鱖魚傳染性脾腎壞死病毒lamp檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)快速檢測(cè)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明含有10×等溫反應(yīng)緩沖液、BstDNA聚合酶8U/μL、10mMdNTP、25mM硫酸鎂、10μM內(nèi)引物1、10μM內(nèi)引物2、10μM外引物1、10μM外引物2、30μM環(huán)引物1、30μM環(huán)引物2和5M甜菜堿的反應(yīng)液A和反應(yīng)液B：1000×的熒光染料SYBRGreenI。通過對(duì)組織樣品中鱖魚傳染性脾腎壞死病毒DNA提取、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、產(chǎn)物的顯色檢測(cè)等方法，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的快速檢測(cè)。本技術(shù)解決了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、需要昂貴儀器等缺點(diǎn)，適用于養(yǎng)殖場(chǎng)、獸醫(yī)站等的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
【專利說明】鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)快速檢測(cè)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鱖魚(Siniperca chuatsi))是中國(guó)的名優(yōu)淡水養(yǎng)殖品種，其肉質(zhì)鮮美，享有“淡水石斑”之稱。隨著鱖養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，病害問題益發(fā)突出，其中又以鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV )引起的危害最大?？?jī)魚傳染性脾腎壞死病毒具有很強(qiáng)的致病性，流行快、發(fā)病率高，并且目前尚無有效的控制措施，一般10天內(nèi)鱖魚的死亡率達(dá)90%左右。由于鱖魚傳染性脾腎壞死病毒感染還沒有真正有效的治療手段，因此，病毒的及時(shí)檢測(cè)對(duì)于鱖魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展十分重要。
[0003]國(guó)內(nèi)外常用的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒檢測(cè)方法有常規(guī)組織學(xué)方法(HE染色)、電鏡觀察、分離外源核酸和核酸探針原位雜交技術(shù)等。這些檢測(cè)相對(duì)耗時(shí)比較長(zhǎng)、技術(shù)要求高、工作量大。而目前普遍采用的PCR法雖然特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是容易交叉污染，且操作繁瑣和需要價(jià)格較高的PCR儀等專業(yè)設(shè)備，限制了其應(yīng)用。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)雖然解決了常規(guī)PCR檢測(cè)方法的交叉污染問題，并簡(jiǎn)化了操作步驟，但卻需要更昂貴的實(shí)時(shí)定量PCR設(shè)備，且PCR熒光探針的成本也較高，大大限制了其應(yīng)用。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplication, LAMP)技術(shù)是Notmi等(2000年)開發(fā)出來的一種連續(xù)、恒溫、基于酶反應(yīng)的新型核酸擴(kuò)增方法，其原理是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)兩對(duì)特殊的內(nèi)、外引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)在恒溫(60~65°C)條件下啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)。在祀標(biāo)DNA區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成,結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。LAMP反應(yīng)過程中從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)液`中的Mg2+結(jié)合，形成副產(chǎn)物焦磷酸鎂呈現(xiàn)乳白色沉淀，加入顯色液即可肉眼觀察判斷沉淀與否。4條引物針對(duì)靶序列的6個(gè)特異性區(qū)域識(shí)別，保證了 LAMP方法的高度特異性；本方法可檢測(cè)到只及PCR法的1/10~1/100的拷貝數(shù)，靈敏度高；LAMP反應(yīng)只需在恒定溫度下反應(yīng)即可，不需要預(yù)先的DNA變性等步驟，耗時(shí)短；本方法也不需要昂貴的儀器設(shè)備，只需一臺(tái)水浴鍋，投資小。因此，LAMP法檢測(cè)非常適合于基層單位的檢測(cè)需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是解決現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒所需周期長(zhǎng)、現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用困難、特異性低和靈敏性低的問題，提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的檢測(cè)試劑盒及方法，可廣泛用于鱖魚養(yǎng)殖場(chǎng)、基層檢測(cè)單位等的現(xiàn)場(chǎng)疾病診斷。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
根據(jù)GenBank中所公布的來源于世界各地鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的核酸序列中同源性較高的部位，設(shè)計(jì)并合成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增用所用的特異性引物組。該引物組在實(shí)際應(yīng)用中可實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床鱖魚傳染性脾腎壞死病毒特異性診斷。我們對(duì)該引物組進(jìn)一步開發(fā)成鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒。
[0007]一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分:
(1)反應(yīng)液A:含有IOX等溫反應(yīng)緩沖液、Bst DNA聚合酶8U/ii L、10mM dNTP、25mM硫酸鎂、IOii M內(nèi)引物UlOiiM內(nèi)引物2、IOii M外引物1、IOii M外引物2、30yM環(huán)引物1、30 ii M環(huán)引物2和5M甜菜堿，其中:
IOX等溫反應(yīng)緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.8)、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%的曲拉通X-100。
[0008]內(nèi)引物 1: CTAGACTGGGCCACCACCTCATTTTGTCTGTGATGGGCACTTACG
內(nèi)引物 2:TCATTGAACAGTGCCAGGTGGCTTTTAGGTCCAGATGCACCAAAG
外引物 1:1TGGCAATGTAGCACCCG
外引物 2:AAGAACAAGGCCTTCACGG

_環(huán)引物 1: GCTCCTCGCTTGTCAGTACAG 一
環(huán)引物 2:CGTCACGCCCGCAGACAAT
(2)反應(yīng)液B:1000X的熒光染料SYBR Green I。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)方案是:
一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒方法，其步驟包括:
(I)樣品中DNA的提取
采用商業(yè)化的基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行組織中鱖魚傳染性脾腎壞死病毒DNA的制備，作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的DNA模板。
[0010](2)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的等溫環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增
在裝有23 ii I反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入2 ii I待檢DNA,于65 °C恒溫水浴鍋中放置40mino
[0011](3)擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)
在上述反應(yīng)管中加入Iu I反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒，若顏色為黃色，則說明待檢樣品中不含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)`在:本發(fā)明根據(jù)GenBank中所公布的來源于世界各地的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的核酸序列中同源性較高的八個(gè)序列部位設(shè)計(jì)了六條環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所用的特異性引物組。并依據(jù)此引物組建立了一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強(qiáng)，比目前普遍采用的PCR檢測(cè)方法有更高的靈敏度，同時(shí)也不需要昂貴的PCR儀、電泳儀和凝膠成像儀等設(shè)備，僅采用一臺(tái)水浴鍋即可，特別適于基層單位的推廣應(yīng)用。
[0013]下面提供具體的實(shí)例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果，但本發(fā)明的技術(shù)應(yīng)用不限于實(shí)例。
【具體實(shí)施方式】[0014]下面對(duì)本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法進(jìn)行具體的描述。
[0015]實(shí)施例1擴(kuò)增引物組的獲得
根據(jù)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒基因組序列中MCP基因相對(duì)保守的區(qū)域設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增用引物組。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載10株來源于世界不同地區(qū)的傳染性胰腺壞死病毒的核酸序列，對(duì)應(yīng) Accession Number 如下:AF371960.1、JQ253372.1、HQ317465.1、AY989901.UJQ253373.UJF264349.UAB666344.UJF264350.UKC244182.UEU847416.1。利用序列分析軟件Clustal X進(jìn)行同源性比較，在同源性最高的八個(gè)區(qū)域用在線的PrimerExplorer V4生物軟件設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增用引物,并利用Primer Premier 5.0生物軟件中的引物分析功能對(duì)所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行各項(xiàng)參數(shù)的具體分析，最終確定本發(fā)明的6條環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增用引物組，并進(jìn)一步以其為核心制備檢測(cè)試劑盒。
[0016]實(shí)施例2鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒 按下列配方制作鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒:
1、LAMP反應(yīng)液A:含有IOX等溫反應(yīng)緩沖液、Bst DNA聚合酶8U/y L、IOmM dNTP、25mM硫酸鎂、IOii M內(nèi)引物UlOiiM內(nèi)引物2、IOii M外引物1、IOii M外引物2、30yM環(huán)引物1、30 ii M環(huán)引物2和5M甜菜堿，其中:
IOX等溫反應(yīng)緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.8)、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%的曲拉通X-100。
[0017]內(nèi)引物 1:CTAGACTGGGCCACCACCTCATTTTGTCTGTGATGGGCACTTACG
內(nèi)引物 2:TCATTGAACAGTGCCAGGTGGCTTTTAGGTCCAGATGCACCAAAG
外引物 1:1TGGCAATGTAGCACCCG
外引物 2:AAGAACAAGGCCTTCACGG

_環(huán)引物 1: GCTCCTCGCTTGTCAGTACAG 一
環(huán)引物 2:CGTCACGCCCGCAGACAAT
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液A管每管23 ii L,最佳配比為:2.5 y L IOX等溫反應(yīng)緩沖液、1.0ii L Bst DNA 聚合酶(8U/ii L)、3.L IOmM dNTP,5u L 25mM 硫酸鎂、2.0 y LIOiiM 內(nèi)引物 1、2.0ii L 1011]?內(nèi)引物2、0.5111 10 y M 外引物 1、0.5 y L IOyM 外弓丨物 2、
0.5u L 3011]?環(huán)引物1、0.5111 3011]?環(huán)引物2、5.0111 5M 甜菜堿。
[0018]2、反應(yīng)液 B:1000X 的熒光染料 SYBR Green I。
[0019]實(shí)施例3鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒方法
上述鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒方法，其步驟包括:
1、樣品中DNA的提取
采用商業(yè)化的基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行組織中鱖魚傳染性脾腎壞死病毒DNA的制備，作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的DNA模板。
[0020]2、鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的等溫環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增 在裝有23 ii I反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入2 ii I待檢DNA,于65 °C恒溫水浴鍋中放置40mino
[0021]3、擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)在上述反應(yīng)管中加入Iu I反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒，若顏色為黃色，則說明待檢樣品中不含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒。
[0022]實(shí)施例4鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒的敏感性檢驗(yàn)
將鱖魚傳染性脾腎壞死病毒0SGIV75株的MCP基因PCR擴(kuò)增出來，構(gòu)建入pMD18_T質(zhì)粒。以提取的含MCP基因的質(zhì)粒按10倍梯度稀釋作為模板，采用本發(fā)明的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立常規(guī)的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒PCR檢測(cè)方法作為對(duì)照(上游引物:ATGTCTGCAATCTCAGGT，下游引物:TTACAGGATAGGGAAGCCTG,擴(kuò)增程序:50 °C 孵育 lh，94 °C 5min, 94 °C 30s, 58 °C 30s, 72 °C30s, 72°C 5min，35個(gè)循環(huán))。結(jié)果表明在I U g樣品DNA稀釋到1012次方時(shí)，依然能檢測(cè)到信號(hào)，說明本試劑盒具有極高的靈敏性。而常規(guī)PCR稀釋到107次方時(shí)就無信號(hào)了。
[0023]實(shí)施例5鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒的特異性檢驗(yàn)
利用鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)及其他常見病毒如魚出血性敗血病病毒(VHS)、魚傳染性造血器官壞死病毒(IHN)進(jìn)行檢測(cè)。
[0024]具體操作同實(shí)施例3的具體方法，結(jié)果顯示，本發(fā)明的試劑盒中僅對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒有特異性檢測(cè)結(jié)果，對(duì)其他病原微生物檢測(cè)均為陰性，說明本發(fā)明的試劑盒特異性良好。 [0025]實(shí)施例6鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)臨床樣品的檢測(cè)
采集臨床上懷疑鱖魚傳染性脾腎壞死病毒感染的病料18份，分別利用本試劑盒按實(shí)施例3的具體方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)分別對(duì)18份病料進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)。
[0026]結(jié)果表明，本試劑盒檢測(cè)的18份鱖魚病料中8份鱖魚傳染性脾腎壞死病毒陽(yáng)性，與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果一致。
【權(quán)利要求】
1.一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分: (1)反應(yīng)液A:含有IOX等溫反應(yīng)緩沖液、Bst DNA聚合酶8U/ii L、10mM dNTP、25mM硫酸鎂、IOii M內(nèi)引物UlOiiM內(nèi)引物2、IOii M外引物1、IOii M外引物2、30yM環(huán)引物1、30 ii M環(huán)引物2和5M甜菜堿，其中: IOX等溫反應(yīng)緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.8)、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%的曲拉通X-100 ；
內(nèi)引物 1:CTAGACTGGGCCACCACCTCATTTTGTCTGTGATGGGCACTTACG
內(nèi)引物 2:TCATTGAACAGTGCCAGGTGGCTTTTAGGTCCAGATGCACCAAAG 外引物 1:1TGGCAATGTAGCACCCG 外引物 2:AAGAACAAGGCCTTCACGG 環(huán)引物 1:GCTCCTCGCTTGTCAGTACAG 環(huán)引物 2:CGTCACGCCCGCAGACAAT (2)反應(yīng)液B:1000X的熒光染料SYBR Green I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于反應(yīng)液A每管23 ii L的組成為:2.5 ii L 10 X等溫反應(yīng)緩沖液、1.0 y L Bst DNA聚合酶(8U/u L),3.5u L IOmM dNTP,5u L 25mM 硫酸鎂、2.0 y L 10 y M 內(nèi)引物 1、2.0 y L IOuM內(nèi)引物 2、0.5iiL 1011]?外引物1、0.5111 1011]?外引物2、0.5111 30 y M 環(huán)引物 1、0.5 y L3011]?環(huán)引物2、5.01^ 5M甜菜堿。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒方法，其步驟包括: (1)樣品中DNA的提取 采用商業(yè)化的基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行組織中鱖魚傳染性脾腎壞死病毒DNA的制備，作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的DNA模板； (2)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的等溫環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增 在裝有23 ii I反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入2 ii I待檢DNA,于65 °C恒溫水浴鍋中放置40min ； (3)擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè) 在上述反應(yīng)管中加入Iu I反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒，若顏色為黃色，則說明待檢樣品中不含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103667532SQ201310652799
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】侯竹美, 方華華, 豐艷妮, 王鳳舞, 王金葉 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)