谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為生產(chǎn)菌株，好氧富集菌株的同時固定菌株。當(dāng)菌體生長至對數(shù)期末期后，將種子培養(yǎng)基倒掉，加入發(fā)酵培養(yǎng)基厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，厭氧發(fā)酵過程中利用的CO2以Na2CO3和CO2的形式提供。厭氧發(fā)酵至葡萄糖含量小于5g/L時，換成新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)。以此方法，可實現(xiàn)至少15批丁二酸的固定化發(fā)酵。通過本發(fā)明的方法，在不增加設(shè)備投入和節(jié)省能耗的前提下，菌株固定化后，可反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)生丁二酸，節(jié)省了種子培養(yǎng)的時間，提高了發(fā)酵效率，節(jié)省了成本，為丁二酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的技術(shù)支持。
【專利說明】谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物及發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丁二酸能作為合成許多通用化學(xué)品的基礎(chǔ)原料，比如1，4-丁二醇、己二酸、四氫呋喃和一些可生物降解的聚合物，比如聚丁烯丁二酸和聚丁烯丁二酸己二酸酯。目前主要利用礦物燃料通過化學(xué)合成方法生產(chǎn)丁二酸，這種方法的環(huán)境成本很高，尤其是CO2的排放量很大。在礦物燃料的價格猛漲和環(huán)境意識增強的情況下，用生物過程合成丁二酸會變得更加經(jīng)濟和可行。
[0003]丁二酸是一些厭氧菌和兼性厭氧菌厭氧發(fā)酵時的終產(chǎn)物。發(fā)酵菌株是丁二酸生物合成的關(guān)鍵點之一，多數(shù)細菌和真菌都能產(chǎn)生丁二酸。目前，丁二酸工業(yè)發(fā)酵菌株的研究主要集中在丁二酸厭氧螺菌，丁二酸放線桿菌以及大腸桿菌等。[0004]為了讓生物合成丁二酸可行和經(jīng)濟，必須培養(yǎng)更多既能高產(chǎn)丁二酸又能耐受高濃度的丁二酸同時能夠利用簡單的培養(yǎng)基的菌株，因為微生物的生長對氨基酸和復(fù)雜營養(yǎng)物質(zhì)的需求會阻礙丁二酸的回復(fù)。為了達到這一目的，對上述產(chǎn)丁二酸微生物的改進或者利用其它微生物發(fā)展新的生物公藝是不可避免的。
[0005]谷氨酸棒狀桿菌是一種生長迅速、不運動的革蘭氏陽性菌，它在微生物發(fā)酵產(chǎn)氨基酸和核酸的工藝中有很長的歷史。許多谷氨酸棒桿菌的基因組序列已經(jīng)被公布。在厭氧條件下，谷氨酸棒桿菌的細胞生長被抑制，但是該細胞依然能夠代謝糖類產(chǎn)有機酸，比如L-乳酸，丁二酸和乙酸。
[0006]Shohei Okino等人用發(fā)酵罐，蠕動泵和陶瓷過濾器組成細胞循環(huán)反應(yīng)器。這個過程需要添加一個陶瓷過濾器組件，準(zhǔn)備過程相對復(fù)雜。
[0007]最近，一種將細胞固定在纖維基質(zhì)表面的生物膜反應(yīng)器具有比表面積高，孔隙率高，成本低，穩(wěn)定性強和吸附效果良好的特點，已成功地用于生產(chǎn)多種有機酸，如乳酸、丁酸、正丁醇和霉酚酸。此外，生物膜反應(yīng)器可以為細胞提供對剪切應(yīng)力的抵抗力，還能不斷更新細胞群。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法。
[0009]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0010]谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，以谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032為生產(chǎn)菌株,先進行好氧富集,再進行厭氧發(fā)酵
生產(chǎn)丁二酸；
[0011]其中，在好氧富集的種子培養(yǎng)基中添加40_60g/L的固定化材料，菌株在好氧富集階段即開始邊生長邊固定，待菌體生長至對數(shù)期末期，將種子培養(yǎng)基過濾倒掉，保留固定化材料，加入發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁二酸，厭氧發(fā)酵至葡萄糖含量小于5g/L時，將厭氧培養(yǎng)基過濾倒掉，保留固定化材料，然后加入新的發(fā)酵培養(yǎng)基，進行反復(fù)批次發(fā)酵。
[0012]其中，所述的固定化材料為棉纖維織物、無紡布、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、沸石、細菌纖維素膜、絲綢、甘蔗渣和玉米秸桿中的任意一種或幾種的組合。
[0013]其中，所述的種子培養(yǎng)基組分為:葡萄糖10-30g/L，KH2PO4 5-lOg/L，K2HPO4 ? 3H2010-20g/L, MgSO4 ? 7H20 l_5g/L，MnSO4 ? H2O 0.1-0.5g/L, FeSO4 ? H2O 0.1-0.5g/L,尿素20-30g/L，生物素 100-300 ii g/100ml，維生素 BI 100-300 y g/100ml，初始 pH7.5。
[0014]其中，好氧富集培養(yǎng)過程采用搖瓶培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度為30-3 5 °C，培養(yǎng)時間為12-24h，轉(zhuǎn)速為200rpm;好氧富集培養(yǎng)過程采用發(fā)酵罐培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度為30-35°C，通氣量為l-2vvm，培養(yǎng)時間為12-24h，轉(zhuǎn)速為350rpm，發(fā)酵罐通氣攪拌的溶氧范圍控制在30%-60%，優(yōu)選為 45%。
[0015]其中，好氧富集培養(yǎng)過程采用搖瓶培養(yǎng)時，將固定化材料平鋪在搖瓶底部，培養(yǎng)基裝液量能將固定化材料浸沒；好氧富集培養(yǎng)過程采用發(fā)酵罐培養(yǎng)時，將固定化材料固定在擋板內(nèi)側(cè)。
[0016]其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:葡萄糖30_60g/L，Na2CO3 30_60g/L，NaCl 9g/L，初始pH7.5。
[0017]其中，厭氧發(fā)酵培養(yǎng)過程采用搖瓶培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度為30-35 °C，培養(yǎng)時間為30-50h，轉(zhuǎn)速為150rpm ;厭氧發(fā)酵培養(yǎng)過程采用發(fā)酵罐培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度為30_35°C，CO2通氣量為0.2-0.5vvm，培養(yǎng)時間為30-50h，轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵罐通氣攪拌的溶氧范圍控制在10%-20%，優(yōu)選為15%。
[0018]其中，在厭氧發(fā)酵培養(yǎng)過程中通過添加6M NH3 ? H2O將pH值控制在7-8。
[0019]在本發(fā)明之前，生物膜反應(yīng)器從未被使用在以谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)丁二酸的研究中。 申請人:首先在搖瓶中嘗試谷氨酸棒桿菌的固定化，發(fā)現(xiàn)固定化的菌株的生長速率及葡萄糖消耗速率高于游離培養(yǎng)的菌株，同時發(fā)現(xiàn)從零時刻開始固定的效果好于從對數(shù)生長期中期開始固定的菌株。
[0020]目前谷氨酸棒桿菌產(chǎn)丁二酸的研究中在厭氧階段大多使用NaHCO3作為中和劑，但是NaHCO3存在熱穩(wěn)定性差、不能滅菌、溶解度小的缺點，使得實驗過程費力且容易染菌。 申請人:對幾種中和劑(NaHCO3、KHCO3> Na2CO3^ CaCO3、堿式碳酸鎂)進行對比實驗，發(fā)現(xiàn)使用Na2CO3時葡萄糖的消耗速率甚至高于NaHCO3,且丁二酸產(chǎn)率高。Na2CO3熱穩(wěn)定性較強，可以經(jīng)受121°C高溫滅菌。
[0021 ] 以Na2CO3作為中和劑在搖瓶及7.5L發(fā)酵罐中進行反復(fù)批次發(fā)酵實驗時，谷氨酸棒桿菌菌體能保持較長時間的活性以及較高的丁二酸產(chǎn)率。
[0022]當(dāng)菌株的生產(chǎn)能下降時，可以將發(fā)酵培養(yǎng)基過濾倒掉之后，再重新加入種子培養(yǎng)基先進行好氧富集，再進行多批次厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。
[0023]本發(fā)明的有益效果:
[0024]1.本發(fā)明發(fā)明了一種谷氨酸棒桿菌固定化發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，利用纖維(棉纖維織物、無紡布、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、細菌纖維素膜、絲綢、甘蔗渣和玉米秸桿)作為固定化材料，固定的菌體可以反復(fù)利用。能夠進行反復(fù)批次發(fā)酵。[0025]2.本發(fā)明篩選了一種高效且操作簡便的中和劑Na2CO3用于厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸。Na2CO3熱穩(wěn)定性強，可以經(jīng)受121°C高溫滅菌。分批發(fā)酵時丁二酸產(chǎn)量可達30-40g/L，對葡萄糖的質(zhì)量收率可達75-85%。與傳統(tǒng)利用的NaHCO3相比菌體產(chǎn)酸能力穩(wěn)定且不易染菌。
[0026]3.本發(fā)明采用的方法，能夠以較高的葡萄糖消耗速率產(chǎn)丁二酸，且副產(chǎn)物乳酸、乙酸的產(chǎn)量很低。在發(fā)酵罐中進行反復(fù)批次發(fā)酵時，丁二酸產(chǎn)量可達30-40g/L，對葡萄糖的質(zhì)量收率可維持在75%以上。
【具體實施方式】
[0027]根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
[0028]以下實施例使用的分析方法如下:
[0029]發(fā)酵液中的產(chǎn)物丁二酸、乙酸、乳酸、丙酮酸采用Agilent 1200高效液相色譜儀測定，色譜柱為Sepax HP-C18柱(4.6*250mm, 5 u m),流動相:含1%乙腈的500mM磷酸二氫鉀溶液，pH以磷酸調(diào)至3.0，柱溫:35°C，檢測波長:210nm，流速:0.8mL ? mirT1，進樣量:10 u L。
[0030]葡萄糖含量用SBA 分析儀測定(model SBA-40C, Jinan, China)。
[0031]實施例1:
[0032]LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂20g/L，其余為水。
[0033]種子培養(yǎng)基:葡萄糖12g/L，KH2PO4 5g/L，K2HPO4 ? 3H20 15g/L，MgSO4 ? 7H20 0.4g/L，MnSO4 ? H2O 0.2g/L，F(xiàn)eSO4 ? H2O 0.2g/L，尿素 25g/L，生物素 100 u g/100ml，維生素B1200ii g/100ml，其余為水，初始 pH7.5。
[0034]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖38g/L，NaHCO3 35g/L，NaCl 9g/L，其余為水，初始pH7.5。
[0035]使用LB培養(yǎng)基活化甘油管保存的菌株ATCC13032，與培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)24h后二次活化12h。用接種環(huán)各刮一大環(huán)菌于三種培養(yǎng)條件(游離、零時刻添加40g/L的纖維、8h添加40g/L的纖維)的IL搖瓶中，種子培養(yǎng)基裝液量為150ml。瓶口以八層紗布扎口好氧培養(yǎng)。種子培養(yǎng)12h后,游離的種子經(jīng)4000rpm, IOmin離心獲取細胞后將菌體加入發(fā)酵培養(yǎng)基中。固定化的菌體皆將培養(yǎng)基倒掉后用鑷子輕柔押擠盡量除去培養(yǎng)基，之后倒入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為150ml。瓶口以保鮮膜、八層紗布及牛皮紙扎口以形成厭氧環(huán)境，每次取樣時通CO2以除去空氣。
[0036]游離培養(yǎng)、零時刻固定以及8h固定(對數(shù)生長期中期)的種子生長時初糖濃度均為12g/L，葡萄糖的消耗速率分別為0.625，0.833，0.667g/h，發(fā)酵培養(yǎng)基初糖濃度均為38g/L, 丁二酸的產(chǎn)量分別為16.33，28.61，23.44g/L。可以看出零時刻固定的菌體葡萄糖消耗速率最快，且丁二酸廣率最聞。
[0037]實施例2:
[0038]LB培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基的配方同實施例1，其中種子初糖提高到20g/L。種子按照零時刻固定的方法培養(yǎng)。分別添加相同質(zhì)量的纖維材料用作菌體固定化，按照實施例1的方法進行分批發(fā)酵。
[0039]表1用不同固定化材料進行分批發(fā)酵谷氨酸棒桿菌產(chǎn)丁二酸[0040]
【權(quán)利要求】
1.谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為生產(chǎn)菌株，先進行好氧富集，再進行厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸； 其中，在好氧富集的種子培養(yǎng)基中添加40-60g/L的固定化材料，菌株在好氧富集階段即開始邊生長邊固定，待菌體生長至對數(shù)期末期，將種子培養(yǎng)基過濾倒掉，保留固定化材料，加入發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁二酸，厭氧發(fā)酵至葡萄糖含量小于5g/L時，將厭氧培養(yǎng)基過濾倒掉，保留固定化材料，然后加入新的發(fā)酵培養(yǎng)基，進行反復(fù)批次發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，所述的固定化材料為棉纖維織物、無紡布、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、沸石、細菌纖維素膜、絲綢、甘蔗渣和玉米秸桿中的任意一種或幾種的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)基組分為:葡萄糖10-30g/L，KH2PO4 5-10g/L, K2HPO4 ? 3H20 10_20g/L, MgSO4 ? 7H20 l-5g/L, MnSO4 ? H2O 0.1-0.5g/L, FeSO4 ? H2O 0.1-0.5g/L，尿素 20_30g/L，生物素 100-300 ii g/100ml，維生素 BI 100-300 ii g/100ml，初始 pH7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，好氧富集培養(yǎng)過程采用搖瓶培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度為30-35°C，培養(yǎng)時間為12-24h，轉(zhuǎn)速為200rpm ;好氧富集培養(yǎng)過程采用發(fā)酵罐培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度為30_35°C，通氣量為l-2vvm，培養(yǎng)時間為12-24h，轉(zhuǎn)速為350rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，好氧富集培養(yǎng)過 程采用搖瓶培養(yǎng)時，將固定化材料平鋪在搖瓶底部，培養(yǎng)基裝液量能將固定化材料浸沒；好氧富集培養(yǎng)過程采用發(fā)酵罐培養(yǎng)時，將固定化材料固定在擋板內(nèi)側(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:葡萄糖30-60g/L，Na2CO3 30_60g/L，NaCl 9g/L，初始pH7.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，厭氧發(fā)酵培養(yǎng)過程采用搖瓶培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度為30-35°C，培養(yǎng)時間為30-50h，轉(zhuǎn)速為150rpm ;厭氧發(fā)酵培養(yǎng)過程采用發(fā)酵罐培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度為30-35°C，CO2通氣量為0.2-0.5vvm，培養(yǎng)時間為 30-50h，轉(zhuǎn)速為 200rpm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的谷氨酸棒桿菌固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，在厭氧發(fā)酵培養(yǎng)過程中通過添加6M NH3 ? H2O將pH值控制在7-8。
【文檔編號】C12N11/12GK103642854SQ201310643230
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】應(yīng)漢杰, 施欣馳, 陳勇, 吳菁嵐, 陳曉春, 莊偉 , 朱晨杰, 謝婧婧 申請人:南京工業(yè)大學(xué)