一種提高米曲霉gh11木聚糖酶耐熱性的定向進化方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種常溫的木聚糖酶熱穩(wěn)定性改造、突變木聚糖酶工程菌構建以及突變木聚糖酶的高效表達的方法。根據(jù)來源于A.oryzae?CICC40186木聚糖酶Aoxyn11A的空間結構設計突變S108C和N152C，得到突變木聚糖酶：Aoxyn11AELJ，其成熟肽基因序列為SEQ?ID?NO：1，108C和152C可以形成一個跨二級結構的二硫鍵。實驗結果表明突變后該酶熱穩(wěn)定性有了明顯的提高，作為一種耐熱型的酶制劑，該木聚糖酶具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟價值。
【專利說明】一種提高米曲霉GH11木聚糖酶耐熱性的定向進化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及米曲霉(Aspergillus oryzae) CICC4018菌株的常溫木聚糖酶(AoXynllA)基因熱穩(wěn)定改造，突變木聚糖酶工程菌的構建及重組突變木聚糖酶的高效表達，屬于生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]木聚糖酶(EC3.2.1.8)是一類重要的工業(yè)用酶。它主要是作用于木聚糖主鏈，隨機地切開木聚糖內(nèi)部的木糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要為不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最關鍵的酶。近幾年，由于木聚糖酶在飼料工業(yè)、食品加工及釀造等行業(yè)具有潛在的工業(yè)應用和經(jīng)濟價值，尤其是在工業(yè)造紙上的應用，減少因漂白產(chǎn)生的環(huán)境污染，受到了越來越多的關注。然而在許多工業(yè)中，木聚糖酶都需要在高溫條件下進行操作，因此對木聚糖酶耐熱性的研究也引起了國內(nèi)外研究的高度重視。開發(fā)耐熱型木聚糖酶的研究主要包括篩選超耐熱的木聚糖酶生產(chǎn)菌和利用基因工程對酶分子進行定向改造，相對于篩菌技術的盲目性，后者具有更強的針對性，受到國內(nèi)外學者的青睞。
[0003]根據(jù)木聚糖酶催化區(qū)域的結構和性質分析，可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于G/11家族的木聚糖酶分子量較小，且結構比較簡單，更適合作為理論研究的分子模型，可以用于極端條件下木聚糖酶催化模式系統(tǒng)及蛋白質分子折疊機理等的研究。基因工程技術、生物信息學以及計算機科學的快速發(fā)展，為分子生物學的研究開辟了新的前景。我們可以運用大規(guī)模高性能的計算機及其相關軟件，結合基因工程手段，利用模擬試驗對酶分子進行定向改造以提高熱穩(wěn)定性，加速木聚糖酶在各種領域中的應用過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種常溫的木聚糖酶熱穩(wěn)定性改造、突變木聚糖酶工程菌構建以及突變木聚糖酶的高效表達的方法。
[0005]本發(fā)明的技術方案:根據(jù)來源于A.0ryzae CICC40186木聚糖酶AoXynllA的空間結構設計突變S108C和N15 2C，得到突變木聚糖酶:AoXynllAEU，其成熟肽基因序列為SEQID N0:1，108C和152C可以形成二硫鍵。
[0006]所述的由成熟肽基因編碼得到的AoXynl IAeu氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
[0007]所述的重組木聚糖酶的活性測定方法:
[0008]于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH4.6、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的質量濃度為0.5%的樺木木聚糖(Sigma, USA)溶液2.4mL, 50°C預熱1Omin,在A管中加入0.1mL適當稀釋的酶液，50°C準確反應15min;立即各加入2.5H1L3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從木糖標準曲線上查出相應的還原糖(以木糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義:在本測定條件下，以每分鐘產(chǎn)生I μ mo I還原糖所需的酶量定義為I個木聚糖酶活性單位(IU)。
[0009]所述的耐熱雜合木聚糖酶基因的設計、克隆及表達:
[0010](I)突變基因Aoxynl IAeu及其表達質粒的構建:根據(jù)GenBank上AoxynllA的基因序列設計引物F1, F2, F3, R1:
[0011]F1:5/ -GAATTCTCCACACCCAGTAGCAC-3'，含 EcoR I 酶切位點
[0012]F2:5 ’ -CCTACAAGGGCCAGGTTACCTGTGACGGAGGC-3，，
[0013]F3:5 ’ -TCACTACGGGGTGTCATTTCAATGCGTGGGCT-3，，
[0014]R1:5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位點
[0015]以本實驗室保存的pUCm-T-AoxynllA為模板，以匕札為兩組引物進行第一輪PCR ；以本實驗室保存的pUCm-T-AoxynllA為模板，以F1和第一輪PCRl產(chǎn)物為引物進行第二輪PCR ;以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以F2和R1為引物進行第三輪PCR。以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以F1和第三輪PCR產(chǎn)物為引物進行第四輪PCR。將第四輪PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-A0XynllAEU)。轉化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。
[0016]將測序結果正確的pUCm-T_AoxynllAEIJ和pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-AoxynllAELJ(圖1),并對重組表達質粒進行序列測定。
[0017](2)GS115/AoxynllAELJ重組子的構建、表達及酶活的測定:用Sal I對pPIC9K-AoxynlIAelj進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GSl 15/AoxynlIAeu ;按照手冊上的標準流程進行誘導表達；發(fā)酵液經(jīng)初步純化后使用SDS-PAGE檢測目的蛋白分子量。
[0018]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供了一種新型簡便的通過構建二硫鍵提升木聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法，改造后得到的突變木聚糖酶命名為AoXynllAEU，其相應的基因為Aoxynl IAeu，其熱穩(wěn)定性有了一定提高，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應用潛力以及經(jīng)濟價值，也為其它木聚糖酶的研究奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1:重組質粒pPIC9K_AoxynllAEIJ的構建示意圖【具體實施方式】
[0020]以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0021]實施例1突變基因Aoxynl IAeu及其表達質粒的構建
[0022]采用大引物PCR技術構造融合基因，主要分為四步:以本實驗室保存的pUCm-T-AoxynllA為模板，以F3, R1為兩組引物進行第一輪PCR(94 V 5min ;2個循環(huán)，940C 30s, 450C 30s, 72°C 30s ；28 個循環(huán) 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin ;1(TC保存);以本實驗室保存的pUCm-T-AoxynllA為模板，以F1和第一輪PCRl產(chǎn)物為引物進行第二輪 PCR(94°C 5min ;2 個循環(huán)，94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 60s ；28 個循環(huán) 94°C 30s, 55°C 30s,72°C 60s ；72°C IOmin ;10°C保存)；以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以F2和R1為引物進行第三輪 PCR(94°C 5min ；2 個循環(huán)，94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 60s ；28 個循環(huán) 94°C 30s, 55°C 30s,72°C 60s ；72°C IOmin ; 10°C保存)。以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以F1和第三輪PCR產(chǎn)物為引物進行第四輪 PCR(94°C 5min ;2 個循環(huán)，94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 60s ；28 個循環(huán) 94°C 30s,55°C 30s, 72°C 60s ；72°C IOmin ; 10°C保存)。將第四輪PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-A0XynllAEU)，轉化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。將測序正確的pUCm-T-AoxynllAEU與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-AoxynllAELJ,并對重組表達質粒進行序列測定，送去上海生工測序。
[0023]實施例2GS115/AoxynllAEU重組子的構建、表達及酶活的測定
[0024]用Sal I對pPIC9K-AoXynllAEU進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AoXynllAEU。該工程菌用1.0%甲醇誘導72h。離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經(jīng)SDS-PAGE檢測為單一條帶，改造后木聚糖酶最適反應溫度為60°C，熱穩(wěn)定性較原酶也有 了一定提高。
【權利要求】
1.一種改造后的源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC40186、歸屬于糖苷水解酶第11家族的木聚糖酶基因AoxynllAEU，其對應的基因和蛋白質序列分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2o
2.突變木聚糖酶工程菌的構建方法和表達方法: (I)突變基因Aoxynl IAeu及其表達質粒的構建:根據(jù)GenBank上AoxynllA的基因序列設計引物F1, F2, F3, R1:
F1:5/ -GAATTCTCCACACCCAGTAGCAC-3'，含 EcoR I 酶切位點 F2:5’ -CCTACAAGG GCCAGGTTACCTGTGACGGAGGC-3’，
F3:5’ -TCACTACG GGGTGTCATTTCAATGCGTGGGCT-3’， R1:5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位點以本實驗室保存的pUCm-T-AoxynllA為模板，以F3, R1為兩組引物進行第一輪PCR ；以本實驗室保存的pUCm-T-AoxynllA為模板，以F1和第一輪PCRl產(chǎn)物為引物進行第二輪PCR ；以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以F2和R1為引物進行第三輪PCR ；以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以F1和第三輪PCR產(chǎn)物為引物進行第四輪PCR ;將第四輪PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-AoXynllAEU);轉化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序； 將測序結果正確的pUCm-T-AoxynllAELJ和pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-AoxynllAELJ(圖1)，并對重組表達質粒進行序列測定； ⑵GS115/AoxynllAEU重組子的構建、表達及酶活的測定:用Sal I對pPIC9K-AoxynlIAelj進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GSl 15/AoxynlIAeu ;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用1.0%甲醇誘導72h ;離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經(jīng)SDS-PAGE檢測均為單一條帶，重組木聚糖酶最適反應溫度為60°C。
【文檔編號】C12N9/42GK103642776SQ201310666411
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權日:2013年12月10日
【發(fā)明者】龐慶豐, 劉曉彤, 殷欣, 姚瑤, 李劍芳, 鄔敏辰 申請人:江南大學