培養(yǎng)陽性克隆后，提取重組桿粒；
[0021]4)重組桿狀病毒的包裝
[0022]將包含構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白編碼基因的重組桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞Sf9后，得到包含構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白編碼基因重組桿狀病毒；
[0023]5)重組病毒樣顆粒表達
[0024]培養(yǎng)權(quán)利上述的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞后，在昆蟲細胞中表達構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白編碼基因，得到構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白，所述的構(gòu)建病毒樣顆粒所需蛋白進行自行組裝，得到病毒樣顆粒，形成的病毒樣顆粒分泌到細胞培養(yǎng)上清中；
[0025]6)重組病毒樣純化
[0026]步驟5)中的上清經(jīng)過初步離心去除大的細胞碎片后，采用切向流濃縮包進行濃縮后，經(jīng)過分子篩和離子交換 兩步得到純化的VLP免疫樣品。
[0027]本發(fā)明的最后一個技術(shù)方案是該小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒作為人或者動物抗小核糖核酸病毒疫苗的用途。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0029]1、在現(xiàn)有技術(shù)中，通常采用EV71的3⑶基因切割EV71病毒的Pl序列，但是該存在一定問題，3CD蛋白基因組較大(1600bp)加重了載體負載，同時影響了切割效率，本發(fā)明通過實驗證明，與3⑶相比，3C基因能夠切割EV71病毒的VPO切割為VP2和VP4，與EV71全病毒相似，并形成該類病毒的VLP，同時具有較高的免疫原性。
[0030]2、本發(fā)明制備病毒樣顆粒能夠誘導高水平的抗體免疫反應和保護效果，同時具有操作簡單、表達量高、切割效率高、免疫原性好、不帶有外源序列等優(yōu)點，因此本發(fā)明在疫苗開發(fā)領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1EV71VLP3C/3CD和Pl/Plop在同一質(zhì)粒不同啟動子下的表達構(gòu)建示意圖；
[0032]圖2重組桿狀病毒質(zhì)粒PCR鑒定圖；
[0033]圖3第一代重組桿狀病毒PCR鑒定圖；
[0034]圖4重組桿狀病毒表達上清和細胞VPl蛋白Western Blot分析圖；
[0035]圖5重組EV71VLP表達載體表達分析圖；
[0036]圖6不同表達方式的重組桿狀病毒表達EV71VLP量時序分析圖；
[0037]圖7EV71病毒樣顆粒的負染電鏡圖；
[0038]圖8不同重組病毒表達的EV71病毒樣顆粒誘導EV71特異性IgG抗體分析圖；
[0039]圖9不同重組病毒表達的EV71病毒樣顆粒誘導EV71中和抗體分析圖；
[0040]圖10不同重組病毒表達EV71VLP免疫保護研究分析圖。
【具體實施方式】[0041]下面結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護范圍內(nèi)。
[0042]本發(fā)明提供的技術(shù)方案所使用的材料:
[0043]材料
[0044]I主要材料
[0045]病毒:EV71_B6(疫苗株)，EV71-C2 (攻擊株)；
[0046]細胞:昆蟲細胞Sf9。
[0047]1.2主要試劑
[0048]病毒RNA抽提試劑盒(上海生工)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas, Thermo)；
[0049]PremerStar DNA聚合酶(大連寶生物)；
[0050]Bac重組桿狀質(zhì)粒提取試劑盒(Omiga生物)；
[0051]EV71抗原ELISA檢查試劑盒(北京京天成)；
[0052]各種DNA 消化酶，Xho1、Kpn1、RsrI1、Sma1、Xba1、SpeI, T4 連接酶購自 Fermentas ；
[0053]卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-gal、IPTG (北京鼎國)；
·[0054]LB 培養(yǎng)基(Sigma);
[0055]Grace，s 培養(yǎng)基、FBS (Gibco)；
[0056]Cellfectinll 脂質(zhì)體(Sigma)；
[0057]EV71單克隆抗體5C3 (本公司制備)；
[0058]HRP 羊抗鼠二抗(Invrtrogen)。
[0059]實施例1
[0060]本發(fā)明公開的一種表達小核糖核酸病毒科重組載體，將小核糖核酸病毒科的3C基因和Pl基因分別置于PFastBac Dual質(zhì)粒的Pptjlh啟動子和Pltl啟動子下，獲得重組載體Bac_P103C_PhP I。
[0061]實施例2
[0062]本發(fā)明公開的另一種表達小核糖核酸病毒科重組載體，將小核糖核酸病毒科的3C基因和Pl基因分別置于PFastBac Dual質(zhì)粒的Pptjlh啟動子和Pemv啟動子下，獲得重組載體Bac-Pc3C-PhPl0
[0063]實施例3
[0064]本發(fā)明公開的一種表達小核糖核酸病毒科重組載體，將小核糖核酸病毒科的3C基因和Pl基因優(yōu)化后的Plop基因分別置于PFastBac Dual質(zhì)粒的Pptjlh啟動子和Pltl啟動子下，獲得重組載體Bac-P1(l3C-PhPl0p。
[0065]實施例4
[0066]本發(fā)明公開的另一種表達小核糖核酸病毒科重組載體，將小核糖核酸病毒科的3C基因和Pl基因優(yōu)化后的Plop基因分別置于PFastBac Dual質(zhì)粒的Pptjlh啟動子和Pemv啟動子下，獲得重組載體Bac-Pe3C-PhPlop。
[0067]實施例5
[0068]本發(fā)明提供的一種小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，將小核糖核酸病毒科Pl基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的Ppolh啟動子和Pltl啟動子下，轉(zhuǎn)化DHlOa感受態(tài)，提取陽性質(zhì)粒得到各個重組穿梭載體，再將各個穿梭載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlObac，篩選陽性重組桿狀病毒載體，轉(zhuǎn)染至宿主細胞，自主包裝成病毒樣顆粒。
[0069]實施例6
[0070]本發(fā)明提供的一種小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，將小核糖核酸病毒科Pl基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的Pptjlh啟動子Pcmv啟動子下，轉(zhuǎn)化DHlOa感受態(tài)，提取陽性質(zhì)粒得到各個重組穿梭載體，再將各個穿梭載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlObac，篩選陽性重組桿狀病毒載體，轉(zhuǎn)染至宿主細胞，自主包裝成病毒樣顆粒。
[0071]實施例7
[0072]本發(fā)明提供的一種小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，將Pl基因優(yōu)化后的Plop基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的Pptjlh啟動子和Pltl啟動子下，轉(zhuǎn)化DHlOa感受態(tài)，提取陽性質(zhì)粒得到各個重組穿梭載體，再將各個穿梭載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlObac，篩選陽性重組桿狀病毒載體，轉(zhuǎn)染至宿主細胞，自主包裝成病毒樣顆粒。
[0073]實施例8
[0074]本發(fā)明提供的一種小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，將Pl基因優(yōu)化后的Plop基因和3C基因 分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的Pptjlh啟動子Pcmv啟動子下，轉(zhuǎn)化DHlOa感受態(tài)，提取陽性質(zhì)粒得到各個重組穿梭載體，再將各個穿梭載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlObac，篩選陽性重組桿狀病毒載體，轉(zhuǎn)染至宿主細胞，自主包裝成病毒樣顆粒。
[0075]其中:基因Plop的優(yōu)化方法為:
[0076]參照昆蟲細胞密碼子表，利用序列優(yōu)化軟件對Pl序列進行昆蟲細胞密碼子偏愛性優(yōu)化。優(yōu)化后結(jié)果如下:
[0077]
【權(quán)利要求】
1.一種小核糖核酸病毒科重組載體，其特征在于，將Pl/Plop基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的兩個啟動下，所述的Pl基因和3C基因均為小核糖核酸病毒科的Pl基因和3C基因，所述的Plop基因為小核糖核酸病毒科的Pl基因的優(yōu)化基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小核糖核酸病毒科重組載體，其特征在于，將Pl/Plop基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的PpaLh啟動子和P1O啟動子下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小核糖核酸病毒科重組載體，其特征在于，將Pl/Plop基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的Pptjlh啟動子和P.啟動子下。
4.一種小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，其特征在于，包括權(quán)利要求1至3任一所述的小核糖核酸病毒科重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，其特征在于，將Pl/Plop基因和3C基因分別分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的Pptjlh啟動子和Ρ1(1/Ρ_啟動子下，獲得重組穿梭載體，轉(zhuǎn)染至宿主細胞，獲得重組桿狀病毒，感染宿主細胞，獲得病毒樣顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，其特征在于，所述的宿主細胞為昆蟲細胞Sf9細胞株。
7.制備權(quán)利要求4所述的病毒樣顆粒的方法:其特征在于，依次包括下述步驟: 1)引物設計 對pFast-dual質(zhì)粒的Pptjlh啟動子和Pltl啟動子分析，設計3C和Pl/Plop基因引物； 2)穿梭載體構(gòu)建· 以pFast-dual為載體，采用PCR擴增3C和Pl/Plop基因，回收片段，采用限制性內(nèi)切酶對片段和pFastBac-dual載體進行酶切后，利用回收片段進行T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)化DHlOa感受態(tài)，得到陽性菌落后，提取質(zhì)粒得到重組的各個穿梭載體； 3)重組桿狀病毒載體構(gòu)建 將上述構(gòu)建好的穿梭載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlObac，選白色陽性菌落，進行PCR鑒定，得到陽性克隆，經(jīng)過擴大培養(yǎng)陽性克隆后，提取重組桿粒； 4)重組桿狀病毒的包裝 將包含構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白編碼基因的重組桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞Sf9后，得到包含構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白編碼基因重組桿狀病毒； 5)重組病毒樣顆粒表達 培養(yǎng)權(quán)利上述的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞后，在昆蟲細胞中表達構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白編碼基因，得到構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白，所述的構(gòu)建病毒樣顆粒所需蛋白進行自行組裝，得到病毒樣顆粒，形成的病毒樣顆粒分泌到細胞培養(yǎng)上清中； 6)重組病毒樣純化 步驟5)中的上清經(jīng)過初步離心去除大的細胞碎片后，采用切向流濃縮包進行濃縮后，經(jīng)過分子篩和離子交換兩步得到純化的VLP免疫樣品。
8.權(quán)利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒作為人或者動物抗小核糖核酸病毒疫苗的藥物用途。
【文檔編號】C12N15/66GK103710384SQ201310698584
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】王弋, 彭濤, 許昱華, 馬書智, 安鴻, 尹海濱 申請人:廣東華南聯(lián)合疫苗開發(fā)院有限公司