檢測大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的方法及其專用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測大豆過敏蛋白Gly?m?Bd?28K的方法及其專用引物，所述專用引物是由SEQIDNO.5與SEQIDNO.6所示的核苷酸序列組成的引物對。使用所述引物對對待測大豆基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中只含有277bp條帶，為含有GlymBd28K的純合體品種，同時(shí)含有277bp和251bp條帶，為含有GlymBd28K的雜合體品種，只含有251bp條帶，為缺失GlymBd28K的純合體品種。本發(fā)明的專用引物和檢測方法為GlymBd28K過敏蛋白缺失大豆資源的篩選及新品種選育奠定了基礎(chǔ)，能夠在大豆育種、選種及GlymBd28K缺失機(jī)理的研究中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】檢測大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的方法及其專用引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及一種大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K檢測專用引物，以及利用該引物檢測大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卞豆{Glycine max (L.) Merri)是原產(chǎn)我國的重要經(jīng)濟(jì)作物,大豆籽粒蛋白含量約為40%左右，富含人體必需的8種氨基酸。但是，大豆是主要的食物過敏原之一，食物過敏性檢測表明，有14.10%的人對大豆過敏，僅次于對蛋清的反應(yīng)(26.17%)。大豆約含有17種過敏蛋白，其中3種是主要的過敏原，分別命名為Gly m Bd 28K，Gly m Bd 30K和Gly mBd 60K，都存在于7S球蛋白組分中。大豆過敏蛋白28K(Gly m Bd 28K)屬醣蛋白類，最初從豆奶中分離，是大豆球蛋白的微量組分。Gly m Bd 28K過敏蛋白與過敏病人血清抗體結(jié)合位點(diǎn)是一個糖基化位點(diǎn)，位于多肽的第20個氨基酸即天冬酰胺殘基上。對多種植物的抗原識別位點(diǎn)研究顯示，類似于Gly m Bd 28K的N-連接的糖基化位點(diǎn)，可能是多數(shù)植物食用過敏蛋白的一個普遍抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0003]Hiemori等發(fā)現(xiàn)，大豆過敏病人的IgE抗體識別位于肽骨架第20位天冬酰胺連接的N-連接聚糖。進(jìn)一步分析28K抗原表面，發(fā)現(xiàn)其主要的線性C-末端IgE結(jié)合的抗原表面位于S256和A270之間。用丙氨酸掃描技術(shù)研究抗原結(jié)構(gòu)域染色質(zhì)伸展活性，定位了五個IgE結(jié)合貢獻(xiàn)最大的氨基酸殘基Y260、D261、D262、K264和D266。
[0004]Gly m Bd 28K單體的分子量為26kDa，推測含220個氨基酸殘基。免疫篩選大豆種子成熟中期cDNA文庫，得到了該蛋白的全長cDNA。該cDNA克隆全長1567bp，包含一個1419bp的開放閱讀框和148bp 3'-非翻譯區(qū)域，連有多聚腺苷酸尾巴。cDNA開放閱讀框編碼一個含473個氨基酸殘基的多肽，其中包括N末端長度為21個氨基酸殘基的信號肽，隨后的多肽部分在加工成熟過程 中被剪切成兩個完整的蛋白，分別為含220個氨基酸殘基的Gly m Bd 28K和含232個氨基酸殘基的Gly m Bd 23K。Gly m Bd 23K蛋白被進(jìn)一步證實(shí)為新的過敏原。
[0005]由此看來，Gly m Bd 28K是以蛋白前體的形式生物合成的，這與它的同源蛋白南瓜種子蛋白儲藏液泡(PSV)中的MP27/MP32蛋白加工成熟過程一致。MP27/MP32的蛋白前體依次由疏水的信號肽、MP27及MP32組成。MP27和MP32間的切割位點(diǎn)位于羧基末端第278位天冬氨酸處，在子葉發(fā)育過程中切除信號肽，并在液泡中的蛋白酶作用下加工成MP27和MP32兩種蛋白。
[0006]Gly m Bd 28K在大豆品種中存在天然缺失。Takahashi從日本栽培大豆品種中篩選到80%的缺失種質(zhì)，關(guān)榮霞等檢測發(fā)現(xiàn)，44%中國栽培大豆品種缺失Gly m Bd 28K過敏蛋白，吳永美等對中國大豆種質(zhì)資源庫中250份微核心種質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)，Gly m Bd 28K缺失比例為33.7%。大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K缺失的檢測為Gly m Bd 28K缺失育種和利用創(chuàng)造了條件。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于去除Gly m Bd 28K的研究較少，尚無關(guān)于28K缺失性狀、缺失機(jī)制的報(bào)道。[0007]Gly m Bd 28K缺失性狀的分析受到植物發(fā)育時(shí)期的影響。目前對Gly m Bd 28K的檢測依賴于日本所提供的單克隆抗體mbA-C5，其檢測的唯一方法是利用單克隆抗體做蛋白免疫雜交。由于單克隆抗體mbA-C5目前還沒有商業(yè)化，制作抗體費(fèi)時(shí)費(fèi)力，要求的技術(shù)含量也比較高，對育種家是可望而不可及的事情。同時(shí)，免疫雜交步驟也比較復(fù)雜，需要昂貴的雜交儀器，一次做樣品的數(shù)量有限，雜交時(shí)間也比較長，做一批樣品需要兩天的時(shí)間。此外，Gly m Bd 28K屬于種子儲藏蛋白，在大豆開花后14天開始在種子中積累，開花后49天積累到最多，所以檢測Gly m Bd 28K的組織必須取自成熟種子，檢測受到試劑、時(shí)期的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的之一是提供一種可用于檢測大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的專用引物。
[0009]本發(fā)明所提供的用于檢測大豆Gly m Bd 28K過敏蛋白的專用引物是由SEQ IDN0.5所示的核苷酸序列與SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列組成的引物對。
[0010]本發(fā)明將由SEQ ID N0.5與SEQ ID N0.6的核苷酸序列組成的引物對命名為W28K-10，其中SEQ ID N0.5的核苷酸序列由以下20個堿基組成:CCAAGAGACAGCCCCTCTTA，SEQ ID N0.6的核苷酸序列由以下20個堿基組成:CCCTGCAACCAAITTCAAAC。
[0011]本發(fā)明的目的之二是提供一種檢測大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的方法。
[0012]本發(fā)明提供的大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的檢測方法是以來自葉片或種子的待測大豆基因組DNA為模板，使用由SEQ ID N0.5與SEQ ID N0.6的核苷酸序列組成的引物對，對待測大豆基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中有無277bp1和251bp大小的條帶。
[0013]如果擴(kuò)增產(chǎn)物中只含有277bp大小的條帶，則說明待測大豆為含有大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的純合體品種。
[0014]如果擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有277bp和251bp大小的條帶，則說明待測大豆為含有大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的雜合體品種。
[0015]如果擴(kuò)增產(chǎn)物中只含有251bp大小的條帶，則說明待測大豆為缺失大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的純合體品種。
[0016]本發(fā)明所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系以總體積20ii L計(jì)，其組成包括:模板DNA40ng, Taq 酶 IU，上、下游引物各 150pmol/L, dNTPs 150Mmol/L, 10XPCR 緩沖液 2 y L，MgCl2 1.5mmol/L，用重蒸水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20iiL。其中，10XPCR緩沖液的組成是Tris-HCl(pH8.3)100mmol/L, KCl 500mmol/L, MgCl2 15mmol/L。
[0017]所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?先94°C預(yù)變性5min ;然后94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72°C延伸5min ;4°C保存。
[0018]對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯色。具體方法為:取20ML擴(kuò)增產(chǎn)物，加入6uL變性載樣指示劑(98%無離子甲酰胺，IOmM EDTA pH8.0,0.1%溴酚藍(lán)和0.1% 二甲苯青)，94°C變性5min后，立即放入冰水混合物中冷卻5~lOmin，每份變性擴(kuò)增樣品6 y L，在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染顯色。檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有277bp和25Ibp大小的條帶。[0019]本發(fā)明提供了一種大豆Gly m Bd 28K過敏蛋白基因的分子標(biāo)記W28K-10，該標(biāo)記為可遺傳并可以檢測的DNA序列。用該標(biāo)記進(jìn)行大豆Gly m Bd 28K過敏蛋白基因檢測，檢測靈敏度高，檢測時(shí)期靈活，可以對不同發(fā)育時(shí)期的個體，對任何組織的DNA進(jìn)行快速檢測，并具有檢測成本低，方便快捷的特點(diǎn)。
[0020]本發(fā)明通過提供分子標(biāo)記W28K-10，將蛋白檢測轉(zhuǎn)化為DNA分子水平的檢測，簡化了步驟，而DNA的提取和檢測對于分子育種家和傳統(tǒng)育種家來說都是一種簡便可行的方法。
[0021]本發(fā)明提供的檢測方法的一個明顯優(yōu)點(diǎn)是可以有效檢測出Gly m Bd 28K純合體及雜合體品種?，F(xiàn)行的分析免疫雜交檢測是顯性標(biāo)記，因而無法區(qū)分雜合體，只能按有無條帶進(jìn)行分析，記錄為0/1，由于基因轉(zhuǎn)錄水平的差別，含有過敏蛋白的雜合子有可能被檢測為蛋白缺失品種。與蛋白檢測相比較，本發(fā)明分子標(biāo)記是基于序列的差異，不受環(huán)境及基因表達(dá)與否的限制，是一種共顯性標(biāo)記，能區(qū)分雜合體，即二倍體或多倍體染色體DNA上的不同變異都能顯現(xiàn)出來，不僅可采用0/1記錄，也可按擴(kuò)增產(chǎn)物的長度(bp)進(jìn)行記錄和分析，在揭示遺傳多樣性方面要比蛋白免疫雜交具有更大的優(yōu)勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明方法對過敏蛋白的檢測更靈敏、更準(zhǔn)確。
[0022]本發(fā)明的大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K檢測方法為Gly m Bd 28K過敏蛋白缺失大豆資源的篩選及新品種選育奠定了基礎(chǔ)，本發(fā)明的檢測方法及其專用引物，能夠在大豆育種、選種及Gly m Bd 28K缺失機(jī)理的研究中發(fā)揮重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1 SDS-PAGE分離大豆蛋白組分(A)及Gly m Bd 28K單克隆免疫檢測⑶結(jié)果。
[0024]圖中:M:分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，1:早熟18，2:鐵豐22號，3:臺灣75，4:灰布支黑豆。
[0025]圖2雜交組合親本單克隆免疫檢測圖(以早熟18為含有Gly m Bd 28K過敏蛋白的對照品種CKl，臺灣75為缺失Gly m Bd 28K過敏蛋白的對照品種CK2)。
[0026]圖中:1:徐豆26，2:早熟18,3:科豐4號，4:汾旱8號，5:浙春2號，6:中農(nóng)食_1，7:徐豆21,8:灰布支黑豆，9 =95-5383,10:1158-2,11:文豐7，12:周豆672，13:擊頭選黑豆。
[0027]圖3早熟18X汾旱8號部分樣品大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K單克隆免疫檢測圖。
[0028]圖中:P1:早熟18，P2:臺灣75，1-13:早熟18X汾旱8號F2: 3。
[0029]圖4早熟18,臺灣75 Gly m Bd 28K序列及Gly m Bd 28K cDNA序列比對圖。
[0030]圖5早熟18X汾旱8號部分樣品種子DNA在分子標(biāo)記W28K-10作用下的檢測圖。
[0031]圖中:P1:早熟18，P2:臺灣75，1-13:早熟18X汾旱8號F2: 3。
[0032]圖6文豐7 X科豐14親本及雜交組合F2: 3雜交群體部分樣品葉片DNA在分子標(biāo)記W28K-10作用下的檢測圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合具體實(shí)施例·對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0034]下述實(shí)施例中，所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有引物合成均由大連寶生物(TaKaRa)公司或上海生工完成。大豆材料均購自于國家種質(zhì)資源庫。
[0035]實(shí)施例1:大豆Gly m Bd 28K過敏蛋白缺失的遺傳分析。
[0036]大豆材料:大豆資源庫中86份微核心種質(zhì)單粒種子，早熟18X汾旱8號的F2和F2 ； 3代群體單粒種子。F2和F2 ； 3用于大豆Gly m Bd 28K過敏蛋白缺失的遺傳分析。
[0037]用下述方法對大豆材料進(jìn)行免疫雜交檢測。
[0038]將待測大豆種子用小刀在反胚方向刻50mg豆粉，取30mg豆粉裝入1.5mL離心管，用于粗蛋白提取，剩余20mg 粉裝入1.5mL尚心管，待用于DNA提取。
[0039]SDS-PAGE分離大豆蛋白組分:7S伴球蛋白的a (76-57KD)、a ' (83-57KD)和3亞基(53-42KD)，IIS球蛋白的酸性(A) (34，8-45KD)和堿性(B) (21KD)亞基。具體方法為:稱取待測豆粉(用種子研磨制成)5mg，加500ML pH8.0蛋白提取液(0.05mol/LTris,0.2%SDS、5mol/L Urea)和 IOML 巰基乙醇，用渦旋儀振蕩 20min，4°C靜置 2h，1000rpm離心2min，取上清液6ML進(jìn)行SDS_PAGE(10.5%分離膠、10.5%濃縮膠)電泳，蛋白在濃縮膠電泳時(shí)，恒壓100V，待指示劑進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至150V，電泳3~4h(膠大小1 BmmX 1 BmmX 1mm)。
[0040]SDS-PAGE 電泳后，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液(0.lmol/L Tris,0.192mol/L Glycine、20%Methanol)，溫和搖動15min ;在蛋白轉(zhuǎn)移儀上疊鋪2張濕濾紙(用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡)，濾紙上再鋪I張PVDF膜(Immobilon-P，Millipore) (PVDF膜先用甲醇浸泡10s，再放入轉(zhuǎn)膜緩沖液，浸泡20min 備用)，膜上鋪凝膠，凝膠上再鋪2張濕濾紙；恒流200mA，電泳2h。然后參考 Samoto 和 Tsuji 等人方法(Samoto M, Fukuda Y，Takahashi K，Taruchi K，Hiemori M, Tsuji H， Ogawa T, Kawamura Y.Substantially complete removal of threemajor allergenic soybean proteins (Gly mBd 30K, Gly mBd 28K, and the a -subunitof旦-conglycinin) from soy protein by using a mutant soybean, Tohoku 124.Biosci Biotech Biochem, 1997，61(12): 2148-2150.)，用小鼠單克隆抗體 Gly m Bd28k(mbA-C5)(日本作物研究所旱田作物研究部豆類育種研究室提供)檢測Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K過敏蛋白。
[0041]SDS-PAGE分離大豆蛋白組分及Gly m Bd 28K單克隆免疫檢測結(jié)果見圖1。M為分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，I為早熟18，2為鐵豐22號，3為臺灣75，4為灰布支黑豆。對這些品種種子各隨機(jī)選取10個單粒進(jìn)行過敏蛋白Gly m Bd 28K免疫雜交檢測后，選早熟18為含有Gly m Bd 28K過敏蛋白的對照品種，臺灣75為缺失過敏蛋白Gly m Bd 28K對照品種。用SDS-PAGE分離大豆蛋白組分，Gly m Bd 28K單克隆免疫檢測方法對國家大豆種質(zhì)資源庫中86份微核心種質(zhì)進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2，表中附有品種名稱及統(tǒng)編號。
[0042]對雜交組合親本進(jìn)行免疫雜交檢測，結(jié)果如圖2所示。同樣對雜交組合親本單粒進(jìn)行了過敏蛋白Gly m Bd 28K免疫雜交檢測。選取早熟18 (含有過敏蛋白Gly m Bd 28K的純合體品種)及汾旱8號(缺失大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的純合體品種)為雜交親本，對雜交群體F2和F2: 3群體進(jìn)行免疫雜交檢測，F(xiàn)2: 3部分樣品檢測結(jié)果見圖3所示，4、
7、13號植株均為缺失。根據(jù)免疫雜交檢測結(jié)果進(jìn)行遺傳分析，Gly m Bd 28K基因的分離比例符合3: 1，表明Gly m Bd 28K基因的缺失是由I對隱性基因控制遺傳的，結(jié)果如表1所
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【權(quán)利要求】
1.一種檢測大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的專用引物，是由SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列與SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列組成的引物對。
2.一種檢測大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的方法，是以來自葉片或種子的待測大豆基因組DNA為模板，使用由SEQ ID N0.5與SEQ ID N0.6的核苷酸序列組成的引物對，對待測大豆基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中有無277bp和251bp大小的條帶； 如果擴(kuò)增產(chǎn)物中只含有277bp大小的條帶，則說明待測大豆為含有大豆過敏蛋白Gly mBd 28K的純合體品種； 如果擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有277bp和251bp大小的條帶，則說明待測大豆為含有大豆過敏蛋白Gly m Bd 28K的雜合體品種； 如果擴(kuò)增產(chǎn)物中只含有251bp大小的條帶，則說明待測大豆為缺失大豆過敏蛋白Gly mBd 28K的純合體品種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測大豆過敏蛋白Glym Bd 28K的方法，其中所述待測大豆基因組DNA來自大豆葉片或種子。
4.權(quán)利要求1檢測大 豆過敏蛋白Glym Bd 28K的專用引物在Gly m Bd 28K過敏蛋白缺失大豆資源篩選上的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK103667471SQ201310643201
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】吳永美, 邱麗娟, 關(guān)榮霞, 李潤植 申請人:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)