來(lái)源于疏棉狀嗜熱絲孢菌的酯酶、基因、載體、工程菌及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來(lái)源于疏棉狀嗜熱絲孢菌的酯酶、基因、載體、工程菌及在制備(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，所述酯酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2所示；本發(fā)明酯酶基因可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基因的胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌。該重組大腸桿菌含有酯酶，可以利用重組大腸桿菌或純化的酯酶為催化劑進(jìn)行生物催化生產(chǎn)普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體。
【專利說(shuō)明】來(lái)源于疏棉狀嗜熱絲孢菌的酯酶、基因、載體、工程菌及應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從疏棉狀嗜熱絲抱菌(Thermomyces lanuginosus)DSM10635中獲得的酯酶、編碼基因、載體、工程菌及應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]酯酶(Esterase，EC3.1.1.1)是一類能催化酯水解和合成的酶，廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物中(FEMS Microbiol.Rev.2002,26:73-81 )。由于酯酶催化的酶促反應(yīng)具有良好的底物專一性、區(qū)域選擇性或?qū)τ尺x擇性，酯酶被廣泛用于手性拆分中，是合成手性酸、手性酯或手性醇等手性化合物的重要生物催化劑。
[0003]普瑞巴林(Pregabalin，簡(jiǎn)稱PGB)，化學(xué)名為(S) -(+) _3_氨甲基_5_甲基己酸(I )，是 Y-氨基丁酸的一種結(jié)構(gòu)類似物(Angew.Chem.1nt.Ed.2008，47:3500-3504)。普瑞巴林作為一種鈣離子通道調(diào)節(jié)劑，能有效阻斷電壓依賴性鈣通道，減少神經(jīng)遞質(zhì)的釋放(Curr.0pin.Pharmacol.2006，6:108-113)，對(duì)癲癇、神經(jīng)病理性疼痛有良好的療效，且具有使用劑量低、服用次數(shù)少、副作用小、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、耐受性強(qiáng)等特點(diǎn)。自上市以來(lái)，普瑞巴林全球銷售額快速增長(zhǎng)，成為全球暢銷藥市場(chǎng)的“重磅炸彈”，市場(chǎng)前景十分廣闊。
[0004](3S) -2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸(II)是制備普瑞巴林的關(guān)鍵手性中間體，可由2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制備，然后經(jīng)加熱脫羧、堿性水解和加氫還原即可合成普瑞巴林(I ) (Org.Process Res.Dev.2008, 12:392-398)。美國(guó)輝瑞公司開發(fā)成功的普瑞巴林化學(xué)-酶法生產(chǎn)工藝，引入脂肪酶選擇性水解制備(3S) -2-羧乙基-3-氰基-5-甲
基己酸，但所用生物催化劑為Novozymes公司商品化脂肪酶Lipolase'導(dǎo)致生產(chǎn)成本過(guò)`高。因此，開發(fā)出具有自有知識(shí)產(chǎn)權(quán)、能高效、高選擇性拆分2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制備(3S)-2-羧乙基-3-氰`基-5-甲基己酸的新生物催化劑具有重要意義。
[0005]
【權(quán)利要求】
1.一種來(lái)源于疏棉狀嗜熱絲孢菌DSM10635的酯酶，其特征在于:所述酯酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述酯酶的基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:1 所示。
3.一種含有權(quán)利要求2所述酯酶編碼基因的重組載體。
4.一種含有權(quán)利要求2所述酯酶編碼基因的基因工程菌。
5.一種權(quán)利要求2所述編碼基因在制備酯酶中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述方法為:構(gòu)建含有所述酯酶編碼基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從培養(yǎng)液分離得到含有重組酯酶的菌體細(xì)胞，從菌體細(xì)胞中分離純化得到重組酯酶。
7.—種權(quán)利要求1所述酯酶在制備(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述酯酶在制備(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用方法為:以含酯酶的基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后獲得的濕菌體或濕菌體破碎后獲得酯酶為催化劑，以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯為底物，于pH6~9緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系中， 在30~60°C下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，獲得的轉(zhuǎn)化液即為含有(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的混合液，將混合液分離純化即獲得到(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
9.如權(quán)利要求8所述酯酶在制備(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)體系中濕菌體的質(zhì)量用量以菌體干重計(jì)為4~10g/L，所述酯酶的質(zhì)量用量為0.1~1.0g/L，所述底物初始濃度為10~200mM。
10.如權(quán)利要求8所述酯酶在制備(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備:將含酯酶的基因工程菌接種至終濃度為50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，370C，150rpm培養(yǎng)10h，獲得培養(yǎng)液，再將培養(yǎng)液以體積濃度1%接種量接種到新鮮的含有終濃度50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，150rpm培養(yǎng)至菌體濃度OD6tltl為0.4~0.8，向反應(yīng)液中加入終濃度為0.1~0.5mM的IPTG，于16~28°C誘導(dǎo)培養(yǎng)6~20h后，離心，棄上清，收集沉淀，即獲得含有酯酶的濕菌體；濕菌體超聲破碎后離心，上清液經(jīng)N1-NTA柱親和層析分離純化，即獲得酯酶。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103695385SQ201310684640
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】鄭裕國(guó), 鄭仁朝, 黎小軍, 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)