胞外醛內(nèi)酯酶的制作方法
【專利摘要】本公開(kāi)涉及通過(guò)使用嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶來(lái)水解己糖-δ-內(nèi)酯。特別地，本公開(kāi)涉及包含嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶的組合物及其使用方法。
【專利說(shuō)明】胞外醛內(nèi)酯酶[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求在2010年7月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/369，358的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)?jiān)诖艘砸梅绞饺牟⑷氡疚摹?br> [0003]ASCII文本文件形式的序列表的提交
[0004]以下提交的ASCII文本文件形式的內(nèi)容以引用方式全部并入本文:序列表的計(jì)算機(jī)可讀形式(CRF)(文件名:677792000640SeqList.txt，記錄日期:2011年6月20曰，大小:28KB)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本公開(kāi)涉及通過(guò)使用嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶來(lái)水解己糖-δ -內(nèi)酯。特別地，本公開(kāi)涉及包含嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶的組合物及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0006]木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為豐富的可再生資源，并且為潛在用于生產(chǎn)液體燃料和其他增值產(chǎn)物的原料(I)。生產(chǎn)木質(zhì)纖維素衍生的生物燃料的主要障礙為化學(xué)預(yù)處理以及用于解聚的酶的高成本(2)。嗜熱真菌(嗜熱側(cè)孢霉,Sporotrichum thermophile)極快速地降解纖維素，并且以極其相同的速率代謝粉末狀纖維素和葡萄糖(3)。與得自嗜溫真菌絲狀真菌紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(同物異名里氏木霉(Trichoderma reesei))的那些水解酶的穩(wěn)定性相比，得自所述這種有機(jī)體的水解酶的熱穩(wěn)定性提供了實(shí)踐優(yōu)點(diǎn)，例如在廣泛的PH范圍內(nèi)具有高的酶活性，其中所述的嗜溫真菌絲狀真菌紅褐肉座菌(同物異名里氏木霉(Trichoderma reesei))用于生產(chǎn)生物質(zhì)降解酶。在纖維素底物上的生長(zhǎng)過(guò)程中，嗜熱側(cè)飽酶分泌纖維素酶、半纖維素酶(4)、氧化酶(5)以及許多未知功能的蛋白質(zhì)。
[0007]纖維二糖脫氫酶(CDH)為嗜熱側(cè)飽酶在纖維素上生長(zhǎng)的過(guò)程中大量生產(chǎn)的胞外血-黃素蛋白(5)。許多纖維素分解真菌生產(chǎn)CDH(6)。所述的CDH將纖維二糖和較長(zhǎng)的纖維糊精的還原末端氧化成相應(yīng)的醛內(nèi)酯(圖1)。對(duì)于所有纖維素分解微生物體而言，可以通過(guò)增加CDH和葡萄糖氧化酶的表達(dá)水平來(lái)改善得自纖維素的糖酸產(chǎn)率。
[0008]醛內(nèi)酯或糖內(nèi)酯在水性溶液中不穩(wěn)定，并且發(fā)生水解從而形成相應(yīng)的醛糖酸。未經(jīng)催化的水解的程度和速率取決于特定的內(nèi)酯、PH和溫度。葡糖酸-δ-內(nèi)酯與葡糖酸之間的平衡常數(shù)為7.7，這有利于葡糖酸，并且在室溫和pH 5.0下，葡糖酸-δ-內(nèi)酯在水中的半衰期為約I小時(shí)(10)。然而，盡管缺乏這種穩(wěn)定性，但是諸如嗜熱側(cè)飽酶之類的真菌進(jìn)化出催化糖內(nèi)酯水解成它們相應(yīng)的醛糖酸的酶。這種水解成醛糖酸增加纖維素隨后被纖維素分解酶(例如纖維素酶)水解的容易性。因此，糖內(nèi)酯高效地轉(zhuǎn)化為醛糖酸可以對(duì)纖維素降解并由此對(duì)生物燃料的形成具有有利的影響(圖1)。
[0009]在磷酸戊糖途徑中，主要研究了糖內(nèi)酯的酶水解(11-14)。在磷酸戊糖途徑中，葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為6-磷酸-葡糖酸內(nèi)酯。接著，該內(nèi)酯被6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(PGL)水解，從而形成6-磷酸葡萄糖，并最終轉(zhuǎn)化為核酮糖-5-磷酸。在大腸桿菌(Escherichia coli)的糖酵解缺陷株中，刪除PGL基因?qū)е略谄咸烟巧系纳L(zhǎng)嚴(yán)重受到抑制(15)，清楚地證明6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯的自發(fā)水解在體內(nèi)是不足夠的。
[0010]已經(jīng)報(bào)道了被分泌到多種真菌的培養(yǎng)物濾液中的醛內(nèi)酯酶活性(16-17)。得自黑曲霉的醛內(nèi)酯酶通過(guò)Bruchmann et al.純化(16)，并顯示為真菌纖維素分解系統(tǒng)的重要部分。然而，得自嗜熱側(cè)飽酶的胞外醛內(nèi)酯酶尚未純化、鑒定或表征。
[0011]在新興的生物燃料工業(yè)中，在高溫和酸性pH值下的反應(yīng)對(duì)于植物細(xì)胞壁的多糖酶轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖而言是重要的。高溫轉(zhuǎn)化降低了細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，并且在高溫下酶通常具有較快的轉(zhuǎn)換。此外，由于污染的風(fēng)險(xiǎn)降低，所以低PH也是有利的。最佳的是，纖維素酶在pH 4.8-5.0下工作，并且如果所有的酶具有相似的最佳pH使得它們可以同時(shí)使用，則可以使得所述的方法更簡(jiǎn)單。因此，在本領(lǐng)域中重要的是具有由嗜熱真菌(例如嗜熱側(cè)飽霉)分離得到的熱穩(wěn)定的酶，該酶在廣泛的PH值范圍內(nèi)具有活性，從而用于水解在生物燃料原料植物細(xì)胞壁多糖轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的過(guò)程中生產(chǎn)的內(nèi)酯。包含在廣泛的PH值范圍內(nèi)具有醛內(nèi)酯酶活性的組合物和方法將在木質(zhì)纖維素的酶解聚中具有用途。
[0012]發(fā)明概述
[0013]本公開(kāi)涉及具有保守模體和內(nèi)酯酶活性(例如嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶I)的重組多肽、其變體和其片段。本公開(kāi)還涉及包含多肽的組合物、以及包含這些組合物的食品添加劑，其中所述的多肽具有保守模體和醛內(nèi)酯酶活性。此外，本公開(kāi)涉及通過(guò)使用所述的組合物來(lái)水解含己糖的多糖或寡糖來(lái)制備內(nèi)酯酸的方法，使生物質(zhì)解構(gòu)的方法，食品加工的方法，織物清潔的方法，以及紙漿漂白的方法。本公開(kāi)還涉及包含重組多肽的宿主細(xì)胞、以及包含這些宿主細(xì)胞的組合物，其中所述的多肽具有保守模體和內(nèi)酯酶活性。
[0014]因此，一方面提供含有GPRH 模體(SEQ ID NO: 9)和 DPTGxF/Y 模體(SEQ ID NO: 10)的重組多肽，其中所述的多肽具有內(nèi)酯酶活性。在某些實(shí)施方案中，重組多肽含有SEQID NO:1的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，重組多肽含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，重組多肽含有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了組合物，該組合物包含根據(jù)之前任意一個(gè)實(shí)施方案中所述的方面的重組多肽。在某些實(shí)施方案中，所述的組合物進(jìn)一步包含至少一種另外的多肽。在可以與之前所述的實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述的至少一種另外的多肽為纖維二糖脫氫酶(⑶H)。在可以與之前所述的實(shí)施方案(其具有進(jìn)一步包含至少一種另外的多肽的組合物)結(jié)合的其他實(shí)施方案中，所述的至少一種多肽為葡萄糖氧化酶(GOX)。
[0016]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的多核苷酸序列的表達(dá)載體，所述多核苷酸序列編碼根據(jù)之前所述的方面(其具有所述的重組多肽)的多肽。
[0017]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了組合物，該組合物包含根據(jù)之前所述的方面的表達(dá)載體。
[0018]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含根據(jù)之前所述的方面的表達(dá)載體。在某些實(shí)施方案中，所述的宿主細(xì)胞選自真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0019]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了組合物，該組合物包含根據(jù)之前在其任意一個(gè)實(shí)施方案中所述的方面的宿主細(xì)胞。
[0020]另一個(gè)方面提供了制備重組多肽的方法，包括:(a)提供包含載體的宿主細(xì)胞的群，其中所述的載體包含編碼多肽的多核苷酸序列，該多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)，并且具有內(nèi)酯酶活性；以及(b)在一定的條件下培養(yǎng)細(xì)胞群，其中在所述的條件下，由所述的表達(dá)載體的編碼序列所編碼的多肽得以表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，多肽含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，多肽含有SEQ IDNO:2的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，多肽含有SEQ IDNO:3的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0021]另一個(gè)方面提供了制備醛糖酸的方法，包括:使己糖-δ -內(nèi)酯底物與重組多肽接觸，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)，并且具有內(nèi)酯酶活性。在某些實(shí)施方案中，重組多肽含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，重組多肽含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，重組多肽含有SEQIDNO:3的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，己糖-δ -內(nèi)酯底物選自纖維二糖酸-δ -內(nèi)酯、葡糖酸-δ-內(nèi)酯和內(nèi)酯酸-δ- 內(nèi)酯。
[0022]另一個(gè)方面提供了降解生物質(zhì)的方法，包括:使所述的生物質(zhì)與根據(jù)之前所述的方面的所述的組合物接觸，其中所述的組合物具有重組多肽，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ IDNO:10)，并且具有內(nèi)酯酶活性。在某些實(shí)施方案中，組合物還包含⑶H。
[0023]另一個(gè)方面提供了使生物質(zhì)解構(gòu)的方法，包括:使所述的生物質(zhì)與根據(jù)之前所述的方面的所述的組合物接觸，從而使所述的生物質(zhì)解構(gòu)，其中所述的組合物具有重組多肽，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO: 10)，并且具有內(nèi)酯酶活性。在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)含有植物材料。在可以與之前所述的實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述的植物材料選自:細(xì)葉芒、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、蘆葦、小麥桿、大麥桿、加拿大稻草、燕麥稻、玉米稻、豆稻、燕麥皮、燕麥、高粱、稻殼、鹿洛、玉米纖維、大麥、燕麥片、亞麻、小麥、亞麻籽、桔漿、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆、棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾膠、黃豆、可溶性酒精糟濾液(DDGS)、須芒草、玉米穗、松樹(shù)、針葉樹(shù)軟木、桉樹(shù)、樺木、柳樹(shù)、白楊、楊木、雜交楊木、能源甘鹿(energy cane)、短周期木本作物、作物殘茬、庭院廢物或其組合。
[0024]另一個(gè)方面提供了食品加工的方法，包含:將植物材料與根據(jù)之前所述的方面的所述的組合物接觸，從而產(chǎn)生可消化的植物材料，其中所述的組合物具有重組多肽，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)，并且具有內(nèi)酯酶活性。在某些實(shí)施方案中，可消化的植物材料喂養(yǎng)動(dòng)物。
[0025]另一個(gè)方面提供了食品添加劑，該食品添加劑包含根據(jù)之前所述的方面的所述的具有重組多肽的組合物，其中所述的重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)，并且具有內(nèi)酯酶活性。
[0026]另一個(gè)方面提供了織物清潔的方法，包括:使弄臟的織物與根據(jù)之前的方面的所述的組合物接觸，從而產(chǎn)生清潔的織物，其中所述的組合物具有重組多肽，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)，并且具有內(nèi)酯酶活性。
[0027]另一個(gè)方面提供了紙漿漂白的方法，包括:使紙漿與根據(jù)之前的方面的所述的組合物接觸，從而漂白的紙漿，其中所述的組合物具有重組多肽，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ IDNO:10)，并且具有內(nèi)酯酶活性。[0028]附圖簡(jiǎn)述
[0029]圖1提供了胞外糖氧化和內(nèi)酯水解的機(jī)制的圖示。還原糖最初通過(guò)胞外氧化酶(包含葡萄糖氧化酶(GOX)和纖維二糖脫氫酶(⑶H))而被轉(zhuǎn)化為糖內(nèi)酯。通過(guò)胞外內(nèi)酯酶(圖框中)催化相應(yīng)糖酸的轉(zhuǎn)化。在纖維素降解中，形成醛糖酸的這種轉(zhuǎn)化容易地進(jìn)入到隨后的步驟中，并因此增加了生物燃料生產(chǎn)的效率。
[0030]圖2示出了嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶I (Spothl I 109678)的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)。戴帽的殘基表示信號(hào)肽，雙下劃線的區(qū)域表示所預(yù)計(jì)的N連接的糖基化位點(diǎn)，并且下劃線的區(qū)域表示通過(guò)LC-MS檢測(cè)的肽。圈起來(lái)的殘疾顯示出在醛內(nèi)酯酶中是保守的。
[0031]圖3示出了嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶2 (Spothl I 89286)的氨基酸序列(SEQ IDNO:2) 0圈起來(lái)的殘疾顯示出在醛內(nèi)酯酶中是保守的。
[0032]圖4示出了粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)內(nèi)酯酶2 (NCU01743)的氨基酸序列(SEQ ID NO:3) 0圈起來(lái)的殘疾顯示出在醛內(nèi)酯酶中是保守的。
[0033]圖5示出了使用4-15 % Criterion (Biorad)凝膠得到的經(jīng)純化的重組Spothl 1109678 和 NCU07143 SDS-PAGE 分析結(jié)果。泳道 1:BenchmarkProtein 梯帶(在50kDa和20kDa處具有黑色條帶)，泳道2:在Pichia中表達(dá)的Spothl 1109678，泳道3:在Pichia中表達(dá)的Spothl 1109678 (5x稀釋的)，泳道4:在Pichia中表達(dá)的NCU07143,泳道5:在Pichia中表達(dá)的NCU07143 (5x稀釋的)。Spothl 1109678和NCU07143的表觀分子量分別為50-60kDa和約49kDa。
[0034]圖6示出了內(nèi)源嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶I的純化級(jí)份的SDS-PAGE分析結(jié)果。通過(guò)在含DTT的SDS緩沖液中沸騰使所述的級(jí)份變性。泳道I和7示出了蛋白質(zhì)梯帶，泳道2示出了上清濃縮液粗品，泳道3示出了在除去纖維素結(jié)合單邊之后的上清液，泳道4示出了在Q HP離子交換色譜之后的上`清液，泳道5示出了在Mono Q離子交換色譜之后的上清液，以及泳道6示出了在PHE輸水作用色譜之后的上清液。
[0035]圖7示出了質(zhì)譜的結(jié)果。經(jīng)純化的完整嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶的解回旋質(zhì)譜示出了糖型之間的質(zhì)樸差異為約162道爾頓。雙峰質(zhì)量差為約20道爾頓。
[0036]圖8示出了使用3種不同的己糖-δ-內(nèi)酯((a)葡糖酸-δ-內(nèi)酯、(b)纖維二糖酸-δ-內(nèi)酯、和(c)內(nèi)酯酸-δ-內(nèi)酯)作為底物，對(duì)嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶I的動(dòng)力學(xué)測(cè)試結(jié)果。
[0037]圖9示出了嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶I的pH概況。在室溫下，使用IOnM醛內(nèi)酯酶、50mM葡糖酸-δ -內(nèi)酯和IOOmM緩沖液將所述的反應(yīng)進(jìn)行I分鐘。所用的緩沖液包含檸檬酸鈉，ΡΗ3.0 ;乙酸鈉，ρΗ4.0 ;乙酸鈉，ρΗ5.0 ;琥珀酸鈉，ρΗ6.0 ;HEPES，pH7.0 ;以及Tris，pH8.00誤差柱表不3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0038]圖10示出了具有其他醛內(nèi)酯酶的嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶I (Spothl I 109678)的多個(gè)序列比對(duì)。全黑圓圈表示在所預(yù)計(jì)的NC_cmle的活性位點(diǎn)處的殘基。ST_1為嗜熱側(cè)抱霉胞外醒內(nèi)酯酶 I (Spothl 1109678 ；SEQID NO:1), PA_1 ;柄抱霉(Podospora anserina)醛內(nèi)酯酶 I (XP_001910211.1 ；SEQ ID NO:4)，TR 為里氏木霉(Trire2 | 55887 ；SEQ IDN0:5)，AN為黑曲霉(ΧΡ_659716.I ;SEQ ID NO:6)，ST_2為嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶2(Spothl|89286 ；SEQ ID NO:2)，EC_pgl 為大腸桿菌 6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(ΝΡ_415288.I ；SEQ ID NO:7)，以及NC_cmle為粗糙脈孢菌順-羧基-粘康酸-內(nèi)酯化酶(XP_957686 ；SEQID NO:8)。在所述的醛內(nèi)酯酶中顯示具有2個(gè)保守的模體:GPRH模體(SEQ ID NO:9)(在嗜熱側(cè)孢霉醛內(nèi)酯酶I中，氨基酸224-227)和DPTGxF/Y (SEQ ID NO:10)(在嗜熱側(cè)孢霉醛內(nèi)酯酶I中，氨基酸182-187)。
[0039]圖11示出了各個(gè)序列的系統(tǒng)樹(shù)，其中所述的序列顯示出與嗜熱側(cè)孢霉醛內(nèi)酯酶I具有序列相似性。列出了得自100個(gè)迭代的解靴帶值。(*)表示嗜熱側(cè)孢霉醛內(nèi)酯酶1，()表示以生物化學(xué)方式表征的蛋白質(zhì)，以及(▲)表示X射線晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解釋的蛋白質(zhì)。
[0040]圖12示出了在嗜熱側(cè)孢霉在補(bǔ)充有2%葡萄糖或2%纖維素的Vogel’s鹽上生長(zhǎng)4天后收集的培養(yǎng)液中，嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶I的特異活性。
[0041]圖13示出了嗜熱側(cè)孢霉在葡萄糖或纖維素上生長(zhǎng)20小時(shí)之后,嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶I和嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶2的表達(dá)概況。根據(jù)每百萬(wàn)圖譜讀序中每千個(gè)堿基轉(zhuǎn)座子的圖譜讀序數(shù)(RPKM)來(lái)歸一化。醛內(nèi)酯酶I以淺灰色示出，醛內(nèi)酯酶2以黑色示出。
[0042]定義
[0043]術(shù)語(yǔ)“胞外醛內(nèi)酯酶”、“醛內(nèi)酯酶”、“嗜熱側(cè)孢霉醛內(nèi)酯酶1”、“嗜熱側(cè)孢霉醛內(nèi)酯酶I”和“內(nèi)酯酶”是指能夠催化aldonate和芳族內(nèi)酯水解成相應(yīng)的羧酸的酶(EC
3.1.1.17)。特別地，“醛內(nèi)酯酶”使己糖-δ -內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為它們對(duì)應(yīng)的醛糖酸。
[0044]術(shù)語(yǔ)“催化活性”或“活性”定量描述了給定底物在定義反應(yīng)條件下的轉(zhuǎn)化情況。術(shù)語(yǔ)“特異活性”定量描述了在定義反應(yīng)條件下每一定量的酶的催化活性。
[0045]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“百分一致的”、“百分一致性”和“百分序列一致性”定義為在參照氨基酸或核酸序列與其他氨基酸或核酸序列之間的一致性的量。百分序列一致性可以通過(guò)比較2個(gè)最佳比對(duì)的序列來(lái)確定，其中與參照序列(例如所公開(kāi)的核酸或氨基酸序列)相比，待比較的部分序列可以包含加入或刪除(即，間隔)，而所述的參照序列不包含加入或刪除，從而用于2個(gè)序列的最佳比對(duì)。所述的百分率通過(guò)以下方法計(jì)算:通過(guò)確定在兩個(gè)序列中一致的核酸或氨基酸殘基所形成的位置的數(shù)量以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)量，再將匹配位置的數(shù)量除以待比較的位置的總數(shù)，并將結(jié)果乘以100從而得到序列一致性的百分率。當(dāng)針對(duì)最大對(duì)應(yīng)或設(shè)計(jì)區(qū)域進(jìn)行比較和比對(duì)2個(gè)序列時(shí)，如果這2個(gè)序列中，相同氨基酸殘基或核酸的百分率是特定的(即，在特定區(qū)域上75%的一致的，或者在整個(gè)序列上并非特定時(shí))，則這2個(gè)序列具有百分一致性，其中所述的最大對(duì)應(yīng)或設(shè)計(jì)區(qū)域是使用以下序列比較算法或通過(guò)人工比對(duì)和視覺(jué)檢查而測(cè)量得到的。
[0046]適用于確定百分序列一致性的算法的一個(gè)實(shí)例為BLAST算法，其在Altschul etal.(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402中有所描述。用于實(shí)施BLAST分析的軟件可通過(guò)National Center for Biotechnology Information而為公眾利用。在以下情況下使用BLASTP程序，其中默認(rèn)設(shè)定的字長(zhǎng)為3，期望值(E)為10，BL0SUM62得分矩陣(參見(jiàn)Henikoff and Henikoff (1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915)比對(duì)(B)為 50，期望值(E)為10，M = 5，N = -4，以及雙鏈比較。對(duì)于核酸序列而言，BLASTN程序(用于核酸序列)使用默認(rèn)字長(zhǎng)(W)為11，期望值( E)為10，M = 5，N = -4，以及雙鏈比較。
[0047]發(fā)明詳述
[0048]以下說(shuō)明書(shū)列出了大量示例性的構(gòu)造、參數(shù)等。然而，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到該說(shuō)明書(shū)無(wú)意于限定本發(fā)明的范圍，而是作為示例性實(shí)施方案的描述而提供的。[0049]多肽
[0050]本公開(kāi)涉及分離的多肽、其變體或其片段，所述的多肽具有保守的GPRH(SEQ IDNO:9)和/或DPTGxF/Y (SEQ ID NO: 10)模體，其中所述的多肽具有內(nèi)酯酶活性。在一些實(shí)施方案中，多肽為胞外醒內(nèi)酯酶。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽為:胞外醒內(nèi)酯酶，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；或胞外醛內(nèi)酯酶的變體，該變體具有I至60個(gè)突變，同時(shí)保持了野生型嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶I的活性(例如，SEQ ID NO:1的H177和R302)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽為:胞外醛內(nèi)酯酶，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；或胞外醛內(nèi)酯酶的變體，該變體具有I至60個(gè)突變，同時(shí)保持了野生型嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶2的活性(例如，SEQ ID NO:1的H177和R302)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽為胞外醛內(nèi)酯酶，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；或其胞外醛內(nèi)酯酶的變體，該變體具有I至60個(gè)突變，同時(shí)保持了野生型粗糙脈孢菌的內(nèi)酯酶2的活性。在一些實(shí)施方案中，醛內(nèi)酯酶與SEQ ID NO:1的序列一致性為至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75 %、優(yōu)選至少80 %、優(yōu)選至少85 %、優(yōu)選至少90 %、優(yōu)選至少95 %、優(yōu)選至少99 %或者100%。在其他實(shí)施方案中，醛內(nèi)酯酶與SEQ ID NO:2的序列一致性為至少50%、至少55%、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、優(yōu)選至少80 %、優(yōu)選至少85 %、優(yōu)選至少90 %、優(yōu)選至少95%、優(yōu)選至少99%或者100%。在其他實(shí)施方案中，醛內(nèi)酯酶與SEQ ID NO:3的序列一致性為至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、優(yōu)選至少95%、優(yōu)選至少99%或者100%。
[0051 ] 在其他實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶多肽包含氨基酸序列，該氨基酸序列通過(guò)插入或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘疾和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基取代而與所述的SEQ ID NO:1的氨基酸序列不同。在其他實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶多肽包含氨基酸序列，該氨基酸序列通過(guò)插入或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘疾和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基取代而與所述的SEQ ID NO:2的氨基酸序列不同。在其他實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶多肽包含氨基酸序列，該氨基酸序列通過(guò)插入或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘疾和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基取代而與所述的SEQ ID N0:3的氨基酸序列不同。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸改變?yōu)?保守的氨基酸取代，其不會(huì)顯著地影響所述的多肽的折疊和/或活性的；或者少量的刪除，通常為I至大約30個(gè)氨基酸。保守的取代的實(shí)例為在堿性氨`基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、及較小的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸)的類別內(nèi)進(jìn)行。通常不會(huì)改變特異活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的。例如，最通常發(fā)生的取代為Ala變?yōu)镾er、Val變?yōu)閘ie、Asp變?yōu)镚lu、Thr變?yōu)镾er、Ala 變?yōu)?Gly、Ala 變?yōu)?Thr、Ser 變?yōu)?Asn、Ala 變?yōu)?Val、Ser 變?yōu)?Gly、Tyr 變?yōu)?Phe> Ala變?yōu)镻ro、Lys變?yōu)锳rg、Asp變?yōu)锳sn、Leu變?yōu)閘ie、Leu變?yōu)閂al、Ala變?yōu)镚lu、Asp變?yōu)镚ly，以及保守的取代。
[0052]在一些實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶多肽以重組方式生產(chǎn)，同時(shí)在其他方式中，所述的胞外醛內(nèi)酯酶多肽以合成方式生產(chǎn)，或者由天然來(lái)源純化得到(例如嗜熱側(cè)孢霉)。
[0053]在其他實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶氨基酸序列及衍生物作為N-和/或C-末端融合蛋白生產(chǎn)，從而例如有助于提取、檢測(cè)和/或純化，和/或向所述的胞外醛內(nèi)酯酶加入功能性質(zhì)。融合蛋白伴侶的實(shí)例包含但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6XHis、GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域)、FLAG-、MYC-標(biāo)記或本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的其他標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，在融合蛋白伴侶與所關(guān)注的蛋白序列之間提供蛋白水解的裂解位點(diǎn)，從而可以除去融合蛋白序列。優(yōu)選的是，所述的融合蛋白不會(huì)阻礙胞外醛內(nèi)酯酶的活性。
[0054]在一些實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶與功能結(jié)構(gòu)域融合，其中所述的功能結(jié)構(gòu)域包含引導(dǎo)肽、前肽、結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或催化結(jié)構(gòu)域。合適的結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含但不限于各種特異性的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如CBM)，從而在胞外醛內(nèi)酯酶的應(yīng)用過(guò)程中提供針對(duì)碳水化合物成分的增加的親和性。合適的酶活性結(jié)構(gòu)域具有活性，該活性支持胞外醛內(nèi)酯酶在生產(chǎn)所述的產(chǎn)物中的作用。催化結(jié)構(gòu)域的非限定性實(shí)例包含:纖維素酶；半纖維素酶，例如木聚糖酶、內(nèi)切甘露糖聚酶、外切甘露糖聚酶、葡聚糖酶、阿拉柏糖酶、半乳糖苷酶、果膠酶、和/或其他活性(例如蛋白酶、脂酶、酸性磷酸酶等或它們的功能片段)。融合蛋白通過(guò)連接體序列可任選地與醛內(nèi)酯酶鏈接，其中所述的連接體序列在不會(huì)顯著地影響任何一種成分的條件下簡(jiǎn)單地將胞外醛內(nèi)酯酶與融合結(jié)構(gòu)有連接起來(lái)，或者所述的連接體可任選地具有用于目的用途的功能重要性。[0055]備選地，本文所述的胞外醛內(nèi)酯酶可用于連接一種或多種所關(guān)注的額外蛋白。所關(guān)注的蛋白的非限定性實(shí)例包含:半纖維素酶、α-半乳糖苷酶、β_半乳糖苷酶、乳糖酶、β -葡聚糖酶、內(nèi)切_β -1，4-葡聚糖酶、纖維素酶、木糖苷酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、內(nèi)切甘露糖聚酶、外切甘露糖聚酶、果膠酶、果膠酸酯裂解酶、果膠脂酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉柏糖酶、聚鼠李糖半乳糖醛酸水解酶、漆酶、還原酶、氧化酶、多酚氧化酶、木質(zhì)素酶、蛋白酶、淀粉酶、磷酸酶、解脂酶、角質(zhì)酶和/或其他酶。
[0056]載體和宿主細(xì)胞
[0057]為了制備真菌胞外醛內(nèi)酯酶，可以由公開(kāi)的序列以化學(xué)方式合成編碼所述的酶的DNA,或者有帶有所述的基因的宿主細(xì)胞直接得到該DNA (例如通過(guò)cDNA文庫(kù)篩選或者PCR擴(kuò)增)。在一些實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶多核苷酸包含在表達(dá)盒中，和/或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆技術(shù)而被克隆到合適的表達(dá)載體中。這種表達(dá)盒或載體包含有助于轉(zhuǎn)錄起始和終止(例如啟動(dòng)子和終止子)的序列，并且通常包含選擇標(biāo)記。
[0058]表達(dá)盒或載體被引入到合適的表達(dá)宿主細(xì)胞中，接著該細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的胞外醛內(nèi)酯酶多核苷酸。特別合適的表達(dá)宿主為細(xì)菌表達(dá)宿主菌屬，包含埃希氏菌(例如大腸桿菌)、假單胞菌屬(例如突光假單胞菌(P.fluorescens)或斯氏假單胞菌(P.stutzerei))、變形菌屬(例如奇異變形菌(Proteusmirabilis))、勞爾氏菌屬(例如真氧產(chǎn)堿桿菌(Ralstonia eutropha))、鏈絲菌屬、葡萄球菌(例如肉糖葡萄球菌(S.carnosus))、乳酸球菌屬(例如乳酸乳球菌)、或芽孢桿菌屬(枯草芽孢桿菌(SUbtilis)、巨大芽孢桿菌(megaterium)、地衣芽孢桿菌(Iicheniformis)等)。此外，特別合適的為酵母菌表達(dá)宿主，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)、漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、或畢赤酵母(Pichia pastoris)。特別合適的為真菌表達(dá)宿主，例如黑曲霉、Chrysosporium lucknowense、曲霉屬(例如米曲菌(A.0ryzae)、黑曲菌、小巢狀曲菌(A.nidulans)等)、或里氏木霉。此外，哺乳動(dòng)物表達(dá)宿主也是合適的，例如小鼠(例如NSO)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞(CHO)或幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞系。此外，其他真核生物宿主(例如昆蟲(chóng)細(xì)胞)或病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如細(xì)菌噬菌體(例如Ml3、T7噬菌體或Lambda)或病毒(例如桿狀病毒))也適用于制備胞外醛內(nèi)酯酶。
[0059]在所關(guān)注的具體宿主中，與分泌蛋白有關(guān)的啟動(dòng)子和/或信號(hào)序列為在該宿主或其他宿主中用于胞外醛內(nèi)酯酶的異源生產(chǎn)和分泌的代表。例如，在絲狀真菌系統(tǒng)中，驅(qū)動(dòng)纖維二糖水解酶I (cbhl)、葡糖淀粉酶A(glaA)、TAKA-淀粉酶(amyA)、木聚糖酶(exlA)、gpd-啟動(dòng)子 cbhl、cbhl 1 > 內(nèi)切葡聚糖酶基因 EG1-EGV > Cel61B、Cel74A、egll-egl5、gpd 啟動(dòng)子、Pgkl、pki1、EF-1a、tefUcDNAl和hexl的基因的啟動(dòng)子是特別合適的，并且可以由大量不同的有機(jī)體(例如黑曲菌、里氏木霉、米曲菌、泡盛曲霉(A.awamori)和小巢狀曲菌)衍生得到。在一些實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶多核苷酸以重組方式與編碼合適的同源或異源信號(hào)序列的多核苷酸結(jié)合，其中所述的信號(hào)序列使得胞外醛內(nèi)酯酶被分泌到胞外(或周質(zhì))空間中，由此允許在細(xì)胞上清液(或周質(zhì)空間或裂解物)中直接檢測(cè)酶活性。用于大腸桿菌、其他革蘭氏陰性細(xì)菌和本領(lǐng)域已知的其他有機(jī)體的特別合適的信號(hào)序列包含驅(qū)動(dòng)HlyA、DsbA、Pbp、PhoA、PelB、OmpA、OmpT或M13噬菌體Gill基因表達(dá)的那些。對(duì)于枯草芽孢桿菌、革蘭氏陽(yáng)性有機(jī)體和本領(lǐng)域已知的其他有機(jī)體，特別合適的信號(hào)序列進(jìn)一步包含驅(qū)動(dòng) AprE、NprB、Mpr、AmyA、AmyE、Blac、SacB 表達(dá)的那些，并且對(duì)于釀酒酵母(S.cerevisiae)或其他酵母菌而言，所述的信號(hào)序列包含嗜殺毒素、BarU Suc2、交配因子a、InulA或Ggplp信號(hào)序列。信號(hào)肽序列可以通過(guò)大量的信號(hào)肽酶切割，由此將信號(hào)肽由所表達(dá)的蛋白的其余部分中除去。在一些實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶的其余部分單獨(dú)表達(dá)，或者表達(dá)為與位于N-或C-末端的其他肽、標(biāo)記或蛋白(例如6Xhis、HA或FLAG標(biāo)記)融合形成的融合體。合適的融合體包含有利于親和純化或檢測(cè)的標(biāo)記、肽或蛋白(例如6Xhis、HA、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、硫氧化還原蛋白或FLAG標(biāo)記)，以及有利于目標(biāo)物內(nèi)切-β -甘露糖聚酶的表達(dá)、分泌或加工的那些。合適的加工位點(diǎn)包含腸激酶、STE13、Kex2或適用于體內(nèi)或體外切割的其他蛋白酶切割位點(diǎn)。
[0060]胞外醛內(nèi)酯酶多核苷酸通過(guò)大量的轉(zhuǎn)化方法被引入到表達(dá)宿主細(xì)胞中，包含但不限于電穿孔、脂質(zhì)輔助的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染(“脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染”)、化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(例如使用氯化鈣和/或磷酸鈣)、乙酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如宿主細(xì)胞原生質(zhì)體的乙酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)、整體“基因槍”轉(zhuǎn)化、PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如宿主細(xì)胞原生質(zhì)體的PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)、原生質(zhì)體融合(例如使用原核或真核生物原生質(zhì)體)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，以及農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、腺病毒或其他病毒或曬菌體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0061]備選地，胞外醛內(nèi)酯酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?？扇芜x地，在所述的酶的變體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、或者在使用信號(hào)序列(例如上文所述的那些)而被分泌到周質(zhì)空間之后，可以使用透化或溶解步驟來(lái)將胞外醛內(nèi)酯酶釋放到上清液中。膜屏障的瓦解受到機(jī)械手段(例如超聲波、加壓處理(法壓)、空洞形成)的應(yīng)用或者膜消化酶(例如溶解酶或酶的混合物)的應(yīng)用的影響。進(jìn)一步備選地，編碼胞外醛內(nèi)酯酶的多核苷酸通過(guò)使用合適的不含細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。在不含細(xì)胞的系統(tǒng)中，通常借助于啟動(dòng)子來(lái)轉(zhuǎn)錄所關(guān)注的多核苷酸，但是連接從而形成環(huán)狀表達(dá)載體是可任選的。在其他實(shí)施方案中，RNA是在未轉(zhuǎn)錄的條件下外源加入或產(chǎn)生的，并在不含細(xì)胞的系統(tǒng)中翻譯的。
[0062]生物質(zhì)形成單糖或寡糖的降解
[0063]本公開(kāi)的胞外醛內(nèi)酯酶和宿主細(xì)胞在多種工業(yè)應(yīng)用中找到用途。例如，本文所公開(kāi)的胞外醛內(nèi)酯酶在生物燃料的生產(chǎn)、食品加工、織物清潔和紙漿漂白中具有用途。
[0064]生物燃料的制備
[0065]本公開(kāi)的胞外醛內(nèi)酯酶發(fā)現(xiàn)作為來(lái)自生物質(zhì)(用于制備乙醇、丁醇、其他產(chǎn)物或中間體)的化學(xué)或發(fā)酵原料在在制備單糖、二糖和寡糖中的用途。胞外醛內(nèi)酯酶可以為具有或不具有所除去的細(xì)胞的發(fā)酵液粗品形式，或者為半純化或純化的酶的制備物形式。備選地，本公開(kāi)的宿主細(xì)胞在使用生物質(zhì)的發(fā)酵過(guò)程中作為所述的變體的來(lái)源。
[0066]生物質(zhì)可以包含但不限于植物材料、城市固體廢物和廢紙。植物材料包含但不限于細(xì)葉芒、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、蘆葦、小麥桿、大麥桿、加拿大稻草、燕麥秸、玉米秸、豆秸、燕麥皮、燕麥、高粱、稻殼、蔗渣、玉米纖維、大麥、燕麥片、亞麻、小麥、亞麻籽、桔漿、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆、棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾膠、黃豆、可溶性酒精糟濾液(DDGS)、須芒草、玉米穗、松樹(shù)、針葉樹(shù)軟木、桉樹(shù)、樺木、柳樹(shù)、白楊、楊木、雜交楊木、能源甘蔗、短周期木本作物、作物殘茬、庭院廢物或其組合。在生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁中，主要多糖為纖維素，第二最豐富的多糖為半纖維素，第三為膠質(zhì)。此外，在所述的細(xì)胞停止生長(zhǎng)之后生產(chǎn)的次生細(xì)胞壁也包含多糖，并且通過(guò)聚合木質(zhì)素與半纖維素共價(jià)交聯(lián)而加強(qiáng)。纖維素為脫水纖維二糖的均聚物，因此為線性i3-(l_4)-D-葡聚糖，而半纖維素包含多種化合物，例如具有多種取代基的絡(luò)合支化結(jié)構(gòu)形式的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖。盡管纖維素通常為多形性，但是發(fā)現(xiàn)纖維素在植物組織中主要作為平行葡聚糖鏈的不溶性結(jié)晶基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素及其他半纖維素氫鍵鍵合，這有助于穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。
[0067]通過(guò)生物質(zhì)的酶降解以及將釋放的糖轉(zhuǎn)化為乙醇來(lái)生產(chǎn)乙醇。這種乙醇通常被稱為生物乙醇或生物燃料。其作為燃料添加劑或混合劑在共混物為少于1%至至多100%(燃料取代物)。因此，本公開(kāi)的胞外醛內(nèi)酯酶在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的降解中在己糖-內(nèi)酯中間體的降解中具有用途，從而 有助于由生物質(zhì)釋放己糖單糖。由此，己糖單糖用于乙醇的生產(chǎn)。具體而言，本發(fā)明的胞外醛內(nèi)酯酶與用于生產(chǎn)己糖醛糖酸(例如己糖酸、己二糖酸、己三糖酸、己四糖酸、己五糖酸和/或己六糖酸)的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)接觸放置。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶與用于植物材料更廣泛的水解的其他糖酶(例如葡聚糖酶、木聚糖酶、α -半乳糖苷酶和/或纖維素酶)結(jié)合使用。
[0068]食品加工
[0069]多種抗?fàn)I養(yǎng)因子限定了特定植物材料在動(dòng)物飼料和人類食品的制備中的用途。包含木質(zhì)纖維材料(例如纖維素)的植物材料通常減少了動(dòng)物對(duì)該材料的消化性。纖維素的負(fù)作用具體而言是由于β_(1，4)糖苷鍵，該鍵阻止許多動(dòng)物將纖維素降解為葡萄糖。這些作用是通過(guò)使用纖維素降解酶(即，胞外醛內(nèi)酯酶)而降低，這允許更高比例的植物材料被轉(zhuǎn)化為飼料，從而使得飼料的成本降低。此外，通過(guò)胞外醛內(nèi)酯酶的活性，纖維素材料分解成較簡(jiǎn)單的糖，這可以更容易地同化，從而提供額外的能量。因此，包含本公開(kāi)的胞外醛內(nèi)酯酶的組合物優(yōu)選用于加工和/或制造食品或動(dòng)物飼料。
[0070]本公開(kāi)的胞外醛內(nèi)酯酶可用作用于單胃動(dòng)物(例如家禽和豬)的飼料及人類食品的添加劑。在一些實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶可用于預(yù)處理所述的飼料而非作為飼料添加劑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶被加入或用于預(yù)處理得自植物材料的飼料，其中所述的植物材料例如為黑麥、高粱、大米、蔗渣、玉米、大麥、燕麥片、亞麻、小麥、亞麻籽、桔漿、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆、棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾膠或黃豆。
[0071 ] 在欲用于食品加工或作為飼料補(bǔ)充物的、包含胞外醛內(nèi)酯酶的組合物中，該組合物可任選地包含其他取代物，例如著色劑、芳香化合物、穩(wěn)定劑、維生素、礦物質(zhì)、其他飼料或食品增強(qiáng)的酶等。這特別應(yīng)用于所謂的預(yù)混合物。根據(jù)本發(fā)明的食品添加劑可以與其他食品成分結(jié)合，從而生產(chǎn)經(jīng)加工的食品產(chǎn)物。所得的結(jié)合的食品添加劑以合適的量與其他食品成分(例如谷物或植物蛋白質(zhì))混合，從而形成經(jīng)加工的食品產(chǎn)物。
[0072]織物清潔
[0073]本公開(kāi)的胞外醛內(nèi)酯酶在洗滌劑組合物中具有用途，從而有利于除去含內(nèi)酯的污點(diǎn)/污物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶在洗滌劑組合物中與其他酶結(jié)合使用，其中所述的酶選自淀粉酶、纖維素酶、脂酶、果膠酶、蛋白酶和內(nèi)切葡聚糖酶。
[0074]包含胞外醛內(nèi)酯酶的本公開(kāi)的洗滌劑組合物為任何方便的形式(例如條、片、粉末、顆粒、糊狀物或液體)。液體洗滌劑通常是水性的，通常包含至多70%的水和0-30%有機(jī)溶劑，或非水性的成分。
[0075]洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑(例如包含半極性的非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑)。表面活性劑通常以0.1重量％至60重量％的水平存在。當(dāng)洗滌劑包含表面活性劑時(shí)，其通常包含約1%至約40%的陰離子表面活性劑，例如線性烷基苯磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸、或者肥皂。當(dāng)洗滌劑包含表面活性劑時(shí)，其通常包含約0.2%至約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、乙氧基壬基酚、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺(glucamide)的N-?；鵑-烷基衍生物。`
[0076]洗滌劑組合物可任選地包含0-65%洗滌劑促凈劑或絡(luò)合劑，例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}。洗滌劑組合物可任選地包括一種或多種聚合物，例如羧甲基纖維素(CMC)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)，聚(乙烯基咪唑)，聚羧酸鹽，例如聚丙烯酸鹽、馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物、和月桂基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可任選地包含漂白系統(tǒng)(例如過(guò)氧化氫來(lái)源)，例如過(guò)硼酸鹽或過(guò)碳酸鹽，其可以與形成過(guò)酸的漂泊活化劑(例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸鹽)結(jié)合。備選地，漂泊系統(tǒng)包含酰胺、酰亞胺或砜的過(guò)氧化物。
[0077]在洗滌劑組合物中，以相應(yīng)于每升洗液0.01-1OOmg酶蛋白的量加入胞外醛內(nèi)酯酶，優(yōu)選的是每升洗液0.05-5mg酶蛋白，特別是每升洗液0.1-1mg酶蛋白。
[0078]紙漿漂白
[0079]本公開(kāi)的胞外醛內(nèi)酯酶在紙漿(例如化學(xué)紙漿、半化學(xué)紙漿、牛皮漿、機(jī)械紙漿或通過(guò)亞硫酸鹽方法制備的紙漿)的酶輔助的漂泊中具有用途。在一些實(shí)施方案中，紙漿為使用氧、臭氧、過(guò)氧化物或過(guò)酸漂泊的不含氯的紙漿。在一些實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶用于紙漿的酶輔助的漂泊中，其中所述的紙漿是通過(guò)經(jīng)修改的或連續(xù)的成漿方法生產(chǎn)的，其中所述的方法表現(xiàn)出較低的木質(zhì)素含量。在一些實(shí)施方案中，胞外醛內(nèi)酯酶單獨(dú)使用，或者優(yōu)選地與木聚糖酶和/或內(nèi)切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纖維二糖水解酶結(jié)合使用。
[0080]討論
[0081]嗜熱側(cè)胞霉為由土壤和自熱堆肥分離得到的嗜熱真菌(3)。證明嗜熱側(cè)胞霉極快速地降解纖維素。在本公開(kāi)的研發(fā)過(guò)程中，與纖維素降解過(guò)程有關(guān)的酶是由嗜熱側(cè)胞霉分離得到的。如本文所公開(kāi)那樣，包含胞外醛內(nèi)酯酶活性的酶經(jīng)純化、鑒定并由嗜熱子囊菌嗜熱側(cè)胞霉表征。嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶在廣泛的pH值范圍內(nèi)水解己糖δ-內(nèi)酯。該酶在500C (用于生產(chǎn)所述的酶的生長(zhǎng)條件)下的幾天內(nèi)是穩(wěn)定的。在不同的底物上測(cè)定嗜熱側(cè)胞霉醛內(nèi)酯酶的表達(dá)概況和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。本文所公開(kāi)的結(jié)果對(duì)嗜熱側(cè)胞霉在營(yíng)養(yǎng)物(特別是由己糖S-內(nèi)酯)的獲取中是如何使用醛內(nèi)酯酶以及這種酶如何可以用于生物燃料的生產(chǎn)進(jìn)行洞察。
[0082]之前已經(jīng)參照6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(PGL)活性描述了兩類進(jìn)化不同的酶。通過(guò)與大腸桿菌的葡糖胺-6-磷酸異構(gòu)酶NagB具有同源性的酶來(lái)催化真核生物和原核生物的PGL活性(11)。最近，在大腸桿菌中測(cè)定形成PGL活性的基因(13-14)。大腸桿菌PGL與NagB-樣PGL不具有序列相似性，并且與粗糙脈孢菌順-羧基-粘康酸-內(nèi)酯化酶(CMLE)具有13%的序列一致性，其中所述的順-羧基-粘康酸-內(nèi)酯化酶為與β-酮己二酸途徑有關(guān)的酶(32)。在全部的細(xì)菌和真菌中，大腸桿菌PGL的同源物是普遍存在的。在嗜熱側(cè)胞霉和其他子囊菌中，NagB-樣PGL在磷酸戊糖途徑中形成了 PGL活性，這是由于預(yù)計(jì)NagB-樣PGL是細(xì)胞內(nèi)的，并顯示出與人類和酵母PGL具有約40%的序列一致性。有趣的是，除了NagB-樣PGL，許多子囊菌具有不同的大腸桿菌PGL同源物，預(yù)計(jì)該物質(zhì)為胞外蛋白，該蛋白可以具有與磷酸戊糖途徑中的PGL的功能無(wú)關(guān)的功能。
[0083]如本文所公開(kāi)的那樣，鑒定與大腸桿菌PGL具有低同源性的嗜熱側(cè)胞霉基因。在嗜熱側(cè)胞霉中，公開(kāi)的嗜熱側(cè)胞霉基因編碼了行成胞外醛內(nèi)酯酶活性的醛內(nèi)酯酶I。如本文所述，由Spothl 1109678基因編碼的醛內(nèi)酯酶I為糖蛋白，并且具有廣泛的pH適應(yīng)性，這與粗糙脈孢菌CMLE所報(bào)道的pH概況相似`。醛內(nèi)酯酶I表現(xiàn)出對(duì)己糖δ-內(nèi)酯底物具有高活性，但是對(duì)戊糖Y-內(nèi)酯不具有可檢測(cè)的活性。顯而易見(jiàn)的是，對(duì)葡萄糖、纖維二糖和乳糖的S-內(nèi)酯而言，kMt/KM值僅具有3倍的差異，表明所述的酶僅與葡萄糖部分相互作用。這與纖維二糖脫氫酶和許多纖維素酶的底物特異性形成明顯的對(duì)比，通常，所述的酶對(duì)纖維二糖的親和性比對(duì)葡萄糖的親和性高很多(6，35)。對(duì)粗糙脈孢菌CMLE和大腸桿菌PGL的結(jié)構(gòu)研究表明這些酶的活性位點(diǎn)是高度保守的，并且可能在所述的蛋白質(zhì)的表面或附近(31)。表面暴露的活性位點(diǎn)符合本文所公開(kāi)的動(dòng)力學(xué)結(jié)果。
[0084]嗜熱側(cè)飽霉在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)上生長(zhǎng)過(guò)程中，其誘導(dǎo)了兩種大腸桿菌PGL-樣內(nèi)酯酶的表達(dá)(如本文所公開(kāi)的那樣，醛內(nèi)酯酶I和醛內(nèi)酯酶2)。粗糙脈飽菌的近期全基因組表達(dá)概況研究鑒別出NCU07143，其為與嗜熱側(cè)飽霉內(nèi)酯酶具有序列同源性(與醛內(nèi)酯酶I的同源性為24% ;與醛內(nèi)酯酶2的同源性為67% )的蛋白質(zhì)，其在木質(zhì)纖維素和純纖維素上生長(zhǎng)的過(guò)程中受到強(qiáng)的上調(diào)節(jié)(21)。此外，在纖維素和木質(zhì)纖維素上生長(zhǎng)的過(guò)程中，還在粗糙脈飽菌的分泌組中檢測(cè)到NCU07143，證明所述的酶也是胞外酶。嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶2與嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶I具有約28%的序列一致性。盡管它們的序列一致性低，但是在兩種嗜熱側(cè)飽霉內(nèi)酯酶中，所有所預(yù)計(jì)的活性位點(diǎn)的殘基都是保守的，并且與任何其他所預(yù)計(jì)的原核生物內(nèi)酯酶相比，它們彼此更密切相關(guān)。
[0085]此外，與粗糙脈飽菌和嗜熱側(cè)飽霉內(nèi)酯酶具有序列相似性的基因也存在于黑曲霉和里氏木霉中(16)。盡管酵母菌中通常缺乏胞外醛內(nèi)酯酶-樣基因，但是該基因絲狀子囊菌中是普遍存在的。所有經(jīng)測(cè)序的纖維素分解子囊菌與嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶I或醛內(nèi)酯酶2都具有同源性。而且，針對(duì)目前經(jīng)測(cè)序的擔(dān)子菌的基因組，BLAST查詢僅帶來(lái)具有低同源性的蛋白質(zhì)，并且沒(méi)有蛋白質(zhì)被預(yù)測(cè)是胞外蛋白。
[0086]近年來(lái),在原核生物銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中表征了與嗜熱側(cè)飽霉內(nèi)酯酶具有低序列同源性的周質(zhì)葡糖酸內(nèi)酯酶(PpgL) (33)。與真菌相似，銅綠假單胞菌包含NagB-樣細(xì)胞內(nèi)PGL，其在磷酸戊糖途徑中提供醛內(nèi)酯酶活性(12)。此外，顯示出刪除PpgL會(huì)導(dǎo)致在葡糖酸鹽、2-酮葡糖酸鹽和甘露醇上嚴(yán)重生長(zhǎng)的顯型，并導(dǎo)致色素形成減少。然而，銅綠假單胞菌并非為纖維素分解菌，這樣PpgL并不涉及任何細(xì)胞壁的降解過(guò)程，從而強(qiáng)調(diào)內(nèi)酯酶在新陳代謝中的多種作用。
[0087]簡(jiǎn)言之，本文所述的嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶I的生物化學(xué)表征提供了關(guān)于嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶I在水解己糖S-內(nèi)酯中的用途的向?qū)?，其中所述的水解己糖?內(nèi)酯作為降解用于隨后生產(chǎn)生物燃料的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的過(guò)程中的步驟。形成和使用本公開(kāi)，作用機(jī)制的知識(shí)并非是必須的。
[0088]實(shí)施例1
[0089]材料和方法
[0090]材料.除了糖內(nèi)酯以外，所有化學(xué)品均為試劑級(jí)品質(zhì)，并購(gòu)自商品供應(yīng)商。糖內(nèi)酯是通過(guò)經(jīng)修改的Frush與Isbell方法合成的(18)。簡(jiǎn)言之，在IOOmL冰冷的水中，將
0.015摩爾的糖、0.03摩爾的碳酸鈣和0.02摩爾的溴混合，并在室溫下在黑暗中存放24小時(shí)。通過(guò)使用氮?dú)鈱⑺玫娜芤捍祾逫小時(shí)來(lái)除去殘余的溴。然后，件過(guò)量的碳酸銀加入到所得的溶液中，并通過(guò)過(guò)濾除去沉淀。接著，將含有糖內(nèi)酯的濾液施加到離子交換樹(shù)脂IR-120(H+)上。使用5個(gè)柱體積的水洗滌柱，并收集含有糖內(nèi)酯的洗脫液。然后，在55°C下，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮洗脫液。如下文所述，通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)分析各種糖內(nèi)酯的純度。
[0091]重組粗糙脈孢菌NCU07143和嗜熱側(cè)孢霉醛內(nèi)酯酶I的克隆和純化.[0092]使用以下引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增NCU07143和Spothl | 109678:
[0093]NCU07143 限制性酶:KpnI 和 XbaI
[0094]NCU07143-正向:ATATATATGGTACCGCCACTTTGCTGGTTTCC (SEQ IDNO:11)
[0095]NCU07143-反向:
[0096]ATATATATTCTAGATTCTCTACCCAAACGACAGCACTAAG(SEQ ID NO:12)
[0097]Spothl I 109678 限制性酶:KpnI 和 XbaI
[0098]Spothl 1109678-正向:ATATATATGGTACCGCCCCGGTCTGTGGC(SEQ IDNO: 13)
[0099]Spothl I 109678-反向:
[0100]ATATATATTCTAGATTCTGCTTAAACGTGGCAAAGTTG(SEQ ID NO:14)
[0101]對(duì)于Spothl I 109678而言，由在Vogel’s基本培養(yǎng)基(其補(bǔ)充有2% (w/v)棉球)上生長(zhǎng)的嗜熱側(cè)飽霉培養(yǎng)物分 離cDNA。
[0102]對(duì)于NCU07143而言，由在Vogel’ s基本培養(yǎng)基(其補(bǔ)充有2% (w/v)Avicel)上生長(zhǎng)的嗜熱側(cè)飽霉培養(yǎng)物分離cDNA。
[0103]PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，克隆到ZeiO BluntR TOPOκ載體中。使用KpnI和XbaI消化包含有所述的內(nèi)酯酶的Ppicz a -A載體和TOPO載體。插入物和切開(kāi)的載體經(jīng)凝膠純化。然后，使用熱敏磷酸酶處理所述的載體。使用Τ4 DNA連接酶將插入物連接到Ppicz a -A中。接著,根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū),將具有正確的插入物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至丨J畢赤酵母(Pichiapastoris)中(Pichia EasySelect Expression Kit, Invitrogen,Carlsbad, CA)。根據(jù) Pichia EasySelect Expression Kit 說(shuō)明書(shū)，使用濃度為 0.5% (v/v)的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。
[0104]在使用甲醇誘導(dǎo)2天以后，收獲培養(yǎng)物。通過(guò)離心除去細(xì)胞，并將培養(yǎng)液濃縮，再使用切向流過(guò)濾而緩沖液更換至25mM Tris pH 8.0中。接著,在5mL Fastflow HisTrap柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上，運(yùn)行濃縮的培養(yǎng)上清液。使用處于25mM Tris pH 8.0和500mM NaCl中的200mM咪唑，由所述的柱洗脫重組蛋白質(zhì)。經(jīng)純化的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE示于圖5中。
[0105]重組嗜熱側(cè)孢霉醛內(nèi)酯酶2 (Spothl I 89286)的克隆和表達(dá).在48 °C下，在補(bǔ)充有2% w/v葡萄糖的Vogel ' s培養(yǎng)基上，使嗜熱側(cè)飽霉生長(zhǎng)30小時(shí)。然后，通過(guò)過(guò)濾分離菌絲，在液氮中冷凍，再使用研和杵將菌絲磨成細(xì)粉。使用QiagenPlant DNEasy基因組DNA分離試劑盒，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)對(duì)約IOOmg的粉末進(jìn)行加工。使用以下引物，由基因組DNA擴(kuò)增Spothl I 89286，其中所述的引物為:Spothl I 89286-正向(TACTTCCAATCCAATGCAATGT(SEQ ID NO:15))和 Spothl|89286-反向(CTCCCACTACCAATGCCCTGC(SEQ ID NO:16))。
[0106]將PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，并在25mM dCTP存在下，使用T4 DNA聚合酶處理從而形成粘性末端。使用SspI消化 pNeurA質(zhì)粒,并經(jīng)凝膠純化。接著,在25mM dGTP存在下,使用T4 DNA聚合酶處理質(zhì)粒從而形成粘性末端。然后，將具有粘性末端的質(zhì)粒和質(zhì)粒混合在一起，并使得它們?cè)?2°C下退火5分鐘，然后轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)的大腸桿菌中。對(duì)多個(gè)克隆子進(jìn)行測(cè)序，從而證明Spothl I 89286正確地插入到pNeurA中。按照之前所述，將包含Spothl I 89286的pNeurA轉(zhuǎn)化到組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型粗糙脈孢菌中(19)。然后，針對(duì)GFP熒光，篩選能夠在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化子，從而證明生產(chǎn)出Spothl I 89286。一旦將轉(zhuǎn)化子與GFP —起分離，便將分生孢子接種到包含Vogel' s培養(yǎng)基瓊脂(其補(bǔ)充有2%w/v的蔗糖)的新鮮斜面上。使培養(yǎng)物在斜面上生長(zhǎng)10天，然后接種到包含Vogel' s培養(yǎng)基(其補(bǔ)充有2% w/v的蔗糖)的液體培養(yǎng)物中。在液體培養(yǎng)物中生長(zhǎng)2天之后，使用水洗漆菌絲，并轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有2% w/v乙酸鈉的Vogel' s培養(yǎng)基中，從而誘導(dǎo)Spothl 89286的表達(dá)。在乙酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2天之后，收獲培養(yǎng)物，在0.2微米PES過(guò)濾器上過(guò)濾，從而除去任何殘余的生物質(zhì)，并使用具有10，000MWC0 PES膜的切向流過(guò)濾系統(tǒng)濃縮。
[0107]使用標(biāo)準(zhǔn)的葡糖酸內(nèi)酯酶測(cè)試法證明對(duì)葡萄酸內(nèi)酯的內(nèi)酯酶活性(如在其他部分所述)。由于在粗糙脈飽菌中，通過(guò)內(nèi)切蛋白酶除去了親和純化靶物，所以所述的蛋白未經(jīng)進(jìn)一步的純化。
[0108]用于純化內(nèi)切嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶I的菌株和生長(zhǎng)條件.嗜熱側(cè)孢霉ATCC菌株42464得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)。將嗜熱側(cè)飽霉保持在包含2%纖維二糖的Vogel’ s鹽瓊脂(20)上。由在48°C下生長(zhǎng)7天的瓊脂平板上分離分生孢子(真菌孢子)。針對(duì)醛內(nèi)酯酶誘導(dǎo)研究，將嗜熱側(cè)飽霉分生孢子接種到包含Voger S鹽的液體培養(yǎng)物(其補(bǔ)充有2%葡萄糖或纖維素)中，并在48°C下、在200rpm的搖動(dòng)下生長(zhǎng)。
[0109]內(nèi)切嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶I的純化.對(duì)于醛內(nèi)酯酶的純化,將嗜熱側(cè)飽霉分生孢子接種到包含1.0g/L酪蛋白氨基酸、1.0g/L酵母提取物、0.5g/L氯化鉀、0.2g/L硫酸鎂七水合物、1.0g/L磷酸二氫鉀和微量元素溶液的天然培養(yǎng)基中。在48°C下，使培養(yǎng)物在200rpm的搖動(dòng)下生長(zhǎng)24小時(shí)，然后通過(guò)過(guò)濾收獲真菌菌絲(真菌的營(yíng)養(yǎng)菌絲部分)并用于接種新鮮的天然培養(yǎng)基(其包含5g/L纖維素(Avicelu PH 101, Sigma, St.Louis, MO))，以誘導(dǎo)醛內(nèi)酯酶的表達(dá)。
[0110]在包含纖維素的天然培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48小時(shí)之后，通過(guò)在0.2微米聚醚砜(PES)過(guò)濾器上過(guò)濾除去嗜熱側(cè)飽霉菌絲和殘余的纖維素。然后,濃縮經(jīng)過(guò)濾的培養(yǎng)液,并使用IOkDa分子量的阻隔(MWCO)PES膜(Millipore，Billerica, MA)，通過(guò)切向流過(guò)濾而緩沖液更換至25mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基乙磺酸(HEPES)的緩沖液pH 7.4中。然后，將濃縮的培養(yǎng)液與過(guò)量的纖維素混合，從而除去纖維素-結(jié)合蛋白，并通過(guò)在玻璃微纖維過(guò)濾器上進(jìn)行真空過(guò)濾來(lái)分離纖維素顆粒。然后，以5mL/min的速率將濾液加載到5mLQ Sepharose高效(Q HP)陰離子交換柱(GE Healthcare)上。接著,使用超過(guò)15個(gè)柱體積的、范圍在O至0.5M NaCl的氯化鈉(NaCl)線性濃度梯度，由Q HP柱上洗脫醛內(nèi)酯酶。然后，收集柱的級(jí)份，并測(cè)試形成的醛內(nèi)酯酶活性(參見(jiàn)上文)。將具有最高的醛內(nèi)酯酶活性的級(jí)份合并，并緩沖液更換至25mM HEPES緩沖液pH 7.4中。隨后，將包含蛋白質(zhì)的各個(gè)級(jí)份加載至Mono Q? 10/100GL高效陰離子交換色譜柱(GE Healthcare)上，并使用超過(guò)8個(gè)柱體積的、范圍在O至0.5M NaCl的NaCl線性濃度梯度進(jìn)行洗脫。將包含醛內(nèi)酯酶活性的分級(jí)合并，并調(diào)節(jié)至1.5M硫酸銨和25mM HEPES, pH 7.4。然后，將各個(gè)樣品加載至
1.0mL RES0URCE?PHE輸水相互作用色譜柱(GE Healthcare)上。醛內(nèi)酯酶不會(huì)與PHE柱結(jié)合，因此作為純的物質(zhì)種類流過(guò)。濃縮經(jīng)純化的醛內(nèi)酯酶，并使用IOkDaMWCO離心濃縮儀(Millipore)進(jìn)行緩沖液更換，`并存放在_80°C下。在這些條件下，醛內(nèi)酯酶的活性能穩(wěn)定數(shù)月。
[0111]酶的測(cè)試.如Hestrin所述測(cè)量醛內(nèi)酯酶的活性(21)。在96孔微量滴定板上以3個(gè)重復(fù)實(shí)施所述的反應(yīng)。簡(jiǎn)言之，在25°C下，將IOOyL IOOmM新溶解的糖內(nèi)酯與在IOOmM乙酸鈉pH 5.0中緩沖的100 μ L IOnM醛內(nèi)酯酶混合I分鐘。通過(guò)在I分鐘內(nèi)加入40 μ L堿性羥胺(2.0M鹽酸羥胺，1.5Μ氫氧化鈉)使所述的反應(yīng)淬火。然后，加入20微升4.0M鹽酸以酸化所得的溶液，并使糖氧肟酸鹽穩(wěn)定。通過(guò)加入20 μ L 0.5Μ氯化鐵(FeCl3)顯色，并在540nm下測(cè)量吸光率。對(duì)于所有的實(shí)驗(yàn)而言，在對(duì)照樣品上進(jìn)行對(duì)照測(cè)量，其中所述的對(duì)照樣品中未加入酶。在酶存在下，由總水解中減去背景水解。這通常達(dá)到總內(nèi)酯的不到10%。
[0112]質(zhì)譜肽指紋圖譜.將36毫克脲、5 μ L IOOmM DTT和5 μ L 1.0Μ Tris (pH 8.5)加入到10 μ M醛內(nèi)酯酶的100 μ L水性溶液中，并在70°C加熱I小時(shí)。在熱變性之后，將700 μ L25mM重碳酸銨和140 μ L甲醇加入到所述的溶液中，然后使用處于50mM乙酸鈉(pH 5.0)的50yL 100yg/mL胰島素處理。在37°C下，將所得的蛋白質(zhì)用胰島素過(guò)夜消化。消化后，采用真空濃縮儀減小體積，并用經(jīng)純化的去離子水洗滌3次。通過(guò)OMIX?微提取吸管尖端，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)除去樣品中殘余的鹽(Varian，PaloAlto, CA)。使用串聯(lián)質(zhì)譜來(lái)分析得自胰島素消化的肽，其中所述的串聯(lián)質(zhì)譜與所述的超高效液相色譜在線連接(22)。
[0113]蛋白質(zhì)的液相色譜-質(zhì)譜分析.使用1200系列液相色譜(LC ;Agilent, SantaClara, CA)來(lái)分析蛋白質(zhì)樣品，其中所述的1200系列液相色譜與裝配有1n Max?電噴霧離子源(ESI ；Thermo Fisher Scientific, Waltham,MA)的 LTQ Orbitrap XL? 雜交質(zhì)譜在線連接。
[0114]LC 裝配有 C8 保護(hù)柱(Poroshell 300SB-C8，5 μ m，12.5 X 2.1mm，Agilent)、分析柱(75X0.5mm)和100 μ L樣品環(huán)。LC溶劑A包含0.1 %甲酸/99.9%水(ν/ν)，溶劑B包含0.1%甲酸/99.9%乙腈(ν/ν)。將在使用橡膠隔墊蓋密封的自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中所裝有的樣品溶液在分析之前加入到Agilent 1200自動(dòng)進(jìn)樣器的樣品倉(cāng)中。對(duì)于各樣品而言，將約100皮摩爾的蛋白質(zhì)分析物注入到所述的柱上。在注入樣品之后，在5分鐘內(nèi)，使用99.5%溶劑A，以90μ L/min的流動(dòng)速率進(jìn)行分析物的誘捕。洗脫程序包括:經(jīng)歷24.5min，線性濃度梯度范圍為30%至95%的溶劑B;在等強(qiáng)度條件下，在95%溶劑B中溫育5分鐘；經(jīng)歷
0.5min，線性濃度梯度范圍為0.5 %溶劑B的溶劑B ;在等強(qiáng)度條件下；以及在等強(qiáng)度條件下，在0.5%溶劑B中以90 μ L/min的流動(dòng)速率溫育9.5min。將所述的柱和樣品倉(cāng)分別保持在35°C和10°C下。僅包含經(jīng)純化的、去離子水的空白溶劑在樣品之間運(yùn)行，并在注入各樣品之后使用經(jīng)純化的、去離子水漂洗自動(dòng)進(jìn)樣器注入針以避免樣品間的交叉污染。
[0115]使用PEEK? 管(0.005”1.d.X 1/16” 0.d., Western Analytical, LakeElsinore,CA)來(lái)形成LC柱的出口與質(zhì)譜的ESI探針之間的連接。在分析之前，使用包含咖啡因、肽MRFA和Ultramark丨62廠混合物的標(biāo)準(zhǔn)LTQ MS校正混合物來(lái)進(jìn)行外標(biāo)質(zhì)量校正，其中所述的Ultramark丨62 I '!浞合物為氟化磷腈溶解于51 %乙腈/25 %甲醇/23 %水/I %乙酸溶液(ν/ν)中。ESI源的參數(shù)如下:離子遷移毛細(xì)溫度為275 °C，常態(tài)鞘氣(氮?dú)?流動(dòng)速率為25%，ESI電壓為2.5kV，離子遷移毛細(xì)電壓為33V，以及套管透鏡電壓為125V。使用Orbitrap?質(zhì)量分析儀(以圖譜格式，其中全MS自動(dòng)增益控制靶物設(shè)定為5X105電荷，分辨率設(shè)定為6XlO4(m/z = 400，F(xiàn)WHM))，在m/z = 500至2000的范圍內(nèi)，以正離子模式記錄質(zhì)譜。使用Xcalibur?軟件(4.1版，Thermo),處理原始質(zhì)譜,并使用ProMassu軟件(2.5SR-1版，Novatia, Monmouth Junction, NJ)對(duì)測(cè)量的電荷狀態(tài)分布去卷積,其中所述的ProMass?軟件使用了缺省“大蛋白”參數(shù)并且背景差因子為1.5。
[0116]天然蛋白質(zhì)的納升電噴霧質(zhì)譜.使用裝配有Z-spray"電噴霧(ESI)源(Q-TofPremier?, Waters, Milford, MA)的四極桿-飛行時(shí)間(Q-Tof)質(zhì)譜來(lái)獲取天然蛋白質(zhì)的質(zhì)樸。使用正離子納升電噴霧(nanoESI)由包含10 μ M分析物蛋白質(zhì)和IOmM乙酸銨的水性溶液形成離子。由硼娃玻璃毛細(xì)管(1.0mm 0.d./0.78mm 1.d, Sutter Instruments,Novato, CA)來(lái)形成NanoESI發(fā)射器,其中所述的毛細(xì)管被Flaming/Brown微電極控制儀(Model P-87，Sutter)控制在內(nèi)直徑為約5至20 μ m的尖端。使用10 μ L注射器(Hamilton，Reno, NV)將約10 μ L的各種樣品溶液加入到nanoESI發(fā)射器中。通過(guò)逐漸增加施加到鉬絲(0.127mm直徑,Aldrich, Milwaukee, WI)上的DC電動(dòng)勢(shì)、直到質(zhì)譜信號(hào)開(kāi)始出現(xiàn)來(lái)開(kāi)啟電噴霧，其中所述的鉬絲被插入到nanoESI發(fā)射器的尖端約2mm內(nèi)。在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中的設(shè)備參數(shù)如下:nanoESI電壓為1.8kV，取樣錐電壓為30V，提取錐和離子導(dǎo)向電壓均為4.0V,離子源溫度為80°C，進(jìn)入到氬光電池的加速電壓為2V，離子遷移級(jí)電壓為6X10_3mbar，IS光電池電壓為8Xl(T3mbar,以及Tof分析儀電壓為8Xl(T7mbar。通過(guò)調(diào)節(jié)￡；(1\\^_丨也1{>Speedivalve真空值將一級(jí)泵中的電壓增加7.4mbar，從而有利于氣相中非共價(jià)絡(luò)合物的保存。未使用錐氣流。在“V”模式下操作Tof分析儀。在測(cè)量之前即刻進(jìn)行Tof分析儀的外標(biāo)質(zhì)量校正。使用MassL ynx?軟件(4.1版，Waters)處理質(zhì)譜。
[0117]多序列比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)生學(xué).針對(duì)由已經(jīng)完成及正在進(jìn)行的真菌基因組項(xiàng)目得到的預(yù)測(cè)真菌蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)，使用基礎(chǔ)定點(diǎn)比對(duì)搜尋工具(BLAST ;23)查詢?nèi)﹥?nèi)酯酶序列來(lái)找到嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶蛋白質(zhì)的同源基因。通過(guò)BLAST，針對(duì)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechnology Information(NCBI))的數(shù)據(jù)庫(kù)得到原核生物的序列。使用T-COFFEE多序列比對(duì)軟件，定點(diǎn)進(jìn)行多序列比對(duì)(24)。使用3.0版的PHYlogenetic Inferences Using Maximum Likelihood(PhyML)軟件測(cè)定最大概似法的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)(通過(guò)Phylogeny.fr網(wǎng)頁(yè)服務(wù)器具有100個(gè)解靴帶(25))。
[0118]mRNA-Seq表達(dá)概況.在生長(zhǎng)20小時(shí)之后，由嗜熱側(cè)飽霉分離信使RNA，并按照標(biāo)準(zhǔn)的方案根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)形成Illmnina? cDNA文庫(kù)(26)。在Illumina.1 GenomeAnalyzer II高通量測(cè)序系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)序。序列讀取長(zhǎng)度修整為31nt，并使用MAQ基因組短序列讀取比對(duì)軟件，針對(duì)嗜熱側(cè)飽霉基因組中的所有預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行繪圖(27)。通過(guò)計(jì)算每千個(gè)外顯子模式的堿基對(duì)所繪制的讀取數(shù)量除以在整個(gè)數(shù)據(jù)組RPKM中繪制讀取的總數(shù)來(lái)對(duì)表達(dá)進(jìn)行歸一化(28)。圖譜必須使31-nt mRNA序列與由基因組序列通過(guò)計(jì)算確定的預(yù)測(cè)全長(zhǎng)mRNA序列匹配。如果基因是聞表達(dá)的，則存在由Solexa測(cè)序(其與所述基因序列匹配)而生成的許多片段。相反，如果基因表達(dá)水平低，則極少的Solexa讀值與所述的基因序列匹配。
[0119]結(jié)果
[0120]編碼嗜熱側(cè)孢霉胞外醛內(nèi)酯酶I的基因的長(zhǎng)度為1，491堿基對(duì)，并包含3個(gè)內(nèi)含子。開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度為1，206堿基對(duì)，并編碼了 401個(gè)氨基酸的多肽，該多肽的計(jì)算質(zhì)量為42，509Da。此外，還具有3個(gè)所預(yù)計(jì)的N-連接糖基化位點(diǎn)(30)。事實(shí)上，在所預(yù)計(jì)的糖基化區(qū)域中未檢測(cè)到肽，因此提供了 N-連接的糖基化的證據(jù)。
[0121]重組嗜熱側(cè)孢霉醛內(nèi)酯酶I的純化和性質(zhì).圖5示出了純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析。醛內(nèi)酯酶的表觀分子量為50-60kDa，并且重組酶與下文所述的經(jīng)純化的內(nèi)源蛋白質(zhì)具有相似的活性。
[0122]重組嗜熱側(cè)孢霉醛內(nèi)酯酶I的純化和性質(zhì).由在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的嗜熱側(cè)飽霉的培養(yǎng)液中分離嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶活性，其中所述的豐富培養(yǎng)基包含纖維素作為碳源。分5步進(jìn)行嗜熱側(cè)飽霉醛內(nèi)酯酶的純化(表1)。將醛內(nèi)酯酶純化25倍，總產(chǎn)率為25%。2個(gè)重要的純化步驟為Q HP離子交換色譜和PHE疏水相互作用色譜。經(jīng)純化的醒內(nèi)酯酶的SDS-PAGE表明分子量為約48kDa(圖6)。完整的醛內(nèi)酯酶的液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析顯示多種物質(zhì)集中在約44kDa，并且質(zhì)量差為約162道爾頓，這與己糖亞基的質(zhì)量相當(dāng)(圖7)。該結(jié)果表明蛋白質(zhì)糖基化的存在，其為真菌分泌的胞外蛋白質(zhì)中普通的翻譯后修飾。在IOmM乙酸銨中醛內(nèi)酯酶的天然蛋白質(zhì)LC-MS分析表明所述的蛋白質(zhì)在溶液中為單體，這符合凝膠過(guò)濾的停留時(shí)間。
[0123]表1.內(nèi)源嗜熱側(cè)孢霉醛內(nèi)酯酶I的純化.[0124]
【權(quán)利要求】
1.一種重組多肽，包含 GPRH 模體(SEQ ID NO:9)和 DPTGxF/Y 模體(SEQ ID NO:10),其中所述多肽具有內(nèi)酯酶活性。
2.權(quán)利要求1所述的重組多肽，包含SEQID NO:1的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的重組多肽，包含SEQID NO:2的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的重組多肽，包含SEQID NO:3的氨基酸序列。
5.包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重組多肽的組合物。
6.權(quán)利要求5所述的組合物，還包含至少一種另外的多肽。
7.權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述至少一種另外的多肽是纖維二糖脫氫酶(CDH)。
8.權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述至少一種另外的多肽是葡萄糖氧化酶(GOX)。
9.一種包含與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的多核苷酸序列的表達(dá)載體，所述多核苷酸序列編碼權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的多肽。
10.一種包含權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體的組合物。
11.一種包含權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
12.—種包含權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞的組合物。
13.權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞選自真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
14.一種制備重組多肽的方`法，包括: (a)提供包含載體的宿主細(xì)胞群，其中所述的載體包含編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO: 10)，并且其中所述多肽具有內(nèi)酯酶活性；以及 (b)在一定條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞群，由此所述載體的所述多肽得以表達(dá)。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多肽包含所述SEQID NO:1的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多肽包含所述SEQID NO:2的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多肽包含所述SEQID NO:3的氨基酸序列。
18.權(quán)利要求14-17所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
19.一種制備醛糖酸的方法，包括:使己糖-δ-內(nèi)酯底物與包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)的重組多肽接觸，其中所述多肽具有內(nèi)酯酶活性。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述重組多肽包含所述SEQID NO:1的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述重組多肽包含所述SEQID NO:2的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述重組多肽包含所述SEQID NO:3的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求19-22所述的方法，其中所述己糖-δ-內(nèi)酯底物選自纖維二糖酸-δ -內(nèi)酯、葡糖酸-δ_內(nèi)酯和內(nèi)酯酸-δ -內(nèi)酯
24.一種降解生物質(zhì)的方法，包括:使所述生物質(zhì)與權(quán)利要求5-8、10或12所述的組合物接觸。
25.一種使生物質(zhì)解構(gòu)的方法，包括:使所述生物質(zhì)與權(quán)利要求5-8、10或12所述的組合物接觸，從而使所述生物質(zhì)解構(gòu)。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述生物質(zhì)包含植物材料。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述植物材料選自細(xì)葉芒、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、蘆華、小麥桿、大麥桿、加拿大稻草、燕麥稻、玉米稻、豆稻、燕麥皮、燕麥、高粱、稻殼、蔗渣、玉米纖維、大麥、燕麥片、亞麻、小麥、亞麻籽、桔漿、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆、棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾膠、黃豆、可溶性酒精糟濾液(DDGS)、須芒草、玉米穗、松樹(shù)、針葉樹(shù)軟木、桉樹(shù)、樺木、柳樹(shù)、白楊、楊木、雜交楊木、能源甘蔗、短周期木本作物、作物殘茬、庭院廢物或其組合。
28.一種食品處理方法，包括:使植物材料與權(quán)利要求5-8、10或12所述的組合物接觸，從而產(chǎn)生可消化的植物材料。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述可消化的植物材料喂養(yǎng)動(dòng)物。
30.一種食品添加劑，包含權(quán)利要求5-8、10或12所述的組合物。
31.一種織物清潔方法，包括:使弄污的織物與權(quán)利要求5-8、10或12所述的組合物接觸，從而產(chǎn)生清潔的織物。
32.—種紙漿漂白方法，包括:使紙漿與權(quán)利要求5-8、10或12所述的組合物接觸，從而產(chǎn)生漂白的紙漿。
【文檔編號(hào)】C12P7/58GK103562400SQ201180033714
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2010年7月30日
【發(fā)明者】W·T·畢森, J·H·多納凱特, M·A·馬萊塔 申請(qǐng)人:加州大學(xué)評(píng)議會(huì)