一種宮頸癌人半翼基因熒光定量rt-pcr試劑盒及非診斷性檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種宮頸癌人半翼基因熒光定量RT-PCR試劑盒及非診斷性檢測(cè)方法,其中包括宮頸癌人半翼基因熒光定量RT-PCR的檢測(cè)的引物、探針的核苷酸序列設(shè)計(jì)，樣品要求的控制、樣品RNA提取液中微量hWAPL和β-actin基因DNA存在影響的消除、宮頸癌mRNA熒光PCR檢測(cè)——質(zhì)控品、定量參考品、內(nèi)參照質(zhì)控品等的制備和應(yīng)用，臨界值標(biāo)定,以及針對(duì)目前hWAPL基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性的缺陷，提供一種宮頸癌人半翼基因熒光定量RT-PCR非診斷性檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法具有特異、靈敏、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。
【專利說明】—種宮頸癌人半翼基因熒光定量RT-PCR試劑盒及非診斷性檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種宮頸癌人半翼基因熒光定量RT-PCR試劑盒及非診斷性檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一，目前宮頸癌仍然是導(dǎo)致我國(guó)婦女死亡的主要原因之一，且宮頸癌的發(fā)生率有上升和年輕化趨勢(shì)。
[0003]目前，醫(yī)院普遍采用傳統(tǒng)的宮頸癌檢測(cè)是針對(duì)宮頸癌的具體癥狀或已有病變進(jìn)行TCT+HPV檢查，這種方法僅在形態(tài)上檢測(cè)癌細(xì)胞是否存在，不足以確證癌細(xì)胞，而對(duì)于沒有產(chǎn)生癌變的細(xì)胞，更不能檢測(cè)。宮頸癌基因檢測(cè)可以深入對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行剖析，對(duì)確認(rèn)癌細(xì)胞存在提供有力的證明。
[0004]hWAPL基因是Verni等在2000年發(fā)現(xiàn)果蠅體內(nèi)半翼基因，并在人體內(nèi)的存在同源序列。目前研究表明，hWAPL基因在宮頸癌組織中過度表達(dá)。hWAPL在宮頸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常宮頸組織以及各類癌組織，相對(duì)于HPV感染來說，hWA PL的表達(dá)與宮頸癌關(guān)系可能更為密切。
[0005]目前文章發(fā)表的宮頸癌hWAPL基因熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，在于設(shè)計(jì)一對(duì)引物、熒光探針或SYBRGreenren的DNA染色，進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)，在質(zhì)量控制方法方面，僅局限于使用內(nèi)參基因。這些文章的研究?jī)H停留在研究階段，距離在臨床檢測(cè)宮頸癌變，將此提高到一項(xiàng)實(shí)用性、可推廣、商品化技術(shù)，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，特別在質(zhì)量控制層面研究更加不夠，由于質(zhì)量控制問題，在檢測(cè)臨床樣本時(shí)可能造成假陽(yáng)性和假陰性，由此阻礙這項(xiàng)檢測(cè)方法在臨床樣本檢測(cè)的應(yīng)用和推廣。
[0006]本專利改進(jìn)現(xiàn)有hWA PL基因mRNA熒光定量RT — PCR技術(shù)，使之具有特異、靈敏、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等的特點(diǎn)，提出一種質(zhì)量控制系列方法的組合，這一系列質(zhì)控方法的組合消除了 hWA PL基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)的假陽(yáng)性和假陰性，提高了該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和在臨床實(shí)驗(yàn)診斷的實(shí)用性，并對(duì)其它基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)的臨床實(shí)驗(yàn)診斷的實(shí)用性提高，也有重要參考價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供了一種宮頸癌人半翼基因熒光定量RT-PCR試劑盒，包括:引物，熒光探針，陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品，DEPC水，hWAPL定量參考品，β -actin定量參考品，逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，RNasin, MgCl2, Taq酶，甘油，dNTP, PCR緩沖液。
[0008]本發(fā)明的目的是針對(duì)目前hWA PL基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性的缺陷，提供一種宮頸癌人半翼基因熒光定量RT-PCR非診斷性檢測(cè)方法，具有特異、靈敏、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等的特點(diǎn)。
[0009]為了達(dá)到上述目的， 本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:[0010]一種宮頸癌人半翼基因熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括:
[0011]引物，熒光探針，陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品，DEPC 7jC, hWAPL定量參考品，β -actin定量參考品，逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，RNasin, MgCl2, Taq酶，甘油，dNTP, PCR緩沖液。
[0012]所述的引物如下:
[0013]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)宮頸癌人半翼基因熒光定量RT-PCR的引物和熒光探針，具體如下: hW~A5! - gatga agaac ttgac ctcaa t -3! hW~B5! - tccaa cagca caagt gagat tc -3! actin-A5! - tcctc cctgg agaag agcta c -3! actin-B5! - cactg tgttg gcgta caggt c -3! 基因特異性引物 hw_c5' -gttgt tccaa cagca caagt g~3f 基因特異性引物actin-c 5' -agaca gcact gtgtt ggcgt ac ~3f ； hW-RY 5, -FAM- acaca tggag gattg cattg tggc_TAMRA_3'； actin - Y 5! -FAM- acggc caggt catca ccatt ggc -TAMRA-3! 0
2.權(quán)利要求1所述引物和熒光探針在制備宮頸癌人半翼基因熒光定量RT-PCR試劑盒中的應(yīng)用。
3.利用權(quán)利要求1所述引物和熒光探針或權(quán)利要求2所述試劑盒檢測(cè)宮頸癌人半翼基因表達(dá)量的非診斷性檢測(cè)方法，具體如下: 1)提取RNA 按常規(guī)方法抽提樣本、陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品RNA ； 抽提的RNA —部分作為hWAPL和β -actin的空白對(duì)照； 樣本中疑似癌變的細(xì)胞與正常細(xì)胞數(shù)比例需大于10:1 ; 2)逆轉(zhuǎn)錄 hffAPLmRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA引物序列如下: 基因特異性引物 hW_c: 51 -gttgt tccaa cagca caagt g-31 β -actin mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA引物序列如下: 基因特異性引物actin-c: 5' -agaca gcact gtgtt ggcgt ac -3! 3)熒光定量PCR:標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率值的比值計(jì)算 將hWA PL基因和β — actin基因質(zhì)粒DNA 10倍稀釋，獲得各濃度的hWA PL基因和β — actin基因定量參考品，及其各濃度的與CT值的標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，hWA PL基因和β — actin基因定量參考品的斜率比值R=hWA PL基因的DNA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/β —actin檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率； 所述的hWA PL基因定量參考品和β — actin基因定量參考品為含有靶基因的pUCm-T載體質(zhì)粒； hWAPL基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物和探針如下: hff-Rl5' - gatga agaac ttgac ctcaa t -3' hff-R25' - tccaa cagca caagt gagat tc -3' hff-RY5' -FAM- acaca tggag gattg cattg tggc-TAMRA-3' β -actin基因?qū)崟r(shí)突光定量PCR檢測(cè)引物和探針序列和探針如下: actin-A5' - tcctc cctgg agaag agcta c -3' actin-B5' - cactg tgttg gcgta caggt c -3' actin - Y5' -FAM- acggc caggt catca ccatt ggc -TAMRA-3' 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中hWAPL，β - actin基因的拷貝數(shù)/ml分別為Al和A2 ;空白對(duì)照中的hWAPL，β - actin基因的拷貝數(shù)分別為Alc和A2c ；4)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算以hWAPL和β — actin基因的實(shí)際拷貝數(shù)/ml的比值判斷檢測(cè)結(jié)果，比值計(jì)算如下:B1/ B2= (Al-Alc) XR/ (A2_A2c)臨界值=2.5B1/ B2≥4 檢測(cè)結(jié)果判斷為陽(yáng)性；B1/ B2 ≤ 2.5 檢測(cè) 結(jié)果判斷為陰性；.2.5<B1/ B2<4檢測(cè)比值在灰區(qū)，需重測(cè)一次，如仍在2.5-4.0，檢測(cè)結(jié)果判斷為陽(yáng)性。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103642926SQ201310680848
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】李貴玲, 李亦武, 糜克永 申請(qǐng)人:武漢格瑞生物工程有限公司