一種產(chǎn)強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的制備方法，屬于酶制劑制備【技術領域】。以產(chǎn)強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌1398-2-12為出發(fā)菌株，并進行培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進，經(jīng)特定發(fā)酵條件下的液體深層混合發(fā)酵而制備的中性蛋白酶酶活力為5500-7000U/mL；適用溫度范圍為30-75℃，最適反應溫度70℃，在75℃酶活完全穩(wěn)定；適用反應pH值范圍為4.5-8.5，最適反應pH值為7.2。比現(xiàn)有的中性蛋白酶熱穩(wěn)定性強，酶活力較高，更適應工業(yè)化需求。
【專利說明】一種產(chǎn)強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵【技術領域】，具體是一種產(chǎn)強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌。
【背景技術】
[0002]蛋白酶是生物體內的一類酵素(酶)，它們能夠分解蛋白質。分解方法是打斷那些將氨基酸連結成多肽鏈的肽鍵。抑制蛋白酶活性的小分子化合物被稱為蛋白酶抑制劑。許多病毒蛋白酶的抑制劑是很有效的抗病毒藥。蛋白酶是水解蛋白質肽鍵的一類酶的總稱。按其水解多肽的方式，可以將其分為內肽酶和外肽酶兩類。內肽酶將蛋白質分子內部切斷，形成分子量較小的際和胨。外肽酶從蛋白質分子的游離氨基或羧基的末端逐個將肽鍵水解，而游離出氨基酸，前者為氨基肽酶后者為羧基肽酶。按其活性中心和最適PH值，又可將蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反應的最適pH值，分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。
[0003]蛋白酶廣泛存在于動物內臟、植物莖葉、果實和微生物中。微生物蛋白酶主要由霉菌、細菌，其次由酵母、放線菌生產(chǎn)。
[0004]酶的應用已有千年以上的歷史，雖然中性蛋白酶是最早為人類所發(fā)現(xiàn)并應用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑之一，但是廣泛應用還是最近幾十年的事。隨著科學技術的發(fā)展，隨著酶的制備、酶和細胞固定化、酶分子改造等酶技術的發(fā)展，中性蛋白酶的應用范圍也不斷擴大。自上世紀以來，世界各國科研工作者一直都致力于中性蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選、酶提取、純化以及酶學性質的研究和應用研究工作，取得了一定的成績。
[0005]從目前國內中性蛋白酶發(fā)展以及研究報道來看，我國中性蛋白酶的研究總體水平來說仍處于一個起步階段。大量研究表明，微生物發(fā)酵生產(chǎn)及遺傳工程技術將合成特定氨基酸的基因克隆進入微生物細胞·質粒中，從而借助某些微生物增殖生產(chǎn)等，中性蛋白酶已廣泛應用，這些方法具有產(chǎn)量較高、生產(chǎn)周期短、成本低等優(yōu)點。采用基因工程與傳統(tǒng)的微生物育種方式結合來提高菌種產(chǎn)酶量是一條值得繼續(xù)探索的發(fā)展途徑。綜合過去已經(jīng)取得的成績以及在研究中存在的問題，今后發(fā)展的方向主要有以下幾個方面:1.繼續(xù)通過基因工程與傳統(tǒng)的微生物育種技術進一步提高微生物產(chǎn)酶能力。2.采用酶體外定向技術改變酶的底物特異性與適應性，如底物親和力、pH適應性、耐熱性以及耐氧化性等等，為開拓酶的新應用領域做出貢獻。3.繼續(xù)尋找產(chǎn)中性蛋白酶新的菌種，特別是極端微生物源中性蛋白酶顯得尤為重要。4.在應用方面，繼續(xù)開發(fā)酶的應用領域，同時，積極開展理論與應用研究，為此酶在食品與其它行業(yè)的發(fā)展中如何做出更大貢獻，將是未來營養(yǎng)研究的重要領域，必將為食品與其它行業(yè)高效、持續(xù)、穩(wěn)定發(fā)展開辟新的廣闊前景。
[0006]國內目前從事中性蛋白酶生產(chǎn)與銷售的酶制劑企業(yè)很少，主要是由于所采用生產(chǎn)菌種大多為上世紀八十年代所開發(fā)的誘變菌株，產(chǎn)酶能力下降、不太穩(wěn)定、部分優(yōu)良性狀出現(xiàn)部分退化或喪失，且易受到酵母及噬菌體的污染，對生產(chǎn)造成一定程度的影響。加之，目前我國中性蛋白酶發(fā)酵單位相對較低，濃縮成本高，不便保存與運輸，而且，通常情況下，酶保存技術屬商業(yè)機密，因此，有關中性蛋白酶酶保藏的研究仍是一個值得研究的領域。如何獲得新的產(chǎn)中性蛋白酶菌株、提高菌株產(chǎn)酶能力以及如何保藏酶將成為一個發(fā)展方向。
[0007]中國專利CN1289659C公開了一種產(chǎn)高溫中性蛋白酶的地衣芽孢桿菌及其制備高溫中性蛋白酶的工藝和高溫中性蛋白酶，所述中性蛋白酶適用反應溫度為50-70°C，最適反應溫度為65°C，適用pH值為5-8，最適pH值為7.0-7.2。在50°C保溫I小時酶活力下降10%，在60°C下酶的半衰期45分鐘。
[0008]中性蛋白酶是能催化蛋白質肽鍵水解，最適作用pH值在7.0左右的蛋白酶。中性蛋白酶由于具有催化反應速度快、無工業(yè)污染、催化反應條件適應性較寬等性質和優(yōu)點，被應用于食品、制藥、化妝品、洗滌劑、絲紡、毛皮軟化等行業(yè)，但是由于中性蛋白酶熱穩(wěn)定性差，生產(chǎn)與使用條件復雜，限制了它進一步應用的范圍，進一步優(yōu)化選育產(chǎn)中性蛋白酶的優(yōu)良菌株對中性蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)具有十分重要的意義，尤其中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性、耐酸堿性等酶學特性仍是本行業(yè)技術人員最為關注的問題之一。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1398-2-12。
[0010]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌1398-2-12是由實驗室保藏的一株產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1398_2經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變篩選獲得。
[0011]本發(fā)明提供的產(chǎn)強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的菌株具體為枯草芽孢桿菌1398-2-12。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學生命科學學院郵編:430072)，保藏號為CCTCC NO:M2013539,分類名枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)。
[0012]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12菌株特點如下:
[0013]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實驗成陽性。
[0014]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌1398-2-12具有所產(chǎn)中性蛋白酶耐受溫度高、適用pH值范圍寬泛的特點，發(fā)酵液粗酶液75°C酶活完全穩(wěn)定，最適反應溫度70°C，pH值4.5-8.5酶活穩(wěn)定，最適反應pH值7.2。該菌株最適生長PH值7.0-7.2，最適生長溫度30-36°C，最適產(chǎn)酶溫度32-35 °C。
[0015]按誘變篩選方案，對突變株逐級篩選淘汰，最后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選，得到一株產(chǎn)強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的菌株枯草芽孢桿菌菌1398-2-12，發(fā)酵液中性蛋白酶酶活可達5500-7000U/mL，對酶的熱穩(wěn)定性進行了分析，將粗酶液分別置于40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔 10 分鐘取樣測定酶活。40°C、45°C、50°C、55°C下，60分鐘酶活沒有下降。60°C與65°C下，30分鐘降到原有酶活的95%，60分鐘降到85%。70°C下，30分鐘降到原有酶活的85%，60分鐘降到80%。75°C下，30分鐘降到原有酶活的80%,60分鐘降到70%。
[0016]有益效果:本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌1398-2-12具有產(chǎn)中性蛋白酶耐受溫度高、適用pH值范圍寬泛的特點，經(jīng)篩選過程培養(yǎng)基優(yōu)化，與出發(fā)菌株相比生長迅速，發(fā)酵液中性蛋白酶酶活可達5500-7000U/mL，比出發(fā)株酶活力提高78.5%。該菌株分泌的中性蛋白酶可耐受較高溫度，粗酶液401:、451:、501:、551:下，60分鐘酶活沒有下降。60°C與65°C下，30分鐘降到原有酶活的95%，60分鐘降到85%。70°C下，30分鐘降到原有酶活的85%，60分鐘降到80%。75°C下，30分鐘降到原有酶活的80%，60分鐘降到70%，同樣條件下達到同樣酶活耐受溫度比出發(fā)菌平均提高了 5-10°C。該菌株所產(chǎn)中性蛋白酶pH值4.5-8.5酶活穩(wěn)定，比出發(fā)菌株所產(chǎn)中性蛋白酶的PH值5-8范圍寬泛。
【具體實施方式】
[0017]下面通過具體的實施方式敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方式應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方式中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0018]實施例1
[0019]本發(fā)明產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株具體為1398-2-12。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學生命科學學院郵編:430072)，保藏號為CCTCC NO:M2013539，分類命名為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12。
[0020]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌1398-2-12由實驗室保藏的一株產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌1398-2經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變篩選獲得。
[0021]實施例2產(chǎn)強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶菌株的篩選方法，包括以下步驟
[0022](1)菌懸液的制備
[0023]將枯草芽孢桿菌1398-2斜面菌種在平板劃線分離后長出的單菌落接入種子培養(yǎng)100r/min, 35°C培養(yǎng)12h后,取ImL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗漆兩次，并重懸于9mL生理鹽水中。
[0024](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變
[0025]將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將經(jīng)過照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置35°C培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于35°C震蕩處理40min，將處理過的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
[0026](3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0027]將上述涂布均勻的平板，置35°C培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌1398-2-12，1398-2-2，1398-2-3 ；
[0028](4)搖瓶發(fā)酵復篩
[0029]將獲得的三株菌1398-2-12，1398-2-2, 1398-2-3在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V/V)，35°C、100r/min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上清液制得粗酶液。
[0030](5)酶活測定
[0031]酶活力單位定義:lmL粗酶液，于70°C、pH7.2條件下，Imin水解酪蛋白產(chǎn)生I μ g酪氨酸，即為I個酶活力單位，以U/mL表示。
[0032]經(jīng)測定，菌株1398-2-12為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達到6000U/mL。
[0033]該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學生命科學學院郵編:430072)，保藏號為CCTCCNO:M2013539o
[0034]所述氯化鋰平板培養(yǎng)基組成為:淀粉10g，蛋白胨10g，(NH) 2S044g, K2HP048g,CaCl22g，氯化鋰 9g，瓊脂 20g,蒸餾水 1000mL, pH 值 7.2，121°C 滅菌 20min ；
[0035]所述種子培養(yǎng)基組成為:牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，NaCllOg，蒸餾水 1000 mL, pH 值 7.2，121°C 滅菌 20min ；
[0036]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉50_150g，豆餅粉 40_100g，(NH)2S044g, K2HP048g,CaCl22g,蒸餾水 1000mL, pH 值 7.2，121°C 滅菌 20min ；
[0037]實施例3:產(chǎn)強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶出發(fā)菌株篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化
[0038](一 )菌株
[0039]出發(fā)菌株選擇的是篩選結果最佳的1398-2-12菌株，發(fā)酵72小時后中性蛋白酶活可達 6000U/mL。
[0040]( 二 )培養(yǎng)基優(yōu)化`
[0041]對篩選菌株過程中的氯化鋰平板培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)基優(yōu)化，以優(yōu)化前相同的發(fā)酵條件發(fā)酵72小時，經(jīng)檢測，發(fā)酵液粗酶液中性蛋白酶活可達7000U/mL。
[0042]氯化鋰優(yōu)化平板培養(yǎng)基組成為:淀粉10g，蛋白胨10g，(NH) 2S044g, K2HP048g,CaCl22g，氯化鋰9g，中草藥粉劑5-20g,瓊脂20g,蒸餾水1000mL, pH值7.2，121 °C滅菌20min ；
[0043]種子優(yōu)化培養(yǎng)基組成為:牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，NaCllOg,中草藥粉劑15-20g，蒸餾水lOOOmL，pH值7.2，121 °C滅菌20min ;發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基:玉米粉 50-150g,豆餅粉 40-100g, (NH)2S044g, K2HP048g, CaCl22g，中草藥粉劑 15_25g，蒸餾水lOOOmL, pH 值 7.2，121°C滅菌 20min ；
[0044]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0045]稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10_15份；黃芩10_15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；
[0046]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1-1.5。
[0047]實施例4:中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性分析
[0048]對酶的熱穩(wěn)定性進行了分析，將實施例3粗酶液分別置于40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔10分鐘取樣測定酶活。粗酶液40 V、45°C、50°C、55°C下，60分鐘酶活沒有下降。60°C與65°C下，30分鐘降到原有酶活的95%，60分鐘降到85%。70°C下，30分鐘降到原有酶活的85%，60分鐘降到80%。75°C下，30分鐘降到原有酶活的80%，60分鐘降到70%，同樣條件下達到同樣酶活耐受溫度比出發(fā)菌平均提高了 5-10°C，比優(yōu)化培養(yǎng)基前的篩選菌株提高了 3-5°C。
[0049]實施例5:中性蛋白酶pH穩(wěn)定性分析
[0050]對酶的pH穩(wěn)定性進行了分析，將實施例3粗酶液分別置于pH值3.5,4.5,5.5、6.5、7.5、8.5下，每隔10分鐘取樣測定酶活。粗酶液pH值5.5、6.5、7.5下，60分鐘酶活沒有下降。pH值4.5與8.5下，30分鐘降到原有酶活的95%，60分鐘降到85%。pH值3.5下，30分鐘降到原有酶活的80%，60分鐘降到70%。同樣條件下達到同樣酶活耐pH值比出發(fā)菌和優(yōu)化培養(yǎng)基前的篩選菌株明顯寬泛。
【權利要求】
1.一種產(chǎn)強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12,該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2013539。
2.如權利要求1所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)中的應用。
3.如權利要求2所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)中的應用，其特征在于，氯化鋰優(yōu)化平板培養(yǎng)基組成為:淀粉10g，蛋白胨10g，(NH)2S044g, K2HP048g, CaCl22g，氯化鋰 9g，中草藥粉劑 5_20g，瓊脂 20g，蒸餾水 1000mL, pH值 7.2。
4.如權利要求2所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)中的應用，其特征在于，種子優(yōu)化培養(yǎng)基組成為:牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉 10g, NaCllOg,中草藥粉劑 15-20g，蒸餾水 1000mL, pH 值 7.2。
5.如權利要求2所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)中的應用，其特征在于，發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基組成為:玉米粉50-150g，豆餅粉40-100g，(NH)2S044g，K2HP048g，CaCl22g，中草藥粉劑 15_25g，蒸餾水 lOOOmL，pH 值 7.2。
6.如權利要求3-5任一所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)中的應用，其特征在于，所述中草藥粉劑的制備方法如下: 稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60V~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
7.如權利要求6所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)中的應用，其特征在于，所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1-1.5。
【文檔編號】C12R1/125GK103667150SQ201310683912
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權日:2013年12月13日
【發(fā)明者】李洪兵, 張錦杰, 朱永明, 孫明芳, 陳香, 劉德鳳 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司